菟丝子多糖的新用途的制作方法

本发明属于药物领域，具体是涉及菟丝子多糖的新用途。

背景技术：

膝关节骨性关节炎(kneeosteoarthritis，koa)简称膝骨关节炎，是在活动关节上发生的一种慢性、进行性疾病，以关节基质崩解、软骨细胞的明显减少为主要特性的疾病。膝关节骨性关节炎又称为膝关节增生性关节炎、退行性关节炎、肥大性关节炎、退行性骨关节病等，是一种多发的慢性进行性骨关节疾病,为骨科临床常见病。该病以膝关节软骨的退行性变为主要病理特征。近年来随着世界老龄化人口的日益增加,膝关节骨关节炎的发病率在全球范围内都呈现出逐年上升的趋势。联合国业已宣布2000～2010年是骨与关节的十年，以提请人们注意骨关节疾病对世界健康的影响。现有研究表明其病理特征改变为关节软骨组织发生进行性退变、消失，关节边缘骨赘形成和软骨下骨质反应性改变，并且退变的速度超过修复及再生的速度。临床表现以进行性、慢性发展的关节肿痛、僵硬、活动受限为主，x线拍片提示膝关节骨刺形成。如何更好地治疗膝关节骨关节炎，已经成为摆在各国骨科学界面前的重要课题。

膝关节骨性关节炎病因及发病机理尚未完全阐明。现代医学研究多认为膝关节骨关节炎发病因素及机制主要与年龄、遗传、损伤、过度负重、肥胖、环境、骨密度骨量、生物力学改变等有关。

迄今还没有一种治疗方法能完全阻断膝关节骨关节炎病理进展过程，因此，目前的治疗主要是止痛和改善功能，比如，曲马多、奇曼丁等对轻、中度膝关节疼痛的镇痛效果较好。

技术实现要素：

本发明的技术方案是提供菟丝子多糖的新用途，还提供了一种新的治疗膝关节骨关节炎的药物。

本发明菟丝子多糖在制备治疗骨关节炎的药物或保健食品中的用途。

其中，所述的菟丝子是旋花科植物南方菟丝子cuscutaaustralisr.br.或菟丝子cuscutachinensislam.的干燥成熟种子。

其中，所述菟丝子多糖按照如下方法制备：

取菟丝子粉末，乙醇提取，得药渣，水提取，加乙醇醇沉，冷冻干燥，粉碎，加水溶解，采用sevage试剂去除蛋白，收集水相，离心，减压浓缩，冷冻干燥，回收药物。

优选地，所述乙醇提取时，乙醇的浓度为85％，提取的方式是回流提取；优选地，乙醇提取时，提物的次数为2次，第一次提取使用8倍量的乙醇，第2次提取使用6倍量的乙醇。

优选地，水提取的方式是煎煮，煎煮2次，第一次用10倍量水提取1.5小时，第二次8倍水提取1小时；或，乙醇醇沉时，加乙醇至乙醇的浓度为80％。

优选地，采用sevage试剂去除蛋白的方式是：加入sevage试剂，加入量为水溶液的1/4，振摇30min后，离心，重复5次，其中，所述sevage试剂为氯仿与正丁醇的混合溶液，二者的体积比为4:1

其中，所述药物是治疗膝关节骨关节炎的药物。

本发明还提供了一种治疗膝关节骨关节炎的药物，它是以菟丝子多糖为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。

其中，所述菟丝子多糖按照如下方法制备：

取菟丝子粉末，乙醇提取，得药渣，水提取，加乙醇醇沉，冷冻干燥，粉碎，加水溶解，采用sevage试剂去除蛋白，收集水相，离心，减压浓缩，冷冻干燥，回收药物。

优选地，所述乙醇提取时，乙醇的浓度为85％，提取的方式是回流提取；优选地，乙醇提取时，提物的次数为2次，第一次提取使用8倍量的乙醇，第2次提取使用6倍量的乙醇；

或，水提取的方式是煎煮，煎煮2次，第一次用10倍量水提取1.5小时，第二次8倍水提取1小时；

或，乙醇醇沉时，加乙醇至乙醇的浓度为80％；

或，采用sevage试剂去除蛋白的方式是：加入sevage试剂，加入量为水溶液的1/4，振摇30min后，离心，重复5次，其中，所述sevage试剂为氯仿和正丁醇的混合溶液，二者的体积比为4:1。

