miR‑141在制备抗骨质疏松、抑制骨吸收制剂中的应用的制作方法

本发明属于生物医学材料
技术领域：
，更具体地，涉及一种mir-141在制备抗骨质疏松、抑制骨吸收制剂中的应用。
背景技术：
：骨质疏松是一种因骨量降低，骨组织微结构破坏，骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。随着世界人口老龄化趋势日益严重，骨质疏松的发病率越来越高。据第六次人口普查显示，我国65岁以上的老年人已占总人口的7.5％，预计到2020年我国骨质疏松患者将超过2.5亿，占全世界骨质疏松患者的一半以上。世界卫生组织已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病共同列为危害老年人健康的三大杀手。破骨细胞是一种髓系来源的细胞类型，在骨骼发育及骨吸收过程中发挥着重要的作用。深入理解破骨细胞功能的调节机制是对抗骨质疏松症的前提条件。破骨细胞是骨质疏松和骨折的预防和治疗方面的重要靶点，而二膦酸盐是这方面使用最广泛的药物。然而，研究表明长期使用该药物与非典型股骨骨折具有密切相关性，临床静脉注射二膦酸盐的患者容易出现颌骨坏死。因此，具有全新靶点的抗骨吸收药物的研发具有迫切的现实意义。microrna(简称mirna)是一类内源性的，长度为18到22个核苷酸的非编码小rna。mirna通过与靶mrna的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mrna的降解或抑制翻译。到目前为止，已报道有几千种mirna存在于动物、植物、真菌等多种生物体内。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirnas也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirnas的组合来精细调控某个基因的表达。随着mirna调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。mir-141作为mir-200家族的成员之一，目前对它的功能报道较少，只发现有些肿瘤中表达水平出现异常，比如异常表达的mir-141参与了胆管癌细胞的增殖和肾癌细胞的侵袭活动。mir-141可以与zeb2的3’utr相结合，降低细胞内zeb2的水平，从而抑制肝癌发生发展的作用。但目前尚未见关于mir-141在抗骨质疏松、骨吸收等过程中的任何报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供mir-141的新用途，即mir-141在制备抗骨质疏松、抑制骨吸收制剂中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：mir-141在制备抗骨质疏松、抑制骨吸收制剂中的应用为了更好的理解本发明的实质，下面结合药理实验和结果说明其在制药领域中的新用途。研究发现猕猴mir-141(5’-aacacugucugguaaagaugg-3’)(seqidno:i)在猕猴细胞内过表达能显著降低骨髓单核细胞(bmm)细胞合成抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)，同时实时pcr的结果显示：bmm细胞内trapmrna的水平显著降低。rankl诱导的bmm细胞在破骨向分化的过程中，mir-141的水平明显下降。bmm细胞转染mir-141后，rankl诱导的bmm细胞破骨向分化的能力明显降低，和对照组相比，细胞表达trap的能力明显降低。说明mir-141在破骨向诱导分化过程中发挥着重要的调控作用。雌性老年猕猴和骨质疏松病人的骨组织中mir-141的表达水平下降。利用核酸递送系统将mir-141再递送到雌性老年横河猴体内后，通过检测破骨细胞分化指标判断mir-141能够抑制破骨细胞的分化。并且通过microct检测，发现递送mir-141的实验组猕猴的骨密度、骨小梁的数量和厚度均比对照组猕猴增加。说明mir-141对雌性老年猕猴骨质疏松模型具有一定的调节作用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.