一种具有活血利尿作用的药物及其应用的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体是一种具有活血利尿作用的药物及其应用。
背景技术：
：医圣张仲景在《金匮要略》中首创瘀血证名并明确提出“血不利则为水，血水本同源”的理论，不仅明确了“血与水”的生理和病理关系，也为“活血利水”法的创建及其临床应用提供了理论依据。“活血利水”法可以分为“活血化瘀”和“活血利尿”两类，前者是通过代谢作用减少机体内部多余的水液，而后者是通过尿液将机体内部多余的水液排泄出体外。利尿类药是一类促进肾脏排出溶质及水而增加尿量的药物，广泛应用于肾、肝、心等疾病引起的水肿及腹水。目前常用的噻嗪类利尿剂效果显著，但毒副作用较大，甚至可引起心律失常、动脉硬化、冠心病和糖尿病等。相比之下，中药由于多成分、多靶点等优点使得毒副作用大大减少。中医对于水肿的认识已久并广泛应用于临床治疗各类疾病，而通过活血利尿法用于治疗慢性肾炎、肝硬化等引起的水肿及肾功能衰竭、遗尿症等。水通道蛋白aqps广泛分布于哺乳动物中，促进水分子顺渗透压梯度转运穿过红细胞膜，在维持机体水分子平衡和内环境稳态中发挥重要作用。其中aqp1是在人体分布最广泛的水通道蛋白之一，参与水的重吸收及尿液浓缩；aqp2在肾脏主要表达于远端小管和集合管主细胞顶膜，受抗利尿激素调控以调节集合管的水通透性，在调节肾脏水平衡中起重要作用，主要参与尿液的浓缩和稀释；而aqp3存在于集合管基底侧质膜，主要参与尿液的浓缩和稀释。此外，肾素-血管紧张素系统是人体重要的体液调节系统，由一系列的激素及相应的酶类物质组成，包括血浆醛固酮(ald)、血管紧张素ⅱ(angⅱ)、抗利尿激素(adh)、心钠素(anp)等，对于维持电解质、体液平衡和心血管功能稳态具有重要的作用。因此，本申请中以肾组织的病理学观察、尿量、尿液中ph和钠钾氯离子浓度、血清和尿液中ald、angⅱ、adh和anp的含量、肾组织和尿液中水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的含量，以肾组织和局部损伤肌肉组织中水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的表达水平为指标探讨夏至草总提取物活血利尿的作用及分子机制。夏至草是唇形科夏至草属多年生草本植物夏至草lagopsissupina(steph)ik.gal.的干燥全株。夏至草又名白花夏枯草、小益母草、假茺蔚、假益母草等，广泛分布我国各地。据《中华本草》载，夏至草味辛、微苦，性寒，归肝经，具有养血活血、清热利湿之功效，主治月经不调、产后瘀滞腹痛、跌打损伤等疾病。夏至草除了作为中药使用外，还广泛使用于藏医和蒙医药学中，具有抗炎和利尿的功效，用于治疗沙眼、结膜炎和遗尿症等。现代研究表明，夏至草提取物具有改善血液和淋巴微循环障碍、心肌保护、抗氧化、抗病毒、抑制α-葡萄糖苷酶、减少no的产生等作用，然未有关于夏至草提取物具有活血利尿作用的研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种无毒副作用、制备工艺简便、提取率高的具有活血利尿作用的药物及其应用，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有活血利尿作用的药物，其有效成分为夏至草全株乙醇提取物浸膏。作为本发明进一步的方案：夏至草全株乙醇提取物浸膏的制备过程是：以夏至草的全株作为原料，加入其质量8-12倍的体积浓度50-95％乙醇冷浸提取3次，或加入其质量8-12倍的体积浓度50-95％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2-3次，每次加热回流提取时间为2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，即得夏至草全株乙醇提取物浸膏。作为本发明进一步的方案：冷浸提取3次的具体过程是称取夏至草全株，用其质量8-12倍的体积浓度95％乙醇冷浸7天，过滤提取液后，药渣依次用其质量8-12倍的体积浓度95％和50％乙醇冷浸2次，每次3天，合并提取液。本发明另一目的是提供所述药物在制备活血利尿药物中的应用。作为本发明进一步的方案：活血利尿药物为治疗包括慢性肾炎或肝硬化引起的水肿及肾功能衰竭或遗尿症的药物。作为本发明进一步的方案：活血利尿药物为治疗慢性肾炎引起的水肿及遗尿症的药物。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明中夏至草为唇形科夏至草属多年生草本植物夏至草lagopsissupina(steph)ik.gal.的干燥全株。夏至草除了作为中药使用(主治月经不调、产后瘀滞腹痛、跌打损伤等疾病)外，还广泛使用于藏医和蒙医药学中，具有抗炎和利尿的功效，用于治疗沙眼、结膜炎和遗尿症等，具有很好的临床用药基础，其特点在于应用了植物的全株。本发明以“定量打击”法制备血瘀模型，评价模型夏至草全株乙醇提取物浸膏活血利尿作用，具有很好的治疗作用。2、本发明药物夏至草全株乙醇提取物浸膏无毒副作用。3、本发明药物夏至草全株有效提取部位，制备工艺简便，提取率高，为该药物的工业化生产，提供了很好的基础。4、本发明药物夏至草全株，广泛使用于中医、蒙医和藏医药学中，资源十分丰富，有利于夏至草产业及区域经济的发展。附图说明图1是本发明中各组大鼠7天内尿量比较(x±s，n＝10)；图2是本发明中各组大鼠肾脏髓质水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的蛋白表达情况；图3是本发明中各组大鼠局部损伤肌肉组织水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的蛋白表达情况。图4为本发明中正常组大鼠肾组织he染色(×400)示意图。图5为本发明中模型组大鼠肾组织he染色(×400)示意图。