一种载GPP‑siRNA牙科种植体的制备方法与流程

本发明属于牙科种植体材料领域，特别涉及一种载gpp-sirna牙科种植体的制备方法。

背景技术：

钛种植体在牙科使用广泛，成功率高。但是，系统性骨疾病(如骨质疏松)患者仍存在骨形成能力弱、骨结合不良等现象，增加了种植失败的风险，甚至会造成种植体脱落导致种植的失败，限制了其应用。

表面处理是提高种植体骨结合的有效途径。针对种植体表面处理的研究主要包括两个方面：一方面，表面形貌修饰如表面形貌纳米化等能够影响骨形成。另一方面，表面生物修饰如加载生物因子实现表面功能化。细胞外基质蛋白、生长因子、sirna、mirna等都可作为生物因子加载于种植体表面，对体内外骨结合发挥促进作用。

rna干扰(rnai)技术能够特异性的调控目标基因，具有靶向、特异及高效性。sirna与mirna因其本身有良好的药代动力学特性，可以作用于全身多个组织器官，同时具有高度特异性、固有生物学效应和良好的基因沉默效率，在疾病治疗过程中，针对相应的疾病，引入外源性的特定sirna/mirna，使其转染进入特定组织器官，到达细胞指定部位发挥作用，结合并降解相应mrna，使疾病相关基因沉默，从而达到治疗疾病的效果。rnai可应用于多种骨组织类型的治疗，主要是骨和软骨。以往研究中，已发现多种可以促进成骨的sirna与mirna，如mir-29a、mir-31、sirancl、sicki-1等应用于种植体表面修饰促进骨形成。

sirna/mirna能否发挥作用，很大程度上依赖于能够有效地将其传递至目标细胞和目标部位的基因传递系统，即安全有效的基因载体。基因载体主要包括病毒基因载体和非病毒基因载体。非病毒性基因载体有着低成本、低免疫原性、非传染性、良好的依从性和临床重复应用等一系列潜在的优势，使基因载体的良好选择。非病毒载体主要有脂质体、壳聚糖、聚乙烯亚胺等。这些非病毒载体应用广泛，但在应用于种植体表面基因加载则有各自的缺陷。脂质体加载不易，壳聚糖转染效率有限，聚乙烯亚胺细胞毒性较高。因此，选择一种容易加载，转染效率高，细胞毒性小的基因载体十分重要。

近年来、石墨烯及其衍生物在生物传感器、抗菌、药物输送、基因转染及光热治疗等方面取得了突破性进展。在骨形成方面，氧化石墨烯及其衍生物加载于材料表面能够改变材料表面理化性质，在成骨诱导液环境中，表现出一定的对骨形成的促进作用。应用于基因载体时，氧化石墨烯go表面双功能化的修饰上两个不同类型的聚合物---pei(聚乙烯亚胺)和peg(聚乙二醇)，pei用于结合核酸分子而peg用于增强生理环境中的稳定性。该双聚合物功能化的氧化石墨烯即gpp(ngo-peg-pei)在进行细胞转染时，展现出免于血清干扰，转染效率提高的良好特性，是良好的基因载体的选择。

技术实现要素：

本发明主要针对现有技术中sirna和载体形成复合物后在种植体表面sirna加载量较少、加载量可控性低、载体转染效率不高等缺陷，其目的在于提供一种载gpp-sirna牙科种植体的制备方法，能够在保证纳米管形貌不受影响的情况下，高效的加载sirna，使其在种植体表面发挥高效的rna干扰作用促进种植体骨结合。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是，一种载gpp-sirna牙科种植体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，选用纯钛或者钛合金加工成种植体基体，再将种植体基体表面抛光后，超声清洗后吹干，得到纯钛或者钛合金牙科种植体；

步骤2，采用hf溶液阳极氧化的方法在步骤1得到的种植体表面制备二氧化钛纳米管阵列，超声清洗后干燥，得到二氧化钛纳米管种植体；

步骤3，将gpp溶液与sirna按合适比例混合形成gpp-sirna混合物溶液；

步骤4，采用阴极电沉积工艺制备载gpp-sirna的二氧化钛纳米管种植体：阴极为步骤2中制备的二氧化钛纳米管种植体，阳极为铂片，电解液为步骤3中得到的gpp-sirna混合物溶液，用直流电源通电，可将gpp-sirna混合物沉积到二氧化钛纳米管种植体表面，获得二氧化钛纳米管载gpp-sirna的牙科种植体。

