凝血因子XI靶标的免疫细胞和疫苗及治疗代谢综合症的用途的制作方法

本发明属于生物和医药技术领域，涉及凝血因子xi靶标的免疫细胞和疫苗的用途，尤其是涉及凝血因子xi靶标的免疫细胞和疫苗在治疗代谢综合症方面的用途。

背景技术：

近年来，随着社会经济的发展和人民生活水平的不断提高和体力活动减少，代谢综合症的患病率逐年上升，是心脑血管疾病的直接诱因，是严重危害人类身体健康的隐形杀手。代谢综合症表现为一系列物质代谢异常，包括肥胖、高血压、高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常等。其中，肥胖是最严重的公共健康问题之一。据统计，从1980年到2013年，全球超重的成年人和儿童数目已分别增加了27.5%和47.1%，目前全球超重及肥胖人数达21亿人（canadianjournalofcardiology,2015,31(2)）。由肥胖引起的一系列疾病，包括ii型糖尿病，心血管疾病，肝脂肪变性，气道疾病，神经退行性疾病，胆道疾病，和某些癌症等，是导致寿命减少和过早死亡的主要原因，因此减肥治疗意义重大。

治疗肥胖的药物主要包括orlistat,lorcaserin，benzphetamine，phentermine，diethylpropion或者phendimetrazine等。这些药物通过抑制与能量摄取或代谢相关的激素受体（5-羟色胺（5-ht）2c受体、多巴胺/去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸受体、胰高血糖素样肽-1受体、μ-阿片受体）或者阻断脂肪酶的功能发挥减肥效果（metabolism-clinicalandexperimental,2015,64(11):1376-1385）。由于这些药物靶点也参与调控正常生理机能，病人服用这类药物往往具有多种毒副作用，包括头痛、焦虑、心动过速、高血压、口干、呕吐、焦虑、失眠、便秘等（currentopinioninendocrinologydiabetesandobesity,2015,22(2):91-97）。

因此，本领域迫切需要寻找新的疾病靶点，开发新型药物，在有效治疗代谢综合症的同时，具有较好的临床安全性和耐受性。

wo2014/183649a1和cn105705522a专利公开了一种针对凝血因子xi的疫苗，疫苗抗原为将人凝血因子xi的催化结构域融合到白喉毒素转位结构域的羧基端构成，被命名为29号抗原（在本发明中该抗原被命名为dtt-hfxic）。该发明所述29号抗原免疫小鼠，可提供显著的抗血栓保护效果，可显著抑制组织因子诱导的致死肺栓塞，使小鼠发生呼吸困难的时间延长1.5倍，也可显著抑制下腔静脉诱导的血栓，使栓子湿重减轻60%。但是，针对凝血因子xi的疫苗治疗代谢综合征方面的应用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可有效治疗代谢综合症的重组蛋白和组合物（如疫苗组合物）和免疫细胞制剂。

本发明的第一方面，提供一种携带凝血因子xi结构元件和载体蛋白的重组蛋白和靶向凝血因子xi的免疫细胞制剂。

进一步的，所述凝血因子xi来源为人或者非人哺乳动物，成分包括凝血因子xi的b细胞表位、催化结构域、结合结构域或者完整蛋白。其中一个优选例为人凝血因子xi的催化结构域（凝血因子xi的氨基酸残基363-607）。

进一步的，所述载体蛋白非来自凝血因子xi，且包含至少一个t细胞表位，可以增强抗原的免疫原性，包括白喉毒素dt、白喉毒素的转位结构域dtt、轮状病毒vp7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、钥孔戚血蓝素（keyholelimpethemocyanin，klh）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，bsa），鸡卵白蛋白（ovalbumin，ova），纤维蛋白原、多聚赖氨酸(pll)、破伤风毒素（tt）和crm197。其中一个优选例为白喉毒素的转位结构域（氨基酸残基202-307，简称为dtt）。

进一步的，所述重组蛋白的构成方式，包括凝血因子xi的b细胞表位通过拼接、替换、和/或插入引入到载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区，以及凝血因子xi的结构域或者完整蛋白通过拼接或者化学交联的方式连接到至少一个载体蛋白上。其中一个优选例为人凝血因子xi的催化结构域拼接到载体蛋白dtt的c末端，该重组蛋白简称为dtt-hfxic。

进一步的，所述dtt-hfxic重组蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步的，所述dtt-hfxic重组蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码第一方面所述的

重组蛋白。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的多

核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第三方面所述的

表达载体，或者在基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、cho细胞、dc细胞等。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的组合物含有第一方面所述的

