lncRNAsENST00000607393SiRNA制备治疗青光眼制剂的应用的制作方法

本发明属于涉及分子治疗技术领域，具体涉及一种lncrnasenst00000607393的sirna在制备治疗青光眼制剂上的应用。

背景技术：

青光眼是全球首位不可逆致盲眼病，也是最常见的视神经病变。目前，青光眼的诊断主要是依靠病史、形态学和功能学的改变，主要治疗措施仍是控制眼压。而青光眼相关的血清学筛查、生化检查及检测标准仍处于相对空白状态，因此寻找一种高灵敏度和高特异性的标志物对青光眼诊断和监控尤为重要。近年来，随着高通量测序及基因芯片等技术的发展，非编码rna(non-codingrna，ncrna)这类“暗物质”的重要性愈发突显出来。其中，ncrna根据其长度可分为小型非编码rna(smallnon-codingrnas,sncrnas)(<200bp)和长链非编码rna(longnon-codingrnas,lncrnas)(>200bp)。已有研究证明，哺乳动物基因组可编码数以万计的lncrnas，其中大约40％的lncrnas特异地于脑部表达并且参与脑部神经系统生理及病理活动的基因表达调控。并且，特定lncrnas的异常表达与青光眼的发生发展具有紧密相关。因此，青光眼相关的lncrnas研究有望填补青光眼相关生化检测的空白。

lncrna具有高度保守性及组织特异性，在脑部含量非常丰富。lncrna不仅参与了神经系统的生长发育和功能完善，使神经系统按照一定的时间顺序和在一定的空间内进行生长和发育，并且参与执行神经系统的功能。lncrna通过多种机制参与到神经系统的发育及功能执行中，包括作为顺式作用元件及反式作用因子参与基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mrna降解和翻译调控等过程。例如，微小rnas(micrornas,mirnas)已被证明参与机体生理及病理活动的多个方面。ranin等发现特定lncrnas分子能通过mirna介导调控notch通路，从而实现对神经发育的调控作用。此外，lncrnas的异常表达与神经系统的病理状态密切相关。tanjy等证明长链非编码rnasca7(lnc-sca7)的异常表达可通过mir-124介导在转录后水平影响基因sca7的表达，引起遗传性脊髓小脑共济失调7型，这种病变主要表现为视网膜及小脑神经元的退行性变。因此，利用检测lncrnas的组成及表达水平的变化来反映神经系统的生理及病理状态，进而通过调控lncrnas的表达来达到治疗疾病的目的是可行的手段。

小梁网细胞的病理性钙化是青光眼重要的病理特征之一。研究证明，相对于对照组人群而言，青光眼患者的小梁网组织具有更高的硬度。作为房水流出通道的重要构成部分，小梁网的状态能够对眼内压产生直接影响。已有研究证明，小梁网组织的硬度可能是青光眼患者视神经损伤的重要决定因素。因此，小梁网钙化相关的新型lncrna分子的发现对今后青光眼相关治疗具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种lncrnasenst00000607393的sirna在制备治疗青光眼制剂上的应用。对于青光眼的治疗有重大意义。

lncrnasenst00000607393的sirna在制备治疗青光眼制剂上的应用，所述的lncrnasenst00000607393的序列如：seqidno:1所示。

所述的治疗青光眼制剂包括：针对enst00000607393的sirna的正义链序列为5’-gcaggcgugugcauuucuu-3’,反义链序列为3’-aagaaaugcacacgccugc-5’。

所述的治疗青光眼制剂还包括：阴性对照正义链序列为5’-uucuccgaacgugucacgu-3’,反义链序列为5’-acgugacacguucggagaa-3’。

本发明明确了enst00000607393表达水平与人原代小梁网细胞钙化的相关性，我们首先通过sirna干扰下调人原代小梁网细胞中enst00000607393的表达水平至对照组的46.21％。在500μmol/l过氧化氢溶液干预细胞48小时的条件下，我们观察到相对于对照组而言，enst00000607393的表达下调可显著降低人原代小梁网细胞alp活性，起到治疗或者预防青光眼的作用。

附图说明

图1为青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表达谱；

a：青光眼患者房水中lncrnas表达谱分析聚类图；b：青光眼患者房水中mrnas表达谱分析聚类图。

图2为青光眼患者房水中差异表达的lncrnas和mrnas；

a：较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍差异表达的lncrnas；b：较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍差异表达的mrnas。