步骤1所述钛合金为ti-zr-sn-mo-nb合金，其中ti、zr、sn、mo和nb的原子摩尔比为72:5:3:5:15。

步骤1中的超声清洗依次用丙酮、无水乙醇和去离子水进行，每次清洗15分钟。

步骤2阳极氧化过程中，阳极为步骤1中抛光清洗后得到的纯钛或者钛合金牙科种植体，阴极为石墨，电解液为hf与去离子水的混合溶液，其中hf体积分数0.5％，用直流电源通电，直流电压为20v，通电时间为1小时，两极距离6-8厘米，反应温度为室温。

步骤2中，种植体表面纳米管制备完成后，用丙酮、无水乙醇和去离子水依次进行超声清洗，每次清洗3～5分钟，室温干燥24h，得到二氧化碳纳米管种植体。

步骤3中gpp浓度为1mg/ml，sirna浓度为20μm，n/p摩尔比为40:1。

步骤4中直流电压为5-10v，通电时间为3-5分钟，两极距离1厘米，反应温度为室温，即可在二氧化钛纳米管种植体表面加载gpp-sirna。

与现有技术相比，本发明采用gpp作为基因载体，应用于种植体表面修饰，具有以下优点及有益效果：

本发明中应用gpp作为sirna的基因载体，具有加载量大、转染效率高、毒性小的优点，由于该复合物表面大量氨基基团的存在，使复合物表现出强正电性，有利于其与负电性的sirna通过静电作用结合，sirna加载量大。相比于现有种植体表面基因转染常采用的商品化lipofectamine2000，gpp基因载体具有更高的转染效率。此外，相比慢病毒、单纯的pei基因载体，gpp作为基因载体生物相容性好，细胞毒性低。

本发明将gpp基因载体应用于二氧化钛纳米管种植体表面，有利于加载和释放。gpp基因载体粒径小(约为60nm)，使其不仅能分布于种植体表面，还能够进入纳米管管状结构(管径约100nm)内部，一方面提高了sirna的加载量，另一方面，能够实现sirna的缓释。克服了以往冻干法、静电吸附加载法加载量低、sirna短时间内释放迅速的问题。

本发明中，gpp的修饰，改变了二氧化钛纳米管种植体的表面形貌、粗糙度、亲水性等表面理化参数，进一步影响后续的体内外生物学效应。能够在一定程度上影响细胞的粘附增殖及体内外成骨分化。因此，能够与促成骨sirna如sickip-1发挥协同促进作用，适宜于应用于种植体表面修饰。

本发明采用阴极电沉积技术将gpp-sirna混合物加载到二氧化钛纳米管表面，能够通过调节电压、时间等参数，实现sirna加载量的调控。不受种植体形状的限制，可以在其复杂的表面上实现gpp-sirna混合物的均匀分布结合。

本发明采用gpp作为种植体表面的基因载体，基因加载量大、加载量可精细调控、载体转染效率高。成本低、方法具有明显的优势，便于大规模推广。

附图说明

图1为发明过程示意图。

图2为为实施例1制备的牙科种植体二氧化碳纳米管形貌的扫描电镜(sem)照片图，其中图2a为未载gpp-sirna的二氧化碳纳米管形貌图；图2b为载gpp-sirna的二氧化碳纳米管形貌图，nt表示二氧化钛纳米管。

图3为实施例1制备的牙科种植体二氧化碳纳米管形貌载gpp-sirna后的激光共聚焦图，其中红色为cy-3标记的sirna。

图4为实施例1制备的牙科种植体二氧化碳纳米管形貌载gpp-sirna后，在pbs溶液中sirna的释放曲线。

图5为实施例1制备的牙科种植体二氧化碳纳米管形貌载gpp-sirna后接种细胞后的24h激光共聚焦图，红色为cy-3标记的sirna，蓝色为dapi染色的细胞核。

图6为实施例1制备的二氧化钛纳米管种植体表面加载gpp-sickip-1复合物后对靶基因沉默的检测，sickip-1：针对ckip-1的sirna；sinc表示sirna的阴性对照。