本发明菟丝子多糖具有良好的治疗膝关节骨关节炎作用，为临床提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

附图说明

图1给药结束后各组大鼠x片(红色方块遮挡为左后肢)；

图2实验二关节标本大体相；

图3实验二光镜下对关节软骨组织he染色病理图(标尺100μm)。

具体实施方式

实验例1菟丝子多糖膝关节骨关节炎的作用

1材料与仪器

实验器械及耗材

手术刀片、眼科剪、无齿镊、手术剪、血管钳、无菌手套、口罩、纱布、滤纸、一次性手术巾、棉球、碘伏、1ml无菌注射器、5ml无菌注射器、电子分析天平(德国satorious公司)、包埋盒、切片盒、载玻片、盖玻片、

药品及试剂

木瓜蛋白酶(papain)：批号：lot9909，规格：25g/瓶，活力≥800u/mg，美国sigma公司生产。

菟丝子总多糖(scps)：菟丝子碎粗粉，85％乙醇回流提取2次，第一次8倍量提取1.5小时，滤过，第二次6倍量提取1小时，滤过，得药渣，用水煎煮2次，第一次用10倍量水提取1.5小时，第二次8倍水提取1小时，分别用200目纱布滤过，合并两次滤液，将滤液浓缩至0.25g生药/ml，加乙醇使含醇量达到80％，4℃下静置48h，滤过，收集沉淀，冷冻干燥，粉碎，全部过四号筛，备用。将粉末用水复溶，与sevage试剂(氯仿-正丁醇＝4:1)体积比为4:1充分振摇30min后，离心，将水相和氯仿相分开，将水相加入相当于其体积1/4的sevage溶液中，重复上述步骤，5次。收集水相，减压浓缩，冷冻干燥，每1g生药可以制得0.0789-0.1140g菟丝子总多糖。

盐酸氨基葡萄糖胶囊(glucosaminehydrochloridecapsules，ghc)：中文商品名：奥泰灵；批号：1509213，规格0.75g/粒，香港奥美制药厂生产。

余略。

主要设备及仪器

buckydiagnostfs飞利浦(中国)投资有限公司；转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；tsj-ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；bmj-ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；phy-ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；yh-200dhultrasoniccleaning超声波震荡器(上海予皓科学仪器有限公司)；s400sevenexcellenceph/mv测量仪(瑞士mettler-toledo公司)；数码三目摄像显微镜(ba400digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；图像分析软件moticimagesadvanced。

主要试剂的配制：

木瓜蛋白酶溶液配制

精密称取2.0gnaci，0.05gnaoh，0.179gna2hpo4和0.12gkh2po4溶解在40ml双蒸水中，加入naoh调节ph至8.0，加入37.2mgedta2na，震荡溶解，再加入木瓜蛋白酶2g溶解，测量液体ph值后，加入hci调整ph值到6.5，以双蒸水定容至50ml，0.22um过滤除菌，10ml/瓶分装，保存于4℃冰箱备用。一次性配制。

阳性药的配制

取盐酸氨基葡糖糖胶囊8粒，用0.9％生理盐水配置成320ml溶液即得。

scps溶液的配制

精密称取scps3.2701g于研钵中研碎后加入450ml生理盐水，边加边搅拌，使其充分溶解，涡旋振荡仪振荡混匀，用生理盐水定容至500ml，制备成6.54mg/ml的scps溶液。7天配制一次。

饲养动物及饲养条件

健康雄性6周龄sd大鼠，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物许可证号：scxk(川)2015-030。大鼠饲养于国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室(编号：tcm2032043)。大鼠均在室温22～24℃，明暗周期12h/12h条件下饲养，饲料为普通标准大鼠配方饲料，由成都达硕生物科技有限公司提供，饮用水为纯净饮用水，大鼠均自由饮水摄食。

2方法

2.1动物分组、造模和给药方法

标准体重的健康雄性sd大鼠60只，称重后随机分为6组，即空白对照组(c组)、模型对照组(m组)、盐酸氨基葡萄糖胶囊组(ghc组)。每组10只，适应性喂养3d后称重，统计后调平各组之间体重差异后正式造模。除空白对照组外注射等体积生理盐水外，其余各组按照实验一方法造模。根据实验一结果，造模3w后koa模型稳定。故第4w开始进行相应药物干预，每天1次，连续4w。菟丝子药典规定人日用量为6-12g。临床人用量按照12g原生药计算。分组及给药信息如下表：