图3为青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表达的cnc分析图；

红色点代表lncrnas，蓝色点代表mrnas，实线代表正相关，虚线代表负相关。

图4为lncrnas在青光眼及年龄相关性白内障患者房水中的表达量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼及年龄相关性白内障患者房水中表达的散点图；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在在青光眼及年龄相关性白内障患者房水中表达的箱图。

图5为lncrnas在青光眼患者对照人群虹膜组织中的表达量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及对照人群虹膜组织中表达的散点图；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者对照人群虹膜组织中表达的箱图。

图6为lncrnas在青光眼患者及对照人群血清中的表达量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及对照人群血清中表达的散点图；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者对照人群血清中表达的箱图。

图7为利用lncrnas在不同组织中诊断青光眼的roc曲线；

a：利用t267384在房水中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.998；b：利用enst00000607393在房水中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.998；c：利用t342877在房水中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.983；d：利用enst00000607393在虹膜组织中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.793；e：利用t267384在血清中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.620；f：利用enst00000607393在血清中诊断青光眼的roc曲线，曲线下面积为0.638。

图8为enst00000607393在青光眼患者小梁网细胞中表达；

a-d：利用enst00000607393特异性fish探针检测发现，enst00000607393在青光眼患者小梁网细胞中表达；

e-h：利用enst00000607393特异性fish探针检测发现，enst00000607393在人原代小梁网细胞的细胞核和细胞质中均有表达。

图9为过氧化氢干预后人原代小梁网细胞enst00000607393表达上调；

a-b：利用茜素红染色发现，相对于对照组(a)而言，500μmol/l过氧化氢溶液处理48h(b)后人原代小梁网细胞出现钙结节；c：不同浓度过氧化氢溶液处理48h后，人原代小梁网细胞中enst00000607393表达水平，*代表p<0.05；d：不同浓度过氧化氢溶液处理48h后，人原代小梁网细胞中alp活性，*代表p<0.05。

图10为下调enst00000607393表达可显著降低人原代小梁网细胞钙化水平；a：利用sirna技术，下调人原代小梁网细胞中enst00000607393的表达水平，*代表p<0.05；b：相对于对照组而言，利用sirna下调enst00000607393的表达水平后，人原代小梁网细胞中alp活性显著下降，*代表p<0.05。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表达谱：

1.1材料与试剂

1.1.1主要仪器

常用离心机及低温离心机购自eppendorf公司；高速离心机购自beckman公司；real-timepcr仪器购自abi公司；移液器和电动移液枪购自eppendorf公司；q5000购自quawelltechnology公司；制冰机购自sanyan公司。

1.1.2材料与试剂

不同型号的离心管及pcr管均购自axygen公司；depc水购自鼎国昌盛公司；trizol购自invitrogen公司；targetamp^tm1-roundarnaamplification试剂盒购自epicentre公司；transcriptorfirststrandcdnasynthesis试剂盒购自roche公司；quickamplabelingkit,one-color试剂盒购自agilenttechnologies公司；人lncrnasmicroarray芯片购自arraystar公司。

1.1.3试剂配置

各种免疫印迹所用试剂根据《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

1.2方法

1.2.1房水样本准备

该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批。术前与所有研究对象签署知情同意书，在正式手术步骤开始前利用1ml的一次性无菌注射器于角膜缘抽取未稀释的房水标本0.1ml，立即注入高压灭菌的0.5mlep管中，置于-80℃低温冰箱避光保存备用。所有入选患者为在我院住院需要进行手术治疗的青光眼患者和年龄相关性白内障患者。纳入标准：1.原发性开角型青光眼：a.眼压>21mmhgb.青光眼性视盘损害和/rnfl缺损c.典型的青光眼性视野缺损d.前房角开放。具有以上四项或具有其中的a,d,b或c者。2.正常眼压性青光眼：具有类似于poag的视盘改变，rnfl及视野损害，24h眼压测量均≤21mmhg,房角开放。3.原发性闭角型青光眼：具有青光眼的视盘改变，rnfl及视野损害，眼压>21mmhg,前房角变窄或关闭4.年龄相关性白内障(对照组)：晶状体呈皮质性和/或核型浑浊和/或后囊下性混浊。排除标准：1.伴发全身性疾病如高血压和糖尿病等。2.继发性青光眼3.可能影响视野、视神经或色觉的眼科或神经科疾病。4.视野检测可靠性标准：固视丢失率、假阳性率和/或假阴性率>25％。5.年龄相关性白内障：排除并发性、外伤性、先天性白内障并排除伴有其他眼内疾病者、排除过熟期病例。