本发明对已知的mir-141发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。2.本发明mir-141的抑制剂能够下调mir-141的表达丰度，促进破骨细胞分化的分化、增强骨吸收，从而引起骨质疏松。mir-141可以抑制破骨细胞分化，进一步抑制骨吸收作用，可将mir-141用于制备抑制骨丢失，抗骨质疏松各类医药制剂。附图说明图1为实时荧光定量pcr检测猕猴破骨细胞分化过程中的标志基因的表达水平。图2为实时荧光定量pcr检测mir-141在猕猴破骨细胞分化过程中的表达丰富度。图3为瞬时转染mir-141抑制破骨细胞分化相关指标。图4为mir-141抑制破骨细胞分化trap染色结果图。图5为对照组和实验组猕猴股骨ct扫描图。图6为对照组和实验组猕猴的体重变化。图7为对照组和实验组主要器官的组织切片。图8为对照组和实验组猕猴血清生理生化指标变化。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。mir-141购自于上海吉玛制药技术有限公司。实施例中采用健康的老年雌性猕猴，购自南宁灵康赛诺科生物科技有限公司(wincontheracellsbiotechnologiescoltd，wincon)。参与实验的猕猴的年龄在19～23岁之间，体重在5.8～6.5kg之间。每只试验猴均单笼饲养，每天喂食饲料两次，辅以适量水果，自由饮水。饲养室环境温度控制在24～30℃，光照12小时，全天自动同分。实验动物的使用以及护理均事前跟wincon动物福利委员会申请并得到许可。实验之前同时将其麻醉进行骨密度检测(腰椎和髋骨)，最后抽取3ml静脉血。并对其血清的ntx、ctx和trap进行检测。对于参与卵巢摘取的猕猴，首先进行麻醉，抽取3ml血液，离心获取血清。然后收集骨骼样本，ct检测骨密度。摘除卵巢后每隔一个半月收集血清，骨骼样本和进行ct检测。实施例1猕猴bmm细胞诱导将2月龄猕猴的骨髓冲出，用含10％fbs的α-mem培养液，在5％co2的37℃恒温培养箱中培养24小时。诱导时将细胞以1×104/孔接种到24孔板中，加入50ng/mlm-csf诱导3天，3天后加入50ng/mlm-csf和100ng/mlrankl诱导细胞，每天给细胞换液，细胞培养5天后进行后续的分子检测和trap染色。破骨细胞分化特异性基因引物序列如表1所示：(f，上游引物；r，下游引物)表1破骨细胞分化特异性基因引物序列实施例2细胞总rna提取待细胞长满24孔细胞培养板每个小孔的80％-90％，加入1mltrizol裂解细胞并用枪头反复吹打，室温作用5分钟。将裂解液移入1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，盖紧管盖，用力上下振荡离心管，室温静置5分钟，在4℃条件下，12000g/min离心15分钟。将无色上层水相液体转移至新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10分钟，在4℃条件下，12000g/min离心10分钟。将上清用移液器吸取，丢弃，保留底部白色沉淀。加入1ml75％乙醇(depc水配制)，用手轻轻将白色沉淀弹起，然后在4℃条件下，7500g/min离心5分钟。弃上清，室温干燥10-15分钟，加入30-40μlldepc水重新溶解，置于-80℃冰箱中保存或直接使用。实施例3猕猴bmm细胞破骨向分化标志基因表达水平的检测使用takara公司的反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser，codeno.:rr047a)，根据试剂盒的操作流程，将提取的总rna反转录成cdna。使用实时荧光定量pcr技术检测猕猴bmm分化过程中标志基因的表达水平。图1为实时荧光定量pcr检测猕猴破骨细胞分化过程中的标志基因的表达水平。从图1可知，trap相对表达水平和ctsk相对表达水平均随分化天数的增加而增加。破骨细胞分化的分子指标随着细胞的分化含量增高，结果说明破骨细胞分化成功。