2.2观察指标

2.2.1体重

第1d、第3d、第1w、第2w、第3w、第4w、第5w、第6w、第7w.测量每只存活动物的体重，记录并调整灌胃量，观察体重变化趋势用于判断大鼠健康状态。

2.2.2关节活动度

第3d、第1w、第2w、第3w、第4w、第5w、第6w、第7w分别量角器测量测定患侧的关节活动度，测量过程在麻醉状态下进行，末次测量在动物处死后进行。具体方法如下：使用棉签定位与工作台边相平行，固定麻醉状态下大鼠的股骨端与之对齐，以同样的力牵拉下肢做外展、内收，遇到轻微抵抗时停止。以胫骨平台中央与踝关节中心连线，测量两种动作时的夹角，即为大鼠膝关节活动度。两名与本课题不相关的实验人员分别读出角度并记录。

2.2.3影像学检测

第7w末次给药后1h，每组随机取3只，麻醉状态下x光检查膝关节形态变化。

2.2.4大体形态及病理学检测(本部分随机取6只进行)

2.2.4.1膝关节关节腔大体形态学观察

末次给药后1h，各组大鼠处死后，切开右侧膝关节，进行关节腔大体形态学观察，并进行大体形态学肉眼评分。评分标准见附表1：

表1大体形态学肉眼评分标准

2.2.4.2膝关节组织病理切片观察

大体形态学观察后，每组随机取6只大鼠患侧膝关节标本进行病理切片的制作和观察。

2.3标本留存

剩余每组4只大鼠，取膝关节关节软骨，关节编号后液氮保存,干冰运输,用于后续rt-pcr和wb实验。

2.4数据分析

采用spss22.0软件进行统计分析，定量资料用均数±标准差表示，样本之间两两比较采用t检验，p＜0.05表示有统计学差异。

结果

3.1实验过程中动物行为及表现的变化情况

3.1.1实验前

所有大鼠在实验前右后膝关节活动能力正常、无肿胀、无畸形，反应灵敏，饮食可，全身状态良好。

3.1.2实验中

实验造模顺利。但在第3w测量关节活动度后大鼠死亡3只，考虑原因：过于频繁的全身麻醉使大鼠对难以耐受，麻醉后核心体温的恢复不能达到满意水平。麻醉当天成都地区气温急剧下降，在大鼠麻醉复苏进入恒温动物房之前缺乏必要的保温措施，大鼠受寒诱发肺部感染死亡。大部分存活大鼠均有肺部感染症状，因此对所有大鼠行10mg庆大霉素肌注，每日一次，连续三天。修改实验方案，取消第4w的原定麻醉。观察大鼠恢复后进行了剩余实验。实验过程中见空白组大鼠精神状态佳，反应较灵敏，施行造模的各组大鼠精神状态良好，出现程度相差不大的右后膝关节膨大肿胀、活动灵敏性差，少数大鼠跛行等。

3.1.3给药后

实验结束对大鼠处死当天的右后膝局部形态、活动灵敏性等变化情况观察如下：

空白对照组：该组大鼠精神状态良好、饮食可，右后膝关节活动正常、无肿胀、无畸形、下肢肌肉未见明显萎缩，下肢活动反应灵敏，与造模前比较无明显差异；

模型组：该组大鼠均出现右后膝骨性膨大，程度较第3w时加重，关节有明显软性肿胀，下肢肌肉较健侧明显萎缩，右下肢活动不灵活，跛行。

ghc组：该组大鼠部分出现右后膝骨性膨大，关节未见明显软性肿胀，下肢肌肉较健侧有萎缩，右下肢活动稍欠灵活，少数大鼠见跛行。

scps组：该组大鼠少部分出现右后膝骨性膨大，关节未见明显软性肿胀，下肢肌肉较健侧未见明显萎缩，右下肢活动稍欠灵活，未见跛行。

3.2关节活动度差值结果

与空白组相比，所有造模组在造模成功后的关节活动度差值增加有明显差异(p＜0.05)，此结果符合造模成功的前期研究，见表2。给药结束后，与模型组相比较，ghc组、scps组的关节活动度差值有明显差异(p＜0.05)，详见表3。