1.2.2rna提取

取房水0.1ml加入0.5mltrizol试剂，剧烈震荡后加入0.1毫升氯仿。而后经离心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于10微升dpec水，经q5000仪器测量各管rna浓度。

1.2.3rna扩增

使用targetamp^tm1-roundarnaamplificationkit103(epicentre)按生厂商说明书所示步骤对rna进行扩增。大致步骤如下：首先根据rna样本合成单成单链cdna:rna杂交产物，然后使用rnaseh酶将上述杂交产物消化为小片段序列，这些小片段序列可协助双链cdna的合成。最后由双链cdna转录合成反义rna。

1.2.4cdna合成和标记

使用transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit(roche)按生厂商说明书所示步骤合成cdna。使用quickamplabelingkit,one-color(agilenttechnologies)对合成的cdna进行标记。

1.2.5标记效率质量检测

取1.5微升已标记的cdna样本，使用nanodropnd-1000检测荧光标记效率。

1.2.6芯片杂交

在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片(humanlncrnamicroarrayv4.0,arraystar公司)进行杂交。该芯片共检测40173种lncrnas及20730种mrnas表达水平。

1.2.7图像采集和数据分析

使用genepix4000b芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存。p值<0.05为差异有统计学意义。

1.3结果

1.3.1青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表达谱

在10份青光眼患者房水样本中平均检测到20653±569.9种lncrnas和11265±268.3种mrnas。其中，10份青光眼患者房水样本中均检测到的lncrnas为11728种，均检测到的mrnas为6686种。1.3.2青光眼患者房水中差异表达的lncrnas及mrnas

较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍上调表达的lncrnas为4372种，2倍下调表达的lncrnas为2602种。较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍上调表达的mrnas为2783种，2倍下调表达的mrnas为1617种。

1.4结果

由于其易取性、个体特异性及相对受机体其他器官影响较小的特点，房水是一种眼部疾病生物标志物相关研究的价值较大的研究对象。并且，尽管目前已有多种研究报道青光眼相关的流行病学及遗传学危险因素，但以房水为研究对象的相关研究相对较少。因此，我们认为房水具有应用于今后青光眼相关遗传学研究的潜能。由于取样的限制，人源性房水样本体积较小。为克服该问题，我们在进行芯片杂交前增加rna扩增步骤，如此以保证后续步骤的顺利进行。通过使用lncrnas芯片微阵列分析方法，11728种lncrnas及6686种mrnas在10份青光眼房水样本中均检测到，这与年龄相关性白内障患者房水中lncrnas和mrnas表达谱具有显著差异，因此房水中lncrnas和mrnas表达谱表现出个体特异性及疾病特异性。就我们所知，这是第一个青光眼房水相关lncrnas和mrnas表达谱研究。

实施例2：通过cnc分析明确房水中特定lncrnas与mrnas的相关性

为进一步探讨青光眼患者房水中表达的lncrnas的可能功能，我们运用cnc(coding-noncodinggeneco-expression)分析明确与青光眼相关基因的mrnas表达具有显著相关性的lncrnas。cns分析是一种通过lncrna和mrna共表达数据，将lncrna与mrna联系起来的分析方法。通过cnc分析可以发现与某个lncrna具有相同表达模式的mrna，通过这些mrna的功能，可以将lncrna与特定信号通路或疾病状况联系起来，从而便于预测lncrna的功能，并揭示其作用机制。

2.1方法

挑选房水中差异表达并且与青光眼发生发展具有相关性的mrnas，将这些mrnas在不同青光眼患者房水中的表达数据求平均值；求挑选出的mrnas标准化之后的数据与青光眼患者房水中差异表达的lncrnas相关数据之间的皮尔逊相关系数(pearsoncorrelationcoefficient,pcc)与错误发现率(falsediscoveryrate,fdr)；挑选出pcc≥0.90并且fdr≤0.05的记录；使用相关记录，利用cytoscape2.8.3工具绘图。