实施例4猕猴骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中mir-141表达丰度的检测提取不同分化时期猕猴骨髓单核细胞的总rna，使用takara公司的mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit合成cdna，使用针对mir-141的pcr引物及takara的mir-xtmmirnaqrt-pcrkit进行荧光定量pcr，如表2所示。以u6基因作为内参对mir-141检测结果进行标准化校正。图2为实时荧光定量pcr检测mir-141在猕猴bmm细胞分化过程中的表达丰富度。结果显示，随着破骨细胞的分化，mir-141的含量逐渐下降。表2用于实时荧光定量pcr分析的mir-141的引物序列基因名称引物序列mml-mir-1415’-aacactgtctggtaaagatgg-3’u65’-cgactgcataatttgtggtagtgg-3实施例5细胞转染实验将细胞以1×104个/孔接种于24孔板，细胞诱导2天转染一次，待细胞诱导4天时再转染一次。转染时将适量mir-141溶于无血清优化培养基，同时将lip3000中的p3000与其混合，最后将lip3000加入到该混合物中，室温静置5分钟。吸去原细胞培养液，换新鲜培养液，将转染液加入到新鲜培养液中，37℃孵育24小时。最后弃去含转染液的培养基，加入完全培养基继续培养。图3为瞬时转染mir-141抑制破骨细胞分化相关指标。结果显示，破骨细胞转染mir-141后，抑制了其进一步分化。实施例6破骨细胞trap染色破骨细胞分化6天后，弃上清，用pbs清洗细胞，然后加入固定剂。室温固定细胞30秒，然后用去离子水冲洗3次。将0.5mlfastgarnetgbcbasesolution和0.5mlsodiumnitritesolution混合，颠倒混匀，室温静置2分钟。将上述混合液与45ml预热至37℃的去离子水，0.5mlnaphtholas-biphosphatesolution，2mlacetatesolution和1mltartratesolution混合，在37℃水浴锅中水浴。将上述溶液加入到细胞培养皿中37℃孵育1小时。图4为mir-141抑制破骨细胞分化trap染色结果图。其中，(a)为转染mir-141前，(b)为转染mir-141后，从图4中可知，实验组破骨细胞明显下降，结果显示，转染mir-141后破骨细胞的数量下降，说明mir-141对破骨细胞分化具有抑制作用。实施例7猕猴股骨ct检测在第12周将实验组和对照组的猕猴安乐死，并用4％多聚甲醛心脏灌流固定恒河猴。取出恒河猴的下肢骨，腰椎和髋骨。4％多聚甲醛固定1周，然后用10％蔗糖溶液清洗。使用微计算机断层扫描技术(microcomputedtomography,micro-ct)对猕猴的骨样本进行扫描。扫描完成后，对干骺端骨小梁进行分析。包括骨小梁的体积比(bv/tv)、骨小梁的厚度(tb.th)和骨小梁的数量(tb.n)。图5为对照组和实验组猕猴股骨ct图。其中，(a)为对照组，(b)为实验组，从图5中可知，实验组的骨密度明显增加。结果显示，实验组猕猴骨量比对照组高，说明给予mir-141后缓解了老年猕猴的骨量丢失。实施例8mir-141安全性评估每周记录实验组和对照组猕猴体重并抽取血液，第12周将实验组和对照组猕猴安乐死，取其主要器官(心、肝、脾、肾)进行组织学染色。并对其血清的生理生化指标进行检测。图5为对照组和实验组猕猴的体重变化。实验结果显示，实验组和对照组猕猴体重没有明显差异。图6为对照组和实验组主要器官的组织切片。结果显示，实验组和对照组主要器官没有明显差异。图7为实验组和对照组猕猴血清生理生化指标变化，由图7可知，mir-141对心、肝、脾、肺组织没有造成明显的组织损伤。结果显示，实验组和对照组没有明显差异。综上诉述给予猕猴mir-141没有产生明显的副作用。图8为对照组和实验组猕猴血清生理生化指标变化。由图8中可以看出，给予猕猴mir-141后，与对照组相比，谷丙转氨酶和体内葡萄糖含量，以及肌萎缩性脊髓侧索硬化程度都没有明显变化，说明给予mir-141没有给猕猴产生明显副作用。上述研究表明mir-141可以抑制破骨细胞分化，进一步抑制骨吸收作用，因此可将mir-141用于制备抑制骨丢失，抗骨质疏松各类医药制剂。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12