富含氢气的水溶液改善电离辐射导致认知功能损伤的用途的制作方法

本发明属于辐射防护
技术领域：
，涉及富含氢气的水溶液改善电离辐射导致认知功能损伤的用途。
背景技术：
：近年来，针对头颈部原发肿瘤及转移肿瘤患者的多模式诊疗手段大大提高了患者生存率，延长了患者的生存时间，尤其是放射治疗，成为肿瘤病人的主要治疗手段之一。但是放疗在杀死肿瘤细胞的同时会对照射范围内的正常细胞造成损伤，引起患者学习、记忆等认知功能损伤，甚至引起痴呆，降低患者的生活质量。氢气是一种无色、无嗅、无味、且具有还原性的气体，在过去一直被认为属于生理性惰性气体。2007年，日本的ohsawa教授首先在naturemedicine杂志上报道氢气可以选择性中和羟自由基，且动物吸入2％的氢气就可显著改善脑缺血再灌注损伤，这一研究成果引起了生物学界的广泛关注。氢气已被证明是一种非常理想的抗氧化物质，对脑、脊柱、眼、耳、肺、心、肝、肾、胰腺、肠、血管等全身多个脏器的疾病以及代谢系统疾病、炎症及变态反应疾病均有明显的疗效。国内外已有许多文献研究报道氢气在辐射防护领域的研究成果，研究显示氢气对辐射致放射性皮炎、造血系统损伤、免疫系统损伤均有一定的保护作用。但由于氢气易燃易爆，故其呼吸摄入使用受到一定的限制。通过将氢气溶解于水中，制成饱和溶液，增加了氢气的使用途径，提高了使用过程中的安全性。技术实现要素：本发明的目的是提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途，以能够更好的改善电离辐射导致的认知功能损伤。为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途。在一种优选的实施方案中，本发明提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途，其中所述的富含氢气的水溶液中氢气的浓度大于0.9ppm。在一种优选的实施方案中，本发明提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途，其中所述的电离辐射是电子线导致的电离辐射。在一种优选的实施方案中，本发明提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途，其中所述的电离辐射的辐射剂量为10-30gy。在一种优选的实施方案中，本发明提供富含氢气的水溶液用于制备改善电离辐射导致认知功能损伤的药剂或保健品的用途，其中所述的富含氢气的水溶液通过抗氧化应激作用，干预bdnf-trkb信号通路，改善电离辐射导致的认知功能损伤。本发明的有益效果在于，利用本发明的富含氢气的水溶液，能够更好的改善电离辐射导致的认知功能损伤。本发明首次揭示了富含氢气的水溶液可以通过干预bdnf-trkb信号通路改善电离辐射引起的认知功能损伤。富含氢气的水溶液制备简单、成本低廉，且无副作用，从动物实验的结果来看具有很好的治疗优势，可以大大改善头颈部肿瘤患者因接受放疗而引起的认知功能损伤，改善患者的生存质量。附图说明图1为富含氢气水溶液干预后大鼠逃避潜伏期变化趋势图。图2为富含氢气水溶液干预后大鼠morris水迷宫游泳轨迹示意图，其中上面四张图表示富h2水干预后大鼠学习期游泳轨迹示意图，下面四张图表示富h2水干预后大鼠记忆期游泳轨迹示意图。图3为富含氢气水溶液干预后sod活力值变化情况图。图4为富含氢气水溶液干预后gsh浓度值变化情况图。图5为富含氢气水溶液干预后mda含量变化情况图。图6为富含氢气水溶液干预后8-ohdg浓度值变化情况图。图7为富含氢气水溶液干预后bdnf基因表达变化情况图。图8为富含氢气水溶液干预后trkb基因表达变化情况图。图9为富含氢气水溶液干预后bdnf蛋白表达水平变化情况图。图10为富含氢气水溶液干预后trkb蛋白表达水平变化情况图。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。实施例1：富含氢气水溶液的制备将纯化水加入便携式富h2水机(上海鹭樱环保科技发展有限公司，hs-71型)中进行富含氢气水溶液的制备，制备所得富含氢气水溶液立即用于下述实施例的研究，以保证富h2水中氢气浓度>0.9ppm。实施例2：动物辐射照射spf级sd大鼠，雄性，5-6周龄，20只，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号：scxk-(军)2012-0004。动物按照体重随机分为对照组(control,c)、富h2水组(hrw)、30gy单纯照射组(ir)、30gy富h2水干预组(hrw+ir)，每组5只。(1)对照组：动物不接受照射，经灌胃给予纯化水，体积为20ml/kg；(2)富h2水组：动物不接受照射，经灌胃给予富h2水，体积为20ml/kg；(3)30gy单纯照射组：动物接受全颅照射，照前经灌胃给予纯化水，照后持续给予纯化水一个月，体积为20ml/kg；(4)30gy富h2水干预组：动物接受全颅照射，于照前0.5小时以及照后一个月经灌胃持续给予富h2水，体积为20ml/kg。具体辐射照射方法如下。称量大鼠体重，每只大鼠按照0.3ml/100g剂量通过腹腔注射麻醉剂(10％(m/v)水合氯醛)进行麻醉。将已麻醉的大鼠固定于泡沫板上，用x射线模拟机进行定位，照射部位为头部，身体其他部分用低熔点铅模具遮蔽。然后给予剂量率为3gy/min的6mev电子线照射，按照30gy的照射剂量进行单次照射。