乙型肝炎DNA疫苗的免疫佐剂的制作方法

本发明属于疫苗领域，涉及疫苗佐剂，具体涉及乙型肝炎dna疫苗的免疫佐剂。
背景技术：
：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种影响传染病。接种乙肝疫苗是目前控制乙型肝炎感染的最有效的措施，但是传统的乙型肝炎亚单位疫苗是由乙型肝炎病毒的表面抗原和铝佐剂组成，铝佐剂疫苗仅能引起很好的体液免疫反应而不能引起有效的细胞免疫反应。dna疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗，其原理是编码基因插入到带有启动子的质粒载体，后用物理的方法将其导入到体内细胞，也即将裸露的dna注入机体后，目的基因在体内表达出目的蛋白，从而诱发机体的免疫反应。表达的蛋白经apc加工后，通过mhcⅰ与mhcⅱ两条通道提呈给免疫系统，刺激机体产生特异性体液和细胞免疫反应。dna疫苗具有以下优点：可以同时诱导细胞及体液免疫；不同免疫途径均可诱发免疫反应；具有适当结构及组成的外源性基因可以在人体内表达，并诱生中和性抗体；易保存、运输、生产。但它在诱导免疫应答中的效率相对较低，尤其是在大型动物和人类中，影响了它的实际应用。佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。免疫佐剂可以增强抗体应答；增强疫苗的粘膜传递，增进免疫接触；增强细胞免疫；增强弱免疫原的免疫原性，如高度纯化的抗原或重组抗原；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的人群中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；改变抗原的构型；改变体液抗体的种类、igg亚类和抗体的亲和性。佐剂的应用对于提高dna疫苗诱导免疫应答的效率至关重要。技术实现要素：本发明旨在提供一种乙型肝炎dna疫苗的免疫佐剂，该免疫佐剂为一种酶解多肽，以增强乙型肝炎dna疫苗的免疫应答效率。本发明通过如下技术方案得以实现：一种酶解多肽，通过如下方法制备而成：将青蛤肉脏经碱性蛋白酶酶解，用超滤膜截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥即得所述酶解多肽。优选地，所述的酶解多肽通过如下方法制备而成：取青蛤肉脏匀浆破碎，置于蒸馏水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为ph值9.4-9.8，酶解温度42-48℃，酶解时间6-8小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，12000-14000转/分钟离心15-25分钟，取上清，依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u的超滤膜进行分级分离，收集截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥即得所述酶解多肽。优选地，碱性蛋白酶重量为肉脏重量0.2-0.4％。优选地，酶解条件为ph值9.6，酶解温度45℃，酶解时间7小时。优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：在80-90℃条件下水浴8-12分钟。上述酶解多肽用作乙型肝炎dna疫苗佐剂的用途。本发明优点：本发明酶解多肽可显著增强乙型肝炎dna疫苗的免疫应答效率，可用作dna疫苗佐剂。附图说明图1为各组抗hbsigg浓度；图2-4为各组细胞因子表达检测结果。具体实施方式为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：酶解多肽的制备新鲜青蛤去壳取内脏，-20℃冷冻保存备用；超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；碱性蛋白酶37017(1:2.5u/g)购于诺维信公司。取青蛤肉脏匀浆破碎，置于蒸馏水中，加入碱性蛋白酶酶解(碱性蛋白酶添加质量为肉脏重量的0.3％)，酶解条件为ph值9.6，酶解温度45℃，酶解时间7小时；酶解结束后，85℃条件下水浴10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，13000转/分钟离心20分钟，取上清，依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u的超滤膜进行分级分离，收集截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥即得所述酶解多肽。实施例2：酶解多肽的免疫增强作用一、实验材料酶解多肽按照实施例1方法制备。兔igg、小鼠抗兔igg、四甲基偶氮唑(mtt)、刀豆蛋白(cona)、牛血清白蛋白(bsa)、佛波二脂(pma)、莫能菌素、多聚甲醛和皂素均为sigma公司产品；cd3、il-4、ifn-γ、cd4、cd8、igg1荧光单克隆抗体和fcγ抗体购自bd公司；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(cfse)为molecularprobes产品；胎牛血清和rpmi1640为gibco公司产品；hbsag华北制药集团提供；hbsag特异性ctl多肽s208-215ilspflpl由上海吉尔生化有限公司合成；抗hbselisa检测试剂盒购自北京金豪生物技术有限公司。