趋化因子CXCL16与肿瘤坏死因子‑α在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及趋化因子cxcl16的新用途，特别涉及趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中的应用，在制备诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物中的应用，以及在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。

背景技术：

弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，严重危害人民健康，尚缺乏有效的治疗方式。近30年来chop方案一直是该类型淋巴瘤的标准治疗方案，fisher等的多中心前瞻性随机对照结果表明，增大剂量的第二代和第三代常规化疗方案与chop相比生存率相似，确定了chop为治疗dlbcl的金标准，但其5年生存率仅在40％左右。

本发明旨在寻求一种有效的抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖的方法，通过采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)联合作用，来抑制dlbcl细胞株的增殖，并诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡，同时治疗弥漫大b细胞淋巴瘤。然而，趋化因子cxcl16对于弥漫大b细胞淋巴瘤的生物学作用国内外尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中的应用。

本发明所要解决的技术问题在于，趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物中的应用。

本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。

为达到上述技术效果，本发明提供了一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中的应用，将趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α联合用于制备弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中。

优选地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为20-40ng/ml；所述弥漫大b细胞淋巴瘤细胞包括oci-ly1细胞、oci-ly3细胞、oci-ly8细胞、oci-ly10细胞。更佳地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为50ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为30ng/ml。

相应的，本发明还提供趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物中的应用。优选地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为10-40ng/ml；所述弥漫大b细胞淋巴瘤细胞包括oci-ly8细胞、oci-ly10细胞。更佳地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为50ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为20ng/ml。

相应的，本发明还提供一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。优选地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为10-40ng/ml。

实施本发明具有如下有益效果：

本发明采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)的联合作用，抑制dlbcl细胞株的增殖，效果显著。而且，采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)的联合作用，还可以诱导dlbcl细胞株的凋亡。因此，本发明对治疗弥漫大b细胞淋巴瘤具有重大价值。

附图说明

图1是scxcl16联合tnf-α对oci-ly-1细胞增殖的影响的示意图；

图2是scxcl16联合tnf-α对oci-ly3细胞增殖的影响的示意图；

图3是scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞增殖的影响的示意图；

图4是scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞增殖的影响的示意图；

图5是scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞的凋亡比较图；

图6是scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞凋亡流式检测图；

图7是scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞的凋亡比较图；

图8是scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞凋亡流式检测图；

图9是基于oci-ly8细胞，scxcl16联合tnf-α对凋亡蛋白表达的影响的示意图；

图10是基于oci-ly10细胞，scxcl16联合tnf-α对凋亡蛋白表达的影响的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明提供了一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中的应用，具体将趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α联合用于制备弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物中。

其中，趋化因子(chemokines，ck)是具有多种生物学功能的小分子生物活性肽。cxcl16是作为磷脂酰丝氨酸和ox-ldl的清道夫受体的多功能趋化因子。

肿瘤坏死因子-α(tnfα)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。

所述弥漫大b细胞淋巴瘤细胞包括oci-ly1细胞、oci-ly3细胞、oci-ly8细胞、oci-ly10细胞。

优选地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/m；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为20-40ng/ml。更佳地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为50ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为30ng/ml。

相应的，本发明提供了一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物中的应用，具体将趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α联合用于制备诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物中。所述弥漫大b细胞淋巴瘤细胞包括oci-ly8细胞、oci-ly10细胞。

优选地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为10-40ng/ml。更佳地，所述趋化因子cxcl16的终末浓度为50ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为20ng/ml。

相应的，本发明还提供一种趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α在制备治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物含有活性成分趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α。所述趋化因子cxcl16的终末浓度为30-60ng/ml；所述肿瘤坏死因子-α的终末浓度为10-40ng/ml。

需要说明的是，在制备抑制弥漫大b细胞淋巴瘤细胞增殖药物、诱导弥漫大b细胞淋巴瘤凋亡药物和治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物时，只需要保证其活性成分同时含有趋化因子cxcl16与肿瘤坏死因子-α，其他药物的原料可以参照现有技术。本发明制成的药物，可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。上述各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。

本发明通过采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)联合作用，来抑制dlbcl细胞株的增殖。本发明验证了该作用较单独作用效果显著，使用抗cxcr6的抗体(anti-cxcr6)可以抑制该作用，因此该作用与dlbcl细胞表面存在能与cxcl16特异性结合的受体cxcr6有关，具体如下：

一、实验过程：

(一)、体外培养4株弥漫大b细胞淋巴瘤细胞株(oci-ly1、oci-ly3、oci-ly8、oci-ly10)：

96孔板铺板：收集生长状态良好、处于对数生长期的细胞，细胞重悬后调整细胞密度2×10⁴个/ml，取无菌96孔板，加入混匀后细胞悬液100ul，每孔细胞数2000个，注意细胞的重悬混匀，这对抑制dlbcl细胞株的增殖很重要。另外，为了防止挥发培基，影响od值测定，96孔板周围一圈的孔不加样品，并添加适量灭菌pbs缓冲液或蒸馏水，以保持孔板内的湿度，避免误差。