2.2结果

较年龄相关性白内障而言，在青光眼患者房水中差异表达且与青光眼发生发展具有相关性的mrnas为如下十种：骨形态生成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,bmp2)、室管膜相关基因1(ependyminrelated1,epdr1)、转化生长因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,tgfb1)、叉头蛋白e3(forkheadboxe3,foxe3)、生长激素促分泌素受体(growthhormonesecretagoguereceptor,ghsr)、叉头蛋白c1(forkheadboxc1,foxc1)、跨膜及卷曲螺旋结构域1(transmembraneandcoiled-coildomains1,tmco1)、ph结构域a7(pleckstrinhomologydomaincontaininga7,plekha7)、视神经蛋白(optineurin,optn)和整合素亚基β5(integrinsubunitbeta5,itgb5)。在青光眼患者房水中，与这些mrnas表达的皮尔逊相关系数大于0.9并且错误发现率小于0.05的lncrnas有10种。

在我们所得结果中bmp2具有最多种类的相关lncrnas，这意味着众多lncrnas可能具有与该基因相似的生物学背景。bmp2属于转移生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)超家族蛋白。它具有很强的促进骨生成和诱导多潜能间充质干细胞向成骨细胞系分化的能力。同样，bmp2可引起体外培养环境中人原代小梁网细胞出现成骨样细胞特征，体内实验通过腺病毒转染过表达bmp2，进一步证明小梁网部位bmp2基因的表达水平上调可在不影响该部位基本结构的条件下引起大鼠眼内压的显著增高。进一步研究证明，小梁网部位bmp2基因过表达的小鼠可作为青光眼相关研究的动物模型之一。因此，该基因与青光眼发生发展关系密切，这也进一步表明青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表达谱表现出高度的疾病特异性。

实施例3

我们利用qrt-pcr在青光眼及年龄相关白内障患者房水中验证实施例2中的10种lncrnas中，7种lncrnas在两类房水中的差异表达量具有统计学差异，3种lncrnas在两类房水中的差异表达量无统计学差异。然后选取差异表达量最显著的3种t267384、enst00000607393和t342877，进行进一步验证。

实施例4

我们运用qrt-pcr检测方法验证实施例3中差异最显著的3种lncrnas分子在房水、虹膜组织和血清中的表达水平，并分析其在青光眼患者和正常人中表达量的差异。

4.1材料与试剂

4.1.1主要仪器

常用离心机及低温离心机购自eppendorf公司；高速离心机购自beckman公司；real-timepcr仪器购自abi公司；移液器和电动移液枪购自eppendorf公司；q5000购自quawelltechnology公司；制冰机购自sanyan公司。

4.1.2材料与试剂

不同型号的离心管及pcr管均购自axygen公司；depc水购自鼎国昌盛公司；trizol购自invitrogen公司；逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自roche公司。

4.1.3试剂配置

各种免疫印迹所用试剂根据《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

4.2方法

4.2.1房水、血清及虹膜样本准备

房水样本按1.2.1所述步骤准备。血清样本取自青光眼患者组及健康对照组人群，其中青光眼患者的纳入及排除标准同1.2.1所述，对照组血清取自与青光眼组患者年龄与性别匹配的健康人群。虹膜样本取自青光眼患者组及对照组，其中青光眼患者的纳入及排除标准同1.2.1所述，对照组虹膜样本取自与青光眼患者年龄与性别匹配的湘雅二医院角膜捐赠自愿者的虹膜组织。

4.2.2rna提取

0.1毫升房水或虹膜组织加入0.5毫升trizol试剂，剧烈震荡后加入0.1毫升氯仿。而后经离心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于20微升dpec水，经q5000仪器测量各孔rna浓度。外周静脉血静置30分钟后放入离心机中，在3200转/分钟的条件下离心10分钟,使用灭菌的移液管取上层血清，然经由上述同样步骤提取rna。