重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

本发明的第六方面，提供一种疫苗组合物，所述的组合物含有第一方面所述的

重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为核酸疫苗组合物，所述核酸疫苗组合物中

包含第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氢氧化铝、氧化铝、皂苷、quila、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或deae葡聚糖、细胞因子(包括il-1、il-2、ifn-r、gm-csf、il-6、il-12和cpg)，其中一个优选例为氢氧化铝。

本发明的第七方面，提供第一方面所述的重组蛋白的用途，(a)用于制备针对所述抗原表位的抗体；和/或(b)用于制备治疗与凝血因子相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的疾病为代谢综合症，包括肥胖、胰岛素抵抗、高胆固醇血症和高谷丙转氨酶。

本发明的第八方面，提供一种治疗方法，给需要的对象施用第一方面所述的重

组蛋白、免疫细胞制剂、第五方面所述的药物组合物或第六方面的疫苗组合物。

本发明的第九方面，提供一种靶向凝血因子xi的免疫细胞制剂的制备方法。

现有减肥药物具有多种毒副作用，包括头痛、焦虑、心动过速、高血压、口干、呕吐、焦虑、失眠、便秘等（currentopinioninendocrinologydiabetesandobesity,2015,22(2):91-97）。抗原dtt-hfxic对正常饮食的小鼠免疫接种，不改变小鼠的体重、血糖和血总胆固醇，也不影响小鼠的精神和活动。因此，与现有减肥药物相比，抗原dtt-hfxic免疫减肥疗法可能具有更好的安全性。

另外，与传统小分子药物相比，疫苗具有多项优点，尤其是药效持续时间长（数月-数年）、给药频率低（2-3次/年），因此具有用药方便和依从性高的优点。

附图说明

图1显示了免疫对肥胖小鼠体重的影响。小鼠分别在第0、14、28和92天分别进行免疫接种，记录小鼠的体重。免疫治疗过程中小鼠依旧维持高脂饮食。箭头指示免疫接种的时间。

图2显示了dtt-hfxic免疫改善肥胖小鼠糖耐量受损。免疫接种的时间点见图1，在第四次免疫后一周，进行腹腔葡萄糖耐量试验。

具体实施方式

肥胖状态的一个重要特征是血液中凝血相关因子水平升高。kaye,s.m.等比较胖瘦程度不一的同卵双生的双胞胎血清中凝血因子水平，他们发现在胖的人血液中fxi水平显著高于瘦的人，而且fxi水平跟内脏脂肪含量、炎症水平、胰岛素水平显著正相关（obesity(silverspring),2012,20(1):88-94），提示fxi跟肥胖和代谢紊乱可能存在内在联系。此外，炎症是肥胖发展以及多种肥胖相关疾病的重要促进因素，抗炎治疗可有效治疗胰岛素抵抗和脂肪肝（diabetesresclinpract,2014,105(2):141-150）。fxi参与炎症反应，抑制fxi可以显著抑制小鼠盲肠结扎穿孔诱导的症炎症反应（blood,2012,119(20):4762-4768）。基于以上分析，提出本发明内容，即检测免疫抑制fxi对肥胖和肥胖相关糖脂代谢功能紊乱的治疗效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明所述的靶向fxi的重组蛋白质抗原，由人fxi的催化结构域（氨基酸残基363-607）融合到白喉毒素转位结构域（氨基酸残基202-378）的c末端构成，被命名为dtt-hfxic。该抗原的载体构建、蛋白表达鉴定及规模化制备参见本申请人的国际专利（针对低免疫原性蛋白的表位疫苗及其制法和用途.申请号：pct/cn2014/077522.公开号：wo2014/183649a1）和论文（jthrombhaemost,2017,15(1):122-130）。

实施例1肥胖小鼠造模

5周龄雄性c57bl/6j小鼠（spf级别）购入后先适应性饲养一周，饲养条件为：spf级屏障环境，环境温度为20-26°c，相对湿度为~50%，12h/12h昼夜交替，自由摄食饮水。一周后对照组小鼠依旧给予正常饲料（记为lfd组小鼠），模型组小鼠给予60%脂肪供能饲料（记为hfd组小鼠），水、食自由摄取。饲养3个月后，对所有小鼠称重并根据公式1计算hfd组每只小鼠的肥胖度。隔夜禁食（不禁水）后，对小鼠断尾采血，通过稳择易型血糖仪（强生）测定空腹小鼠血糖值；通过眼眶静脉丛采血制备血清，分别通过总胆固醇（tc）测定试剂盒（单试剂gpo-pap法）和甘油三酯（tg）测定试剂盒（单试剂gpo-pap法）测定血清中总胆固醇和甘油三酯含量。