(二)、加入下述试剂至上述细胞

按实验设计分组如下：对照组(裸细胞，con)、scxcl16组(50ng/ml)、tnf-α组(30ng/ml)，tnf-α+scxcl16组，tnf-α+scxcl16组+anti-cxcr6(先加入anti-cxcr6作用10min后加入其它试剂)。scxcl16的终末浓度50ng/ml，tnf-α终末浓度30ng/ml，anti-cxcr6终末浓度为500ng/ml。

(三)、cck-8法检测细胞增殖能力

检测步骤：避光条件下，每24h加入10ul/孔的cck-8试剂，使用十字法小心摇匀，放置培养箱内37℃孵育2-4h，在避光下条件下，分光光度计下检测od值，检测波长选择450nm。每个实验组设5个复孔，剔除最高值和最低值，留3个中间值进行od值统计学分析。

检测结果如下：

(1)scxcl16联合tnf-α对oci-ly1细胞增殖的影响

从表1及图1可见，经过成对比较，day1各组之间无统计学差异；day2-4scxcl16组与对照组(con)之间无统计学意义，提示scxcl16对ly-8的影响不大；day2-4tnf-α与con对比具有统计学意义，提示tnf-α抑制其增殖；day2-3tnf-α+scxcl16组与tnf-α差异具有统计学意义，day4两组差异具有统计学意义，提示scxcl16能联合tnf-α抑制其增殖；day2-3tnf-α+scxcl16+anti-cxcr6组与tnf-α+scxcl16组差异无统计学意义，day4两组差异具有统计学意义，提示anti-cxcr6能部分拮抗scxcl16与tnf-α的协同抑制作用。

表1scxcl16联合tnf-α对oci-ly-1细胞增殖的影响

day与group存在交互作用(f＝43.054，p＝0.000)，因此做simpleeffect检验。

调整的r²＝0.990。

(2)scxcl16联合tnf-α对oci-ly3细胞增殖的影响

从表2及图2可见，经过成对比较，day1各组之间无统计学差异；day2-4scxcl16组与con之间无统计学意义，提示scxcl16对ly-8的影响不大；day2-3tnf-α与con对比差异无统计学意义，day4两组差异具有统计学差异；day2-4tnf-α+scxcl16组与tnf-α差异具有统计学意义，提示scxcl16能联合tnf-α协同抑制其增殖；day2-4tnf-α+scxcl16+anti-cxcr6组与tnf-α+scxcl16组差异具有统计学意义，提示anti-cxcr6能拮抗scxcl16与tnf-α的协同抑制作用。

表2scxcl16联合tnf-α对oci-ly3细胞增殖的影响

day与group存在交互作用(f＝3.419，p＝0.002)，因此做simpleeffect检验。

调整的r²＝0.978。

(3)scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞增殖的影响

从表3及图3可见，经过成对比较，day1各组之间无统计学差异；day2-4scxcl16组与con之间无统计学意义，提示scxcl16对ly-8的影响不明显；day2-4tnf-α与con对比具有统计学意义，提示tnf-α抑制其增殖；day2-4tnf-α+scxcl16组与tnf-α差异具有统计学意义，提示scxcl16联合tnf-α抑制其增殖；day2-4tnf-α+scxcl16+anti-cxcr6组与tnf-α+scxcl16组差异具有统计学意义，提示anti-cxcr6能拮抗scxcl16与tnf-α的协同的抑制作用。

表3scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞增殖的影响

day与group存在交互作用(f＝25.129，p＝0.000)，因此做simpleeffect检验。

调整的r²＝0.984。

(4)scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞增殖的影响

从表4及图4可见，经过成对比较，在day1中，tnf-α+scxcl16及tnf-α+scxcl16+anti-cxcr6组与对照组差异有统计学差异；day2-4中，除了day3(p＝0.018)外，其余day中scxcl16组与con之间无统计学意义，提示scxcl16对ly-8的影响不大；day2-4tnf-α与con对比具有统计学意义，提示tnf-α抑制其增殖；day2-4tnf-α+scxcl16组与tnf-α差异具有统计学意义，提示scxcl16能联合tnf-α产生协同抑制增殖的效应；day2-3tnf-α+scxcl16+anti-cxcr6组与tnf-α+scxcl16组差异具有统计学意义，提示anti-cxcr6能拮抗scxcl16与tnf-α的协同抑制作用，day1及day4两组差异不具有统计学差异。

表4scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞增殖的影响

day与group存在交互作用(f＝31.229，p＝0.000)，因此做simpleeffect检验。

调整的r²＝0.990。

由上可知，人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)联合作用，抑制四种dlbcl细胞株的增殖，效果显著。本发明对治疗弥漫大b细胞淋巴瘤具有重大价值。