4.2.3qrt-pcr

根据生厂商说明书首先依赖反转录酶将rna反转录成cdna，然后用pcr方法扩增cdna，通过测定荧光强度信号实时检测定量扩增的产物量。

4.2.2数据分析

采用spss19.0版统计学软件进行数据处理。计量资料以中位数±四分位数间距表示，青光眼/白内障代表两组中位数比值，比较进行mann-whitneyu检验。p值<0.05为差异有统计学意义。

4.3结果

为进一步扩大房水样本量验证相关lncrnas的表达水平并且探究特定lncrnas在青光眼患者血清及虹膜中的表达量，我们利用qrt-pcr检测60个房水样本(30个青光眼患者房水样本，30个年龄与性别匹配的年龄相关性白内障患者房水标本)、50个虹膜组织(40个青光眼患者虹膜组织样本，10个年龄与性别匹配的角膜捐赠自愿者的虹膜组织)和158个血清样本(103个青光眼患者血清样本，55个年龄与性别匹配的健康人群血清样本)中t267384、enst00000607393和t342877表达水平。结果表明，在两类房水样本中，三种lncrnas的表达量均有统计学差异，其在青光眼患者房水中表达量依次为在年龄相关性白内障患者房水中表达量的4.4036、2.1467和2.9692倍；在两类虹膜组织中enst00000607393的表达量具有统计学差异，其在青光眼患者虹膜组织中表达量为在对照组虹膜组织中表达量的3.3436倍，而t267384和t342877的表达量无统计学差异；在两类血清样本中，t267384及enst00000607393的表达量具有统计学差异，其在青光眼患者血清中表达量依次为在对照组血清中表达量的1.2878和1.5301倍，而t342877的表达量无统计学差异(表1,2,3)(图4,5,6)。为进一步了解这三种lncrnas在不同种组织中诊断青光眼的有效性，我们利用所得数据绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线(图7)。发现t267384、enst00000607393和t342877在房水样本中诊断青光眼的roc曲线下面积分别为0.998、0.998和0.983。enst00000607393在虹膜组织中诊断青光眼的roc曲线下面积为0.793；t267384和enst00000607393在血清样本中诊断青光眼的roc曲线下面积分别为0.620和0.638。当t267384、enst00000607393和t342877在房水中的诊断值设为1.5437、1.1485和2.1052时，其诊断的敏感性/特异性依次为0.967/0.967、0.967/0.967和0.967/0.900；当enst00000607393在虹膜组织中的诊断值设为0.2470时，其诊断的敏感性/特异性为0.700/0.700；当t267384和enst00000607393在血清中的诊断值设为0.7191和0.8376时，其诊断的敏感性/特异性依次为0.612/0.600和0.680/0.600。

表13种lncrnas在房水中的表达量

表23种lncrnas在虹膜组织中的表达量

表33种lncrnas在血清中的表达量

表43种lncrnas在不同组织中诊断的敏感性和特异性

实施例5

小梁网细胞及schlemm’s管是房水流出通道的重要组成部分。小梁网细胞钙化是青光眼发生发展过程中可能的病理性变化之一。由cnc分析我们得知enst00000607393与bmp2的表达水平正相关，而bmp2是一种与小梁网细胞钙化密切相关的基因并且其mrna表达水平在青光眼患者房水中上调表达。因此，为进一步了解enst00000607393与小梁网细胞钙化之间的关系，我们将以人原代小梁网细胞为研究对象，利用rna原位杂交和sirna干扰等手段进行后续研究。

5.1材料与试剂

5.1.1主要仪器

细胞培养箱购自forma公司；nanodrop分光光度计购自thermoscientific公司；常用离心机及低温离心机购自eppendorf公司；real-timepcr仪器购自abi公司；移液器和电动移液枪购自eppendorf公司；酶标仪购自perkinelmer公司；冰冻切片机购自thermoscientific公司；q5000购自quawelltechnology公司；制冰机购自sanyan公司；荧光显微镜购自olympus公司。

5.1.2材料与试剂

不同型号细胞培养瓶、培养皿及吸管均购自bdbioscience公司；不同型号的离心管及pcr管均购自axygen公司；trizol购自invitrogen公司；细胞培养基、胎牛血清及双抗购自gibco公司；lipofectamine3000购自invitrogen公司；特异性fish探针购自上海吉玛公司；alkalinephosphataseassaykit和alpenzyme购自abcam公司；过氧化氢溶液和茜素红购自sigma公司；其余常用生化试剂均购自sigma公司或提供分析纯级别的公司。