肥胖度=（实际体重-lfd组平均体重）/lfd组平均体重×100%……………………….………..公式1

经3个月60%高脂饲料饲养后，hfd小鼠体重达到44.5±3.8g，显著高于lfd小鼠的（29.3±1.1g）。hfd小鼠中体重最轻为43g，肥胖度为55.2%，该组所有小鼠的肥胖度均大于20%，小鼠肥胖模型造模成功。

进一步检测发现，hfd小鼠空腹血糖达到9.1±2.2mm，显著高于lfd小鼠的（7.2±0.6mm）。此外，虽然空腹血清甘油三酯水平和lfd小鼠的接近，但是hfd小鼠的血清总胆固醇水平（6.8±1.1mm）显著高于lfd组小鼠的（3.8±0.4mm）。该结果表明，长期的高脂饮食还导致明显的糖代谢和脂代谢功能紊乱。

实施例2抗原制备和动物免疫接种

参考alhydrogeladjuvant2%（invivogen）说明书用氢氧化铝佐剂吸附抗原。具体操作为：抗原dtt或dtt-hfxic用无菌pbs稀释至0.6mg/ml，2%alhydrogel佐剂（氢氧化铝凝胶）用无菌pbs稀释1倍。稀释后的抗原与氢氧化铝佐剂按体积比1比1在ep管中混匀，让抗原充分吸附到佐剂上。

hfd组小鼠分为三组，让各组小鼠的平均体重、血糖和血总胆固醇都没有显著差异。之后，对三组小鼠分别皮下注射免疫，具体操作为：采用背部皮下多点注射的方法进行免疫接种，每只小鼠注射200μl抗原-佐剂混合物（含60μg抗原），间隔两周加强免疫一次，共免疫三次。对照小鼠按相同方法注射200μlpbs。

实施例3抗原dtt-hfxic免疫降低小鼠体重

我们首先对hfd小鼠做了三次免疫（图1第0天~第35天），每两周免疫一次，每次免疫后一周对小鼠称重。在第二次免疫后一周（第21天），dtt-hfxic组小鼠的体重（45.4±0.7g）显著低于pbs组小鼠的（48.5±1.1g）。该结果说明dtt-hfxic免疫对高脂饮食诱导的肥胖可显著减重。

第三次免疫后17天（第45天），dtt组及dtt-hfxic组小鼠体重开始回升，尤其dtt组小鼠的体重已经接近于pbs组小鼠的。之后三组小鼠以相似的速度积累体重（第45天~第92天）。疫苗类药物跟其它药物比，最大的优势之一在于可通过加强免疫重新获得药效。确实，第92天进行一次加强免疫，pbs组小鼠体重依旧持续增加，dtt组小鼠的体重（55.2±0.7g）轻微下降但与pbs组的（57.4±1.6g）无显著差异，但dtt-hfxic组小鼠体重（52.7±0.9g）则显著低于pbs组小鼠的（图1）。该结果说明药效消退后，可通过加强免疫重新获得减重效果。

另外，在治疗结束后，pbs组小鼠的体增重达到21.1±7.4%，dtt组小鼠的（15.8±3.4%）轻微低于pbs组的，但是dtt-hfxic组小鼠的体增重（10.5±5.1%）则显著低于pbs组的，与lfd组小鼠的体增重（9.1±5.1%）相近。该结果说明dtt-hfxic能显著抑制高脂饮食诱导的体重增长。

实施例4抗原dtt-hfxic免疫激发产生针对fxi特异的抗体反应

能激发产生抗体是疫苗有效的物质基础，因此在免疫接种后我们首先检测抗体产生情况。在第一次免疫后一周，dtt-hfxic已经能激发产生显著的抗小鼠fxi的抗体（od450为0.32±0.14，对照组od450为0.07±0.04），说明dtt-hfxic也能帮助肥胖小鼠打破针对fxi的免疫耐受。通过加强免疫可有效提高抗体反应，在第四次免疫后一周（免疫接种时间如图1所示），抗小鼠fxi的抗体反应进一步升高（od450为0.74±0.13，对照组od450为0.07±0.04）。

实施例5抗原dtt-hfxic免疫抑制脂肪细胞肥大

与lfd组相比，长期高脂饮食诱导小鼠腹部脂肪堆积，属于腹型肥胖（centraladiposity），这跟人体肥胖情况相似。尽管hfd小鼠都有明显的腹型肥胖，但是与dtt组和pbs组小鼠相比，dtt-hfxic组小鼠腹部脂肪堆积明显减少。该结果说明dtt-hfxic免疫一定程度上能减轻小鼠腹型肥胖。