进一步，本发明通过采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)联合作用，来诱导dlbcl细胞株的凋亡。本发明验证了该作用较单独作用效果显著，使用抗cxcr6抗体(anti-cxcr6)可以逆转该作用；重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子(tnf-α)联合作用可以促进凋亡通路的3种蛋白caspase3、caspase8和bcl-xl的表达，提示该诱导凋亡的作用是通过促进凋亡蛋白表达的作用完成的。

二、实验过程：

(一)体外培养2株弥漫大b细胞淋巴瘤细胞株(oci-ly8、oci-ly10)：

96孔板铺板：收集生长状态良好、处于对数生长期的细胞，细胞重悬后调整细胞密度2×10⁴个/ml，取无菌96孔板，加入混匀后细胞悬液100ul，每孔细胞数2000个，注意细胞的重悬混匀很重要，另外，为了防止挥发培基，影响od值测定，96孔板周围一圈的孔不加样品，添加适量灭菌pbs缓冲液或蒸馏水，以保持孔板内的湿度，避免误差。

(二)加入下述试剂至上述细胞

按实验设计分组如下：对照组(裸细胞,con)、scxcl16组(50ng/ml)、tnf-α组(20ng/ml)，tnf-α+scxcl16组，tnf-α+scxcl16组+anti-cxcr6(先加入anti-cxcr6作用10min后加入其它试剂)。scxcl16的终末浓度50ng/ml，tnf-α终末浓度30ng/ml，anti-cxcr6终末浓度为500ng/ml。

(三)细胞凋亡采用pi-annexinv法进行检测。

细胞凋亡采用常规的pi-annexinv法进行检测。在结果中，流式分析散点图的四个象限代表不同状态的细胞：ul(左上象限)为死亡细胞，ur为晚期凋亡或死亡细胞(右下象限)，lr为早期凋亡细胞(右上象限)，ll为正常细胞(左下象限)。由于ur中无法区分晚期凋亡细胞和坏死细胞，因此本发明选择lr即早期凋亡率作为指标进行比较。

检测结果如下：

(1)scxcl16联合tnf-α对oci-ly8细胞凋亡的影响

采用单因素方差分析(one-wayanova)分析实验数据，方差分析结果显示各组间均数差异具有统计学意义(f＝106.30，p＝0.000)。经lsd多重比较，tnf-α+scxcl16组凋亡率均比tnf-α和scxcl16组高，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明联合应用能协同促进细胞早期凋亡；而添加抗体anti-cxcr6能拮抗这种效应(tnf-α+scxcl16+anticxcr6vs.tnf-α+scxcl16，p<0.05)，而scxcl16组与control组差异无统计学意义(p>0.05)，提示单纯外源性添加scxcl16对细胞凋亡影响不显著(详见表5、图5和图6)。

表5oci-ly8细胞不同处理组凋亡流式检测比较表(％，)

(2)scxcl16联合tnf-α对oci-ly10细胞凋亡的影响

采用单因素方差分析(one-wayanova)分析实验数据，显示各组间均数差异具有统计学意义(f＝108.54，p＝0.000)。经lsd多重比较，tnf-α+scxcl16组凋亡率均比tnf-α和scxcl16组高，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明联合应用能协同促进细胞早期凋亡；而添加抗体anti-cxcr6能拮抗这种效应(tnf-α+scxcl16+anticxcr6vs.tnf-α+scxcl16，p<0.05)，而scxcl16组vs.control组差异无统计学意义(p>0.05)，提示单纯添加scxcl16对细胞凋亡影响不显著(表6、图7-8)。

表6oci-ly10细胞不同处理组凋亡流式检测比较表(％，)

(3)scxcl16联合tnf-α促进凋亡的机制

参见图9和10，使用免疫印迹法检测oci-ly8和oci-ly10细胞在不同处理前后3种凋亡蛋白(caspase3、caspase8、bcl-xl)表达的变化。图9中，细胞为oci-ly8细胞株，1：control；2：scxcl16；3：tnf-α；4：scxcl16+tnf-α；5：scxcl16+tnf-α+anticxcr6。图10中，细胞为oci-ly10细胞株，1:control；2:scxcl16；3:tnf-α；4：scxcl16+tnf-α；5：scxcl16+tnf-α+anticxcr6。结果提示，加入tnf-α+scxcl16组后三种凋亡蛋白的表达水平较单纯添加tnf-α或单纯添加scxcl16组高，提示联合应用能诱导凋亡通路蛋白的表达；添加抗体anti-cxcr6后，tnf-α+scxcl16+anticxcr6组的三种凋亡蛋白的表达水平较tnf-α+scxcl16低，反向验证了tnf-α与scxcl16对凋亡通路的激活具有协同效应。

由上可知，采用人重组cxcl16蛋白和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的联合作用，还可以诱导dlbcl细胞株的凋亡，效果显著，且肿瘤细胞凋亡蛋白的表达上升，深入揭示了抑制增殖、促进凋亡的机制。本发明对治疗弥漫大b细胞淋巴瘤具有重大价值。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。