5.1.3试剂配置

各种免疫印迹所用试剂根据《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

5.2方法

5.2.1人原代小梁网细胞的分离及培养

人原代小梁网细胞分离于湘雅二医院角膜捐赠自愿者的小梁组织。在显微镜下将小梁组织成条撕下，剪成小块，贴壁30分钟后，加入rpmi-1640培养液(含10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，置于含5％二氧化碳的37°恒温箱中培养。细胞开始生长后，每隔3天换液一次。以0.25％胰蛋白酶消化传代。取人原代小梁网细胞制备细胞铺片，进行纤连蛋白(fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)免疫荧光染色，对小梁网细胞进行鉴定。后续实验中使用的人原代小梁网细胞培养于杜氏培养液(dulbecco’smodifiedeagle’smedium,dmem)+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素。实验中均使用4-6代人原代小梁网细胞。

5.2.2荧光标记原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,fish)探针定位

三条fish探针的序列分别为5’-agaaggctcggcgtaggga-3’,5’-tgataatgagaaggctcggcgta-3’,5’-gagcccgagttcgctggaat-3’。

使用双蒸纯水将fish探针稀释为浓度为20um的储存液备用。人原代小梁网细胞以1×10⁵接种于6孔板内，24小时候吸出培养液，细胞备用。将细胞经无水乙醇、0.1％tritonx-100、2×ssc水处理后，每孔加入100微升探针混合液，37°培养箱放置过夜。杂交次日，经0.4×ssc及2×ssc处理后加入100微升dapi染液，避光染色20分钟后，荧光显微镜观察。青光眼患者小梁网组织用oct剂包埋后进行冰冻切片，经4％甲醛固定、透化及清洗后以上述相同步骤进行fish探针杂交。

5.2.3过氧化氢干预

由于alp活性即碱性磷酸酶活性，是细胞钙化的标志物之一。所以小梁网细胞中alp活性可以反映该细胞钙化水平，因为正常的细胞(不使用过氧化氢干预时)alp活性是很低的，因此，使用过氧化氢干预是为了建立体外细胞研究模型。

人原代小梁网细胞以1×10⁵接种于6孔板内，用细胞培养液将％过氧化氢溶液分别稀释为500、600、700、800和900微摩尔/升。分别加入2毫升上述浓度过氧化氢溶液加入6孔板内，48小时后吸出培养液进行后续实验。

5.2.4茜素红染色

取人原代小梁网细胞制备细胞铺片，将上述对照组及经不同浓度过氧化氢溶液处理后的细胞经4％多聚甲醛及pbs处理后，每孔加入1毫升0.1％茜素红-tris-hcl，37°恒温箱中放置30分钟后，于光学显微镜下进行观察。

5.2.5碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)活性检测

人原代小梁网细胞以1×10⁵接种于6孔板内，将上述对照组及经不同浓度过氧化氢溶液处理后的细胞根据生厂商说明书处理后于od405nm的酶标仪上读取数值。

5.2.6sirna干扰

阴性对照正义链序列为5’-uucuccgaacgugucacgu-3’,反义链序列为5’-acgugacacguucggagaa-3’。针对enst00000607393的sirna的正义链序列为5’-gcaggcgugugcauuucuu-3’,反义链序列为3’-aagaaaugcacacgccugc-5’。转染前一天，1×10⁵接种于6孔板内。在50微升无血清dmem培基中加入30pmolsirna,柔和混匀，用50微升无血清dmem培基稀释6微升lipofectamin试剂,将稀释好的sirna与lipofectamin试剂混匀，室温放置5分钟。然后将sirna/lipofectamin复合物加入到细胞培养基中于含5％二氧化碳的37°恒温箱中培养48小时后进行后续实验。

5.2.7rna提取

人原代小梁网细胞以1×10⁵接种于6孔板内经不同处理后，吸出培养液，pbs清洗3次后，加入0.5毫升trizol试剂，剧烈震荡后加入0.1毫升氯仿。而后经离心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于20微升dpec水，经q5000仪器测量各孔rna浓度。