图6为本发明中药物组大鼠肾组织he染色(×400)示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为证实本发明提取物的活血利尿作用，本发明以“定量打击”法制备血瘀模型，考察了夏至草全株95％乙醇提取物浸膏的活血利尿作用。结果表明，夏至草全株乙醇提取物浸膏对模型大鼠具有很好的活血利尿作用。具体过程描述如下：实施例1本发明实施例中，称取夏至草全株28.7kg，用其质量8-12倍的体积浓度95％乙醇冷浸7天，过滤提取液后，药渣依次用8-12倍量95％和50％乙醇冷浸2次，每次3天，合并3次提取液，减压浓缩至无醇味，得到夏至草全株乙醇提取物浸膏。实施例2本发明实施例中，称取夏至草全株28.7kg，用8-12倍量95％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2-3次，每次2h，药渣再用50％乙醇加热回流提取2-3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得到夏至草全株乙醇提取物浸膏。1.制备方法参见实施例1-2制得的夏至草全株乙醇提取物浸膏。2.材料与方法2.1材料与试剂夏至草全株乙醇提取物浸膏，见实施例1、实施例2。ald、angⅱ、adh、anp、aqp1、aqp2和aqp3测定试剂盒，均购自南京森贝伽生物科技有限公司；qp1、aqp2和aqp3抗体均购自武汉博士德生物公司；磷酸酶抑制剂、ripa裂解液、bca蛋白浓度测定试剂盒抗体均购自碧云天生物技术有限公司；显影定影试剂盒购自天津市汉中摄影材料厂；x光胶片购自柯达公司；伊红y(水溶性)、无水乙醇、二甲苯、盐酸、包埋石蜡、中性树胶均购自国药集团。2.1.1仪器高速冷冻离心机，购自美国beckman-coulter公司；超低温冰箱，购自美国thermo公司；电热恒温水温箱，购自上海博迅实业有限公司；电子天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热恒温培养箱，购自日本asone公司；全自动酶标仪，购自美国thermo公司；微量移液器，购自德国eppendorf公司；电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪，购自北京六一仪器厂；水平摇床，购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；ph计，购自德国metter-toledogmbh公司；磁力搅拌器，购自江苏省金坛市中大仪器厂；病理切片机，购自德国leicarm2016轮转式切片机；切片刀，购自日本羽毛r35一次性刀片；组织摊烤片机，购自武汉俊杰jk-6生物组织摊烤片机；载玻片及盖玻片，购自江苏世泰实验器材有限公司；显微镜，购自奥林巴斯bx53型生物显微镜。2.1.2实验动物30只spf级雄性sd大鼠，三峡大学实验动物中心，许可证号：scxk(鄂)2011-0012，适应性实验3天后进行实验。2.2实验方法将30只sd大鼠随机分为两组：正常组(10只)与血瘀证组(20只)，将20只血瘀证组大鼠再分为2组：药物组和模型组。将血瘀证组20只大鼠固定于木板上，500g砝码固定在58cm的高处自由落下，使砝码打击在大鼠右后肢后内侧中上部(势能大约为2.86j，打击面积约19.2cm2)。大鼠打击后单侧跛行且无明显皮肤破损及出血、无明显骨折者确认造模成功。造模成功后当日药物组按2g/(kg·d)(按生药量计算)灌服给药；正常组和模型组生理盐水按2ml/(kg·d)灌服；1次/日，连续给药7d。将收集到的7d尿液倒于量筒中，测定尿量、ph、k+、na+、cl-的浓度，按照各个试剂盒说明书进行测定大鼠尿液中aqp1、aqp2和aqp3的含量。第7d给药后1h眼眶取血，全血5000转/分离心10min，取上层血清，按照各个试剂盒说明书进行测定ald、angⅱ、adh、anp的含量。断颈脱臼致死，取出肾脏，剪取肾髓质，称重，置5ml离心管中，加入9倍量的pbs匀浆缓冲液，高速离心(3000r/min)，取其上清液，采用westernblot法检测aqp1、aqp2和aqp3的表达情况；用预冷pbs冲洗组织，然后将组织剪碎，使用匀浆器按质量体积比1:9匀浆，制备成10％的组织匀浆液，3000g离心5～10分钟，去上清检测，按照各个试剂盒说明书进行测定大鼠组织中aqp1、aqp2和aqp3的含量，采用westernblot法检测aqp1、aqp2和aqp3的表达情况。3.实验结果表1本发明中各组大鼠7天内尿量的含量变化情况(ml)注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01从表1中可知，模型组与正常组尿量基本上没有太大的差别；药物组与模型组相比，尿量显著升高(p＜0.05或p＜0.01)，说明夏至草全株乙醇提取物浸膏具有较强的利尿作用。表2本发明中各组大鼠尿液中ph值及k+、na+、cl-的含量变化情况注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表2中可知，与正常组比较，模型组大鼠尿液中ph值显著降低(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著升高大鼠尿液中ph值(p＜0.01)。与正常组比较，模型组大鼠尿液中k+、na+、cl-的浓度均有显著降低(p＜0.05或p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著减低大鼠尿液中na+的浓度(p＜0.01)、增加大鼠尿液中cl-的浓度(p＜0.01)。表3本发明中各组大鼠血清中ald、angⅱ、adh和anp的含量变化情况注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表3中可知，与正常组比较，模型组大鼠血清中anp的含量降低(p＜0.05)；与模型组比较，药物组可显著提高大鼠血清中anp的含量(p＜0.01)。