肥胖的发生主要是因为脂肪细胞数目增多（hyperplasia）和脂质在包浆中聚集造成脂肪细胞体积增大（hypertrophy）。在长时间高脂饮食的维持下，hfd小鼠的脂肪细胞明显肥大。用脂肪细胞的直径对脂肪细胞的体积定量，lfd和hfd+pbs小鼠的脂肪细胞平均直径分别为91.6±4.8μm和146.1±11.1μm，hfd+pbs小鼠的脂肪细胞平均直径显著大于lfd小鼠的。hfd小鼠中，dtt组的脂肪细胞平均直径（130±10.2μm）与pbs组的没有显著差别，但是dtt-hfxic组的脂肪细胞直径（112.5±6.1μm）则显著低于pbs组的。该结果表明dtt-hfxic免疫能抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖细胞肥大。

实施例6抗原dtt-hfxic免疫改善受损的葡萄糖耐量

内脏脂肪堆积造成的腹型肥胖是引起代谢综合症的主要原因，而脂肪细胞大小被认为跟机体代谢状况直接相关，更小的脂肪细胞体积对应于更好的胰岛素敏感性。因此我们进一步检测小鼠的糖和脂代谢功能。

首先通过葡萄糖耐量试验检测各组小鼠对糖的调控功能是否正常。腹腔注射葡萄糖两小时后，lfd组小鼠的血糖能降到给糖前水平（8.5±0.1vs.7.5±0.8mm），但是hfd+pbs组小鼠的则不能（10.6±1.1vs.15.6±2.2mm）（图2），该结果说明长期高脂饮食让小鼠发生糖耐量受损，这与文献报道的一致。

在hfd小鼠中，腹腔注射葡萄糖两小时后，dtt组小鼠的血糖也不能降到给糖前水平（11.6±1.3vs.14.0±2.1），但是dtt-hfxic组小鼠的血糖能降到给糖前水平（9.7±0.4vs.10.8±0.6）（图2），该结果说明dtt-hfxic免疫能显著改善高脂饮食诱导的葡萄糖耐量受损。

实施例7抗原dtt-hfxic免疫降低血总胆固醇

hfd+pbs组小鼠血液中的总胆固醇含量显著高于lfd组小鼠的（6.8±1.2vs.3.1±0.5mm），该结果表明持续高脂饮食导致小鼠发生了脂代谢紊乱。

在hfd小鼠中，dtt组小鼠的血总胆固醇含量轻微低于pbs组的（没有显著差异），但是dtt-hfxic组小鼠的血总胆固醇含量显著低于pbs组的，与pbs组比降低32.9%。该结果说明dtt-hfxic免疫能显著降低高脂饮食诱导的脂代谢紊乱。

实施例8抗原dtt-hfxic免疫降低肝脏损伤

hfd小鼠血液中总胆固醇和甘油三酯含量均显著高于lfd小鼠，提示长期高脂饮食导致小鼠脂代谢功能紊乱，考虑到肝脏是脂肪合成和代谢最主要的器官之一，我们猜想有可能小鼠肝脏已发生病变。的确，虽然hfd+pbs组小鼠血液中ast含量跟lfd小鼠的相近），但是alt的含量显著高于lfd小鼠的（23.4±5.7vs.3.6±1.2mm）。该结果说明高脂饮食导致小鼠轻度肝损伤。

在hfd小鼠中，dtt组小鼠血液中alt含量轻微低于pbs组小鼠的（没有显著差异），但是dtt-hfxic组小鼠血液中的alt水平显著低于pbs小鼠的，与pbs组相比降低64.8%。该结果表明dtt-hfxic免疫能显著降低高脂饮食诱导的小鼠肝脏损伤。

实施例9抗原dtt-hfxic免疫不影响正常小鼠体重、血糖和血脂

为检测抗原免疫对正常小鼠的影响，经普通饲料饲养的小鼠（lfd小鼠），也分别用pbs、dtt或dtt-hfxic免疫，其余操作同hfd小鼠。dtt-hfxic免疫组小鼠的体重和体重增长速度跟pbs组或dtt组小鼠的没有差别。在免疫结束后（第四次免疫后7天），dtt-hfxic免疫组小鼠的空腹血糖（5.9±1.2vs.6.1±0.5mm）和血液总胆固醇（3.1±2.1vs.3.2±1.5mm）跟pbs组或dtt组小鼠的一致。该结果说明dtt-hfxic免疫并不影响正常小鼠的体重，也不干预正常的脂肪和糖代谢。这提示未来dtt-hfxic疫苗用于正常个体将是安全的，不会干扰正常的糖脂代谢功能。