5.2.8qrt-pcr

根据生厂商说明书首先依赖反转录酶将rna反转录成cdna，然后用pcr方法扩增cdna，通过测定荧光强度信号实时检测定量扩增的产物量。

5.3结果

5.3.1青光眼患者的小梁网组织和人原代小梁网细胞的细胞核及细胞质中均表达enst00000607393。

为观察青光眼患者的小梁网组织中enst00000607393的表达情况，我们将青光眼患者的小梁网组织进行冰冻切片后，同时进行enst00000607393特异性fish探针及小梁网细胞标志fibronectin的免疫荧光染色。我们观察到青光眼患者小梁网组织的小梁网细胞中存在enst00000607393的表达(图8，a-d)。为进一步确定小梁网细胞中enst00000607393的亚定位，我们在人原代小梁网细胞上同时进行enst00000607393特异性fish探针及小梁网细胞标志fibronectin的免疫荧光染色。进一步观察到人原代小梁网细胞的细胞核及细胞质中均表达enst00000607393(图8，e-h)。

5.3.2过氧化氢干预后人原代小梁网细胞钙化水平升高

将人原代小梁网细胞分别用0、500、600、700、800和900微摩尔/升的过氧化氢溶液处理48小时后，进行enst00000607393表达水平、茜素红染色及alp活性测定。结果显示，相对于对照组，500和600μmol/l过氧化氢溶液分别干预48小时后，人原代小梁网中enst00000607393的表达水平显著上升，上升倍数依次为7.21和4.36，而700、800和900μmol/l过氧化氢溶液分别干预48小时后，细胞中enst00000607393的表达水平无显著改变(图9，c)。通过茜素红染色，我们观察到相对于对照组，500μmol/l过氧化氢溶液干预48小时后，人原代小梁网细胞有钙结节的形成(图9，a-b)。相对于对照组，500、600、700、800和900μmol/l过氧化氢溶液分别干预48小时后，细胞中alp活性均有不同程度的显著上升。

5.3.3下调enst00000607393表达可显著降低人原代小梁网细胞钙化水平

为明确enst00000607393表达水平与人原代小梁网细胞钙化的相关性，我们首先通过sirna干扰下调人原代小梁网细胞中enst00000607393的表达水平至对照组的46.21％。在500μmol/l过氧化氢溶液干预细胞48小时的条件下，我们观察到相对于对照组而言，enst00000607393的表达下调可显著降低人原代小梁网细胞alp活性。

小梁网细胞的病理性钙化是青光眼重要的病理特征之一。研究证明，相对于对照组人群而言，青光眼患者的小梁网组织具有更高的硬度。作为房水流出通道的重要构成部分，小梁网的状态能够对眼内压产生直接影响。小梁网组织的硬度可能是青光眼患者视神经损伤的重要决定因素。因此，小梁网钙化相关的新型lncrna分子的发现对今后青光眼相关治疗具有重大意义。

sequencelisting

<110>中南大学

<120>lncrnasenst00000607393sirna制备治疗青光眼制剂的应用

<130>无

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>312

<212>dna

<213>lncrna：enst00000607393的序列

<400>1

ctagcttccgagggacttctctgcgagcaccgcaggcgtgtgcatttcttcgaatctgag60

aattccagcgaactcgggctctaccagagtttaagtcggcccctggggcgtctgtttgtt120

tattggctcttaagggaaaaaagtttgaagatctttaaccagcctcagacctggcgcggg180

cggaaatcccggaatctccccaagcaaaagtgatataacttcaagtcgttatataagtgg240

ggggctccttcttcccctccctacgccgagccttctcattatcattccgggagtaaaatg300

tgtctcgctcaa312

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>针对enst00000607393的sirna的正义链序列

<400>2

gcaggcgugugcauuucuu19

<210>3

<211>19

<212>rna

<213>针对enst00000607393的sirna的反义链序列

<400>3

aagaaaugcacacgccugc19

<210>4

<211>19

<212>rna

<213>阴性对照正义链序列

<400>4

uucuccgaacgugucacgu19

<210>5

<211>19

<212>rna

<213>阴性对照反义链序列

<400>5

acgugacacguucggagaa19

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>fish探针1

<400>6

agaaggctcggcgtaggga19

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>fish探针2

<400>7

tgataatgagaaggctcggcgta23

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>fish探针3

<400>8

gagcccgagttcgctggaat20