与正常组比较，模型组大鼠血清中adh和ald的含量升高(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠血清中adh和ald的含量(p＜0.05)。表4本发明中各组大鼠尿液中ald、angⅱ、adh和anp的含量变化情况注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表4中可知，与正常组比较，模型组大鼠血清中anp的含量降低(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著提高大鼠血清中anp的含量(p＜0.01)。与正常组比较，模型组大鼠血清中angⅱ、adh和ald的含量升高(p＜0.05或p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠血清中angⅱ、adh和ald的含量(p＜0.05或p＜0.01)。表5本发明中各组大鼠尿液中水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的含量变化情况注：与药物组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表5中可知，与正常组比较，模型组大鼠尿液中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的含量显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠尿液中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的含量(p＜0.05或p＜0.01)。表6本发明中各组大鼠肾脏髓质水通道蛋白aqp1、aqp2和aqp3的含量变化情况注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表6中可知，与正常组比较，模型组大鼠肾组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的含量显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠肾组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的含量(p＜0.05或p＜0.01)。表7本发明中各组大鼠肾脏髓质水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的相对含量变化情况组别aqp1/gapdhaqp2/gapdhaqp3/gapdh正常组0.38±0.060.22±0.030.25±0.03模型组0.70±0.08##0.31±0.01##0.41±0.06##药物组0.52±0.08*0.27±0.02*0.31±0.02*注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表7中可知，与正常组比较，模型组大鼠肾脏髓质水通道蛋白中aqp1、aqp2、aqp3的相对表达量显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠肾脏髓质水通道蛋白中aqp1、aqp2、aqp3相对表达量(p＜0.05)。表8本发明中各组大鼠局部损伤肌肉组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的相对含量变化情况注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。从表8中可知，与正常组比较，模型组大鼠局部损伤肌肉组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的相对表达量升高(p＜0.01)；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠损伤肌肉组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3相对表达量(p＜0.05或p＜0.01)。从图2中可知，与正常组比较，模型组大鼠肾脏髓质水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的蛋白表达量明显增高；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠肾脏髓质水通道蛋白中aqp1、aqp2、aqp3的蛋白表达。从图3中可知，与正常组比较，模型组大鼠局部损伤组织中水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的蛋白表达量明显增高；与模型组比较，药物组可显著降低大鼠局部损伤肌肉组织中水通道蛋白中aqp1、aqp2、aqp3的蛋白表达。从图4-6中可知，正常组光镜下组织结构清晰，皮质肾小球和肾小管排列规则，肾小球和肾小囊体积、囊腔腔隙正常，近曲小管上皮细胞结构正常。模型对照组光镜下可见部分肾小球皱缩，肾小管上皮细胞肿胀、变性，部分肾小管上皮细胞出现坏死脱落，毛细血管淤血，肾间质有炎性细胞聚集。药物组肾组织结构较清晰，肾小球和肾小管排列规则，肾小球体积稍大，囊腔腔隙较正常，近曲小管结构清晰，肾小管上皮细胞结构较正常。综合表5、表6、表7、表8、图2、图3、图4、图5、图6可知，夏至草全株乙醇提取物浸膏具有较好的活血利尿作用，并提示其可能的作用机制是通过下调水通道蛋白aqp1、aqp2、aqp3的表达有关。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12