实施例10靶向凝血因子xi的免疫细胞制备

（1）血液采集和制备外周血单个核细胞（pbmc）

一次性采集患者外周全血约50ml左右。在符合gmp要求试验条件下，于超净工作台上，分离新鲜的患者抗凝外周全血，经ficoll淋巴分离液梯度离心（800g×15min），此时离心管由上至下分为四层：第一层为新鲜血浆，第二层为环状乳白色pbmc，第三层为透明淋巴分离液，第四层为红细胞及其它细胞。用毛细管小心吸取第二层pbmc，用pbs缓冲液悬浮细胞，再次离心（500g×10min），反复洗涤细胞3次后，所采得即为纯净pbmc细胞，细胞总数约为1×10⁸个。

（2）体外免疫刺激pbmc，制备靶向凝血因子xihfxic的免疫细胞

用含0.25mmllme的10%fbs/erdf稀释制备的pbmc至细胞密度为1×10⁷细胞/ml；室温孵育细胞20min，之后400×g离心7min，去上清；用10%fbs/erdf重悬细胞，400×g离心7min，去上清；用10%fbs/erdf重悬细胞，400×g离心7min，去上清；用含50mm2-巯基乙醇、1mmd型cpg、il-2（10units/ml）、il-4（10ng/ml）的10%fbs/erdf重悬pbmc，转移至48孔板，每孔500μl，含细胞数为0.5-1.0×10⁷细胞，培养7天，此时可以看到细胞集落；加入溶于pbs的dtt-hfxic抗原（10μg），37℃培养3天；加入k型cpg（终浓度1mm），37℃培养4天；3,400×g离心1min，收集细胞，即为凝血因子xi靶向的免疫细胞。

重组蛋白dtt-hfxic核苷酸序列（seqidno.1）：

ataaatcttgattgggatgtcataagggataaaactaagacaaagatagagtctttgaaagagcatggccctatcaaaaataaaatgagcgaaagtcccaataaaacagtatctgaggaaaaagctaaacaatacctagaagaatttcatcaaacggcattagagcatcctgaattgtcagaacttaaaaccgttactgggaccaatcctgtattcgctggggctaactatgcggcgtgggcagtaaacgttgcgcaagttatcgatagcgaaacagctgataatttggaaaagacaactgctgctctttcgatacttcctggtatcggtagcgtaatgggcattgcagacggtgccgttcaccacaatacagaagagatagtggcacaatcaatagctttatcatctttaatggttgctcaagctattccattggtaggagagctagttgatattggtttcgctgcatataattttgtagagagtattatcaatttatttcaagtagttcataattcgtataatcgtcccaccaccaaaatcaagcccaggatcgttggaggaactgcgtctgttcgtggtgagtggccgtggcaggtgaccctgcacacaacctcacccactcagagacacctgtgtggaggctccatcattggaaaccagtggatattaacagccgctcactgtttctatggggtagagtcacctaagattttgcgtgtctacagtggcattttaaatcaatctgaaataaaagaggacacatctttctttggggttcaagaaataataatccatgatcagtataaaatggcagaaagcgggtatgatattgccttgttgaaactggaaaccacagtgaattacacagattctcaacgacccatatgcctgccttccaaaggagatagaaatgtaatatacactgattgctgggtgactggatgggggtacagaaaactaagagacaaaatacaaaatactctccagaaagccaagatacccttagtgaccaacgaagagtgccagaagagatacagaggacataaaataacccataagatgatctgtgccggctacagggaaggagggaaggacgcttgcaagggagattcgggaggccctctgtcctgcaaacacaatgaggtctggcatctggtaggcatcacgagctggggcgaaggctgtgctcaaagggagcggccaggtgtttacaccaacgtggtcgagtacgtggactggattctggagaaaactcaagcagtg

重组蛋白dtt-hfxic氨基酸序列（seqidno.2）：

inldwdvirdktktkieslkehgpiknkmsespnktvseekakqyleefhqtalehpelselktvtgtnpvfaganyaawavnvaqvidsetadnlekttaalsilpgigsvmgiadgavhhnteeivaqsialsslmvaqaiplvgelvdigfaaynfvesiinlfqvvhnsynrpttkikprivggtasvrgewpwqvtlhttsptqrhlcggsiignqwiltaahcfygvespkilrvysgilnqseikedtsffgvqeiiihdqykmaesgydiallklettvnytdsqrpiclpskgdrnviytdcwvtgwgyrklrdkiqntlqkakiplvtneecqkryrghkithkmicagyreggkdackgdsggplsckhnevwhlvgitswgegcaqrerpgvytnvveyvdwilektqav