表2造模成功后关节活动度差值比较

注：与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.01

表3给药结束后关节活动度差值比较

注：与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组相比，△p＜0.05，^△△p＜0.013.3关节x片观察结果

影像学显示：空白组在7w后均显示右膝关节间隙正常，无骨硬化和骨质增生形成(见图1-a)；模型组在7w后可见股骨髁及胫骨平台关节面有明显病变，出现关节间隙明显降低，关节变形，似有骨赘形成(见图1-b)；ghc组在7w后可见股骨髁及胫骨平台关节面不光整，软骨下骨区密度增高，关节间隙变窄，有明显退变(见图1-c)；scps组在7w后可见股骨髁及胫骨平台关节面欠光整，软骨下骨区密度增高不明显，关节间隙变窄，退变程度弱于ghc组(见图1-d)。

3.4关节标本大体观察及评分

3.4.1关节标本大体观察及描述

大鼠处死后以膝前正中切口切开，完整取出膝关节，股骨及胫骨两端保留2cm。肉眼所见如下：

空白对照组：关节滑囊完整无增生，关节液无色、透明，关节腔无积液，股骨髁和胫骨平台软骨表面光滑完整，软骨色泽明亮、呈淡黄色、有弹性、表面未见裂纹及软化灶，关节边缘无骨赘形成。(见图2-a)

模型组：关节滑囊增生粘连，关节液呈深黄色且浑浊，关节腔明显积液，关节软骨呈暗灰黄色欠光泽，弹性降低，软骨表面有虫蚀样改变，股骨负重区可见大小不一的圆形软化灶及较细的裂纹，关节边缘未见明显骨赘形成，未见软骨下骨裸露。(见图2-b)

ghc组：关节滑囊粘连不严重，关节液呈深黄色，关节腔无明显积液，关节软骨呈暗灰黄色欠光泽，弹性降低，软骨表面有虫蚀样改变，股骨负重区偶见较细的裂纹、未观察到软化灶，关节边缘未见明显骨赘形成，未见软骨下骨裸露。(见图2-c)

scps组：关节滑囊粘连不严重，关节液清亮透明，关节腔无积液，关节软骨呈黄色欠光泽，弹性降低，软骨表面偶见较细的裂纹、未观察到软化灶及虫蚀样改变，股骨髁部磨损较ghc组较轻。关节边缘未见明显骨赘形成，未见软骨下骨裸露。(见图2-d)

3.4.2关节标本大体评分

关节标本大体评分参照文献标准[21]进行，三名经过培训的人员严格遵循双盲原则进行观察并评分，统计分析结果显示：与空白对照组相比较，模型对照组、ghc组及各实验组大鼠关节大体评分均增高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与模型对照组相比，ghc组及各实验组大鼠关节大体评分均降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。详见表4。

表4关节标本大体评分

注：与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组相比，△p＜0.05，^△△p＜0.01

3.5光镜下对软骨组织病理切片的观察及改良mankin’s评分结果

3.5.1光镜下对软骨组织病理切片的观察

空白对照组：着色均匀,软骨基质染色呈浅粉红色，结构分层清楚，软骨表层光滑平整，软骨细胞分布均匀且饱满，呈近水平样排列，绝大多数潮线清晰完整(图3-a)。

模型组：软骨组织基质染色浅，软骨表层明显变薄甚或消失，局部可见多个软骨细胞聚集，细胞核浓缩，表面广泛碎裂，软骨细胞缺失，大部分可见裂隙深达软骨下骨，潮线破坏，钙化层可见增厚(图3b)。

ghc组：着色欠均匀，关节软骨表层变薄且不规则，部分可见软骨细胞缺失，部分表面可见裂隙存在，局部可见多个软骨细胞聚集，潮线个别完整(图3-c)。

scps组：着色较均匀，关节软骨表层轻度变薄，细胞形态接近于正常，各层界限欠清楚，偶见多个软骨细胞聚集，潮线绝大部分完整，个别不完整(图3-d)。

3.5.2光镜下对软骨组织病理切片行改良mankin’s评分结果

光镜下对软骨组织病理切片行改良mankin’s评分，结果显示：与空白对照组相比，模型组及各治疗组改良mankin’s评分均增高，其差异具有统计学意义(p＜0.05)；与模型组相比，ghc组评分降低但无统计学意义(p＞0.05)，scps组评分降低，其差异有统计学意义(p＜0.05)。详见表5