二、实验方法1、乙肝质粒dna的制备将hbv前s2区和s区基因构建到真核表达载体pcdna3.0中得乙肝质粒，该质粒委托广州锐博生物科技有限公司构建，已证实可高效表达。将乙肝质粒和pcdna3.0空白质粒分别转化e.colidh5a，提取质粒，经酶切测序鉴定为阳性克隆，阳性克隆分别接种于含氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃振荡培养15h，次日按1:80扩大培养5h制备发酵培养的种子，最后转入发酵罐中发酵培养，采用大规模碱裂解法提取质粒，并用生理盐水调节浓度至1mg/ml于-20℃保存。2、动物分组和免疫方法c57bl/6小鼠随机分为3组，每组10只，分组及处理方法如下：空白质粒组：仅免疫pcdna3.0空白质粒，100μl/次/只；乙肝质粒组：仅免疫乙肝质粒，100μl/次/只；佐剂辅助组：免疫乙肝质粒+酶解多肽，乙肝质粒100μl/次/只，酶解多肽2mg/kg/次/只。免疫时，肌肉多点注射于小鼠两后股四头肌。分别在第0、2、4周免疫小鼠，第6周处死小鼠检测各项免疫学指标。3、免疫学指标检测3.1抗hbsigg浓度检测：抗hbs特异性igg含量按北京金豪生物技术有限公司抗hbselisa试剂盒说明书完成。3.2t淋巴细胞增殖：在最后一次免疫后第2周，无菌条件下分离脾细胞，通过尼龙柱除去b细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度到1×106个/ml，活细胞数在90％，每孔加入100μl细胞悬液到96孔细胞培养板上，加100μlhbsag抗原至终浓度为5μg/ml为实验组，加100μlcona至终浓度为5μg/ml为阳性对照，加100μlbsa至终浓度为2μg/ml为无关对照，100μlrpmi1640为空白对照物，实验组和对照孔各设3个重复孔，37℃、5％co2培养48h，每孔加入20μl5μg/mlmtt，37℃、5％co2培养4h，离心弃上清，每孔加入100μldmso，37℃培养15min，用酶标仪测定a570吸光值，计算刺激指数(si)。3.3细胞因子表达水平：在最后一次免疫后第2周，无菌条件下分离脾细胞，通过尼龙柱除去b细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度到5×106个/ml，每孔加入100μl细胞悬液到96孔细胞培养板上，加hbsag抗原和抗cd28抗体每孔各50μl至终浓度为5μg/ml为实验组；加100μlpma至终浓度为5μg/ml为阳性对照组，加100μlrpmi1640为空白对照组，实验组和对照孔各设3个重复孔。37℃、5％co2培养48h后，离心收集细胞，抗fcγ抗体封闭，4％多聚甲醛固定8min，0.1％皂素破膜5min，pbs洗2次，用10μl荧光单克隆抗体cd4-fitc、cd4-pe、cd8-pe、il-4-pe和ifn-γ-fitc4℃暗处染色30min，并设抗相应的同型对照，取300μl流式细胞仪检测，比较各组细胞因子表达水平。3.4体内ctl活性：在最后一次免疫后第2周，处死未经免疫的空白小鼠，分离得到脾细胞，制成单个脾细胞悬液，分成二等份作为为靶细胞，一份加1×10-6mol/lhbsag特异性ctl表位多肽s208-215刺激，一份不刺激，37℃、5％co2培养4h，离心弃上清，pbs洗1次，未刺激的靶细胞用0.5μmol/lcfse暗处染色10min，刺激的靶细胞用5μmol/lcfse暗处染色10min，加入等体积小牛血清终止染色2min，离心弃上清，pbs洗1次，最后将两种靶细胞等体积的混合，将2×107个靶细胞尾静脉注射到免疫小鼠体内，进行体内细胞毒杀伤反应，杀伤4h后处死小鼠，暗处分离得到脾细胞，取300μl流式细胞仪检测分析，计算体内ctl杀伤率(％)。4、统计学分析使用spss20.0统计学软件进行t检验，p<0.05认为差异显著。三、实验结果1、抗hbsigg浓度检测结果在最后一次免疫后2周，elisa法检测小鼠血清抗hbsigg。如图1所示，抗hbsigg检测结果显示，佐剂辅助组抗hbsigg浓度为458miu/ml，乙肝质粒组抗hbsigg浓度为264miu/ml，空白质粒组抗hbsigg浓度为62miu/ml。由此可见，佐剂辅助组抗hbsigg浓度显著高于乙肝质粒组抗hbsigg浓度和空白质粒组抗hbsigg浓度(p＜0.05)。2、t淋巴细胞增殖实验结果在最后一次免疫后2周，小鼠t淋巴细胞经hbsag刺激后，佐剂辅助组和乙肝质粒组t淋巴细胞均产生特异性增殖，明显高于空白质粒组(p＜0.05)，且佐剂辅助组又明显高于乙肝质粒组(p＜005)，各组刺激指数(si)如下表所示。空白质粒组乙肝质粒组佐剂辅助组刺激指数(si)1.4±0.32.2±0.24.5±0.33、细胞因子表达检测结果如图2-4所示，在最后一次免疫后2周，小鼠t淋巴细胞经hbsag刺激后，与乙肝质粒组相比，佐剂辅助组能够显著上调cd4+t淋巴细胞il-4和ifn-γ的表达，同时佐剂辅助组也显著增强cd8+t淋巴细胞ifn-γ的表达。4、体内ctl活性在最后一次免疫后2周，体内ctl杀伤反应经过流式细胞仪进行检测，各组体内杀伤率如下表所示，佐剂辅助组显著优于乙肝质粒组和空白质粒组：空白质粒组乙肝质粒组佐剂辅助组体内杀伤率(％)7.9±1.432.5±2.373.4±2.9综合上述实验可以看出，本发明酶解多肽可显著增强乙型肝炎dna疫苗的免疫应答效率，既可以提高体液免疫应答，又可以提高细胞免疫应答，可用作dna疫苗佐剂。上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。当前第1页12