图7实施例1制备的牙科种植体二氧化碳纳米管种植体加载gpp-sickip-1复合物前后的表面粗糙度测量结果，sa为平均粗糙度，sz表示表面最大高度。

图8为实施例1制备的二氧化钛纳米管种植体表面加载gp-sickip-1复合物后种植体表面的成骨相关基因表达情况，alp为碱性磷酸酶、col-1为i型胶原、ocn表示骨钙素，runx2为转录因子2。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1，如图1所示，一种载gpp-sirna牙科种植体的制备方法，gpp指的是peg(聚乙二醇)和pei(聚乙烯亚胺)共同修饰的go(氧化石墨烯)，本发明包括以下步骤：

1)选用西北有色金属院提供的纯钛加工成牙科种植体；

2)牙科种植体表面抛光后，依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗，每个阶段均清洗15分钟，吹干待用；

3)配制阳极氧化电解液：去离子水为溶剂，hf(氢氟酸溶液)所占体积比为0.5％；

4)阳极氧化法制备二氧化钛纳米管：抛光清洗后的牙科种植体作为阳极，铂片或者石墨作为阴极，放入前一步骤配制的阳极氧化电解液内，具体阳极氧化参数为：直流电压为20v，通电时间为1小时，两极距离3-8厘米，反应温度为室温(25°)；

5)种植体表面纳米管制备完成后，用丙酮、无水乙醇和去离子水依次清洗，各清洗3～5分钟，室温干燥24h，得到二氧化碳纳米管种植体；

6)将1mg/ml的gpp溶液和具有成骨作用的ckip-1sirna(20μm)溶液按n/p摩尔比为40:1混合，混合后室温搅拌20min使其充分混匀后，置于电沉积容器中；

7)阴极电沉积法加载gpp-sirna：阳极为铂片，阴极为二氧化钛纳米管种植体，电解液为gpp-sirna混合物溶液，用直流电源通电，电压为10v，通电时间为3～5分钟，两极距离1厘米，反应温度为室温(25°)，即可在二氧化钛纳米管种植体表面加载gpp-sirna。

图2为制备的二氧化钛纳米管种植体nt(图2a)及其表面加载gpp-sirna后(图2b)的扫描电镜图。由2a可见，二氧化钛纳米管种植体表面均匀分部管径约为100nm的纳米管状结构。电沉积反应加载gpp-sirna后，图2b显示，在二氧化钛纳米管种植体表面均匀覆盖了gpp-sirna复合物。

图3为种植体二氧化钛纳米管表面加载sirna后形貌的激光共聚焦照片，其中红色为cy-3标记的sirna，从图中可以看出经阴极电沉积加载后，二氧化钛种植体表面的确为sirna的沉积。

对nt/gpp-sirna种植体表面sirna的释放进行测定，即可得到图4结果，sirna在最初两天释放较快，在随后的时间里，释放速率减慢，直到15天左右全部释放。说明nt/gpp-sirna种植体在pbs溶液中较为稳定，能够实现sirna的缓慢释放。

在制备的nt/gpp-sirna种植体表面进行mc-3t3细胞培养，两天后激光共聚焦观察sirna转染入胞情况，得到图5所示结果，cy-3红色荧光显示sirna高效转染入胞，围绕在dapi蓝染的细胞核周围，说明nt/gpp-sirna有良好的基因转染能力。

对所制备的材料nt/gpp-sickip-1进行靶基因(ckip-1)表达的实时定量pcr试验，得到图6所示结果。在转染3天后，相对于对照组nt/gpp-sinc，nt/gpp-sickip-1组ckip-1mrna水平显著下调(约72％)，说明电沉积形成的nt/gpp-sirna种植体能够对靶基因实现有效地沉默。

分析二氧化碳纳米管种植体加载gpp-sirna复合物前后的表面粗糙度，得到图7显示结果，与二氧化钛纳米管种植体nt相比，加载gpp-sickip-1后，提高了二氧化钛纳米管种植体表面粗糙度(ra)和材料表面高度(rz)，改变了材料表面性质。

图8为nt/gpp-sickip-1种植体表面的成骨相关基因alp、col-1、ocn及runx2表达情况的pcr检测结果，半定量结果显示，相比于对照组nt/gpp-sinc，nt/gpp-sickip-1种植体能够有效地提高材料表面成骨相关基因alp、col-1、ocn及runx2的表达，表现出良好的促进种植体表面成骨分化的效果。