表5光镜下对软骨组织病理切片行改良mankin’s评分结果

注：*与空白对照组相比p＜0.05；^※与模型组相比p＜0.05；

讨论

4.1实验结果讨论

通过观察记录各组大鼠造模前、造模成功时和实验过程中关节大体形态、活动能力发现：空白对照组大鼠右后膝关节活动及外形正常，右后肢活动反应灵敏；模型组大鼠均出现右后膝骨性膨大、右后肢活动不灵活、跛行等koa典型改变，且随着时间增加程度加重。ghc组、scps组大鼠在给药结束后关节膨大、后肢灵活性、跛行等koa典型表现较造模成功时加重不明显。通过对各组大鼠造模前、造模成功时和实验过程中关节活动度变化值统计分析后发现：与空白组相比，模型组造模后的关节活动度降低且差值有统计学差异，此结果符合造模成功的前期判断。给药结束后，与模型组相比较，各治疗组的关节活动度差值均上升且有统计学意义，代表各治疗组在改善koa关节活动度均有一定作用。

通过对各组大鼠给药结束后患膝x片评价发现：空白对照组关节间隙正常，无骨硬化和骨质增生形成；模型组可见关节间隙明显降低、关节变形、软骨下骨密度增加等koa典型影像学改变；各治疗组均有明显关节退变表现，其中ghc组可见股骨髁及胫骨平台关节面不光整，软骨下骨区密度增高，关节间隙变窄，有明显退变；scps组退变程度弱于ghc组，软骨下骨区密度增高不明显，关节间隙变窄。

通过肉眼观察大鼠解剖后关节软骨大体形态后发现：空白对照组大鼠关节滑囊完整无增生，关节液无色、透明，关节腔无积液，股骨髁和胫骨平台软骨表面光滑完整，软骨色泽明亮、呈淡黄色、有弹性、表面未见裂纹及软化灶，关节边缘无骨赘形成；模型组大鼠关节滑囊增生粘连，关节液呈深黄色且浑浊，关节腔明显积液，关节软骨呈暗灰黄色欠光泽，弹性降低，软骨表面有虫蚀样改变，股骨负重区可见大小不一的圆形软化灶及较细的裂纹，关节边缘未见明显骨赘形成，未见软骨下骨裸露；各治疗组在软骨色泽改变，软骨表面破坏等koa早期大体改变上均有不同程度的减轻，但所有组别肉眼均未看到明确骨赘及软骨下骨裸露，这验证了实验一对造模病理分期的判断。

通过对关节软骨大体评分统计分析发现：模型对照组较空白对照组评分增高且差异有统计学意义，证明造模是成功的；各治疗组较较模型组评分降低且差异均有统计学意义，说明各治疗组对大体修复均有一定作用；各治疗组较空白对照组评分增高且差异均有统计学意义，说明各治疗组对大体修复均未达到造模前正常水平；与ghc组相比，scps组大鼠关节大体评分均降低，且差异均具有统计学意义，说明scps对改善大体评分作用是强于ghc。

通过在光镜下对各组大鼠软骨组织he染色病理切片观察后发现：空白对照组染色清楚均匀，结构分层清楚，软骨表层光滑平整，软骨细胞分布均匀且饱满，绝大多数潮线清晰完整；模型组染色浅，软骨表层明显变薄甚或消失，表面广泛碎裂，软骨细胞缺失，大部分可见裂隙深达软骨下骨，潮线破坏等koa典型病理改变。各治疗组在染色丢失、软骨细胞减少、裂隙、潮线不完整等koa改变均较模型组减轻。

通过对各组大鼠软骨组织病理切片改良mankin’s评分进行统计分析后发现：模型组评分较空白对照组增高且差异有统计学意义，说明在病理层面证实了本次实验造模方式的成功。ghc组评分较模型组降低但无统计学意义，说明在本次实验中氨基葡萄糖修复软骨并未得到病理学的证实。这与本次实验其他指标的结论趋势不相符合，推测与给药周期较短(4周)有关系；scps组评分较模型组降低且差异有统计学意义，说明在本次实验中菟丝子多糖对关节软骨的修复作用在病理层面得到证实，这与本次实验其他指标的结论趋势相符合。

综上，本发明菟丝子多糖可以治疗膝关节骨关节炎，为临床提供了一种新的选择，且制备方法简单，成本低廉，工业应用前景良好。