实施例3：辐射照射后动物的检测试验1、试验仪器morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)；普通模拟机(山东新华医疗器械股份有限公司，sl-ie型)；医用电子直线加速器(英国elektalimited，elektasynergy)；超纯水系统(中国力新仪器有限公司，nw10vfe)；蛋白核酸测定仪(英国biochmm公司，nanodrop2000)；pcr仪lightcycler480(德国rochediagnosticsltd)；连续波长酶标仪(美国md公司,spectremaxplus384)；超声波破碎仪(美国cole-parmer公司，cpx130)；高速冷冻离心机(thermofisherscientific公司，st16r)；电泳仪(美国bio-rad公司,powerpacuniversal)；半干转移仪(美国bio-rad公司，trans-blotsdcell)；程控金属浴(thermoelectric公司，inanbator)；脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，ts-2)；化学凝胶成像系统fluorchemhd2(美国proteinsimple公司，fluorchemhd2)。2、试验主要试剂sod、gsh、mda、8-ohdg检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；柱式动物组织总rna抽提纯化试剂盒(sangonbiotech)；primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takarabioinc)；sybrpremixextaqⅱ(takarabioinc)；bca蛋白质定量试剂盒、哺乳动物组织总蛋白提取试剂、bsa、超敏ecl化学发光底物、过硫酸铵ammoniumpersulfate、一抗、二抗(博士德生物)。3、morris水迷宫试验i)试验方法大鼠辐射照射后一个月进行morris水迷宫试验。morris水迷宫由黑色内壁圆柱形水池和一个位置可移动和高度可调节的塑料站台组成。直径100cm，高50cm，池内水深30cm，加热器将水加热在(21±2)℃左右。水池标有东、南、西、北四个入水点，并将水池分为东北(ne)、东南(se)、西北(nw)、西南(sw)四个象限，在se象限正中距池边缘20cm处放一逃避平台，平台高29cm,直径为10cm，此平台表面有凸起便于动物站立，池中水没过平台1cm左右，水池内池壁有各种图案为动物提供空间参照线索，便于大鼠定位平台。水迷宫上方放置摄像机，计算机内安装软件对大鼠游泳轨迹进行跟踪记录，完成后对数据进行统计分析。3.1定位航行实验定位航行实验，在正式实验开始前一天将大鼠放入未放置平台的水池中自由游泳2min，熟悉实验环境。定位航行实验周期为5天，每天训练1个时段，每个时段训练4次，分别从4个象限的4个入水点入水，训练前将平台放在se象限中，将大鼠面向池壁从入水点放入池中，对大鼠的游泳轨迹进行跟踪记录，并记录其从入水到爬到平台(四肢均在平台上)的时间，此时间即为逃避潜伏期。让大鼠在平台上休息数秒后放回笼中。如果大鼠在2min内未找到平台，则由实验人员将其引至平台，其逃避潜伏期记为120s。每一时间段内4次逃避潜伏期的算数均数作为这一时间段的成绩，并进行统计。3.2空间搜索实验空间搜索实验在定位航行实验后进行，即第6天撤去平台，任选一个入水点将大鼠放入池中，记录1min内大鼠的游泳轨迹并进行分析。观察分析其穿过原平台所在位置的次数，记录大鼠在原平台象限停留时间、平台象限游泳距离及穿越平台次数，以检测大鼠的空间记忆能力。ii)试验结果morris水迷宫试验的结果如图1和表1所示(5天的定位航行实验结果)。个体内变异部分结果显示，时间因素(day)有统计学意义(p<0.05)，说明潜伏期有随时间变化的趋势；但时间和分组的交互作用没有统计学意义(p>0.05)，说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同。个体间变异部分的计算结果显示，分组的p值小于0.05，说明分组因素起作用，各组潜伏期指标总体而言不同。图1中显示，ir组在1-5天的训练期中，潜伏期时间均高于其余三组且差异具有统计学意义(p<0.05)，提示hrw+ir组大鼠空间记忆能力高于ir组，富h2水对电离辐射致认知功能损伤有一定的保护作用。表1富h2水干预后大鼠morris水迷宫定向导航实验结果注：*与ir组比较p<0.05第6天空间搜索实验结果如表2所示，hrw+ir组较ir组原平台象限停留时间显著延长(p<0.05)；穿越平台次数显著增多(p<0.05)；原平台象限游泳距离显著延长(p<0.05)。富h2水干预后各组大鼠游泳轨迹记录见图2。图2中线条为大鼠游泳轨迹，圆圈为平台所在位置，大鼠爬到平台上轨迹记录结束，可根据轨迹记录比较不同干预组逃避潜伏期、原平台象限停留时间、平台象限游泳记录以及跨越平台次数。表2富h2水干预后大鼠morris水迷宫空间探索实验结果比较4、大鼠脑皮质sod、gsh、mda、及8-ohdg浓度检测i)检测方法辐射照射后一个月，用10％水合氯醛麻醉后，经腹主动脉放血，处死大鼠，迅速摘取大鼠脑，并在冰上分离出海马和皮质。置-80℃冰箱保存，备用。将脑皮质加生理盐水进行超声组织匀浆，制备成10％的组织匀浆，2000r/min离心15min，取上清，进行sod、gsh、mda、及8-ohdg的检测。4.1脑皮质中sod的检测按照试剂说明要求配制底物应用液和酶工作液。按试验要求，设对照孔、空白对照孔、测定孔和测定空白孔，按照下表进行操作。对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样本(μl)--2020双蒸水(μl)2020--酶工作液(μl)20-20-酶稀释液(μl)-20-20底物应用液(μl)200200200200混匀，37℃孵育20分钟，波长450nm，酶标仪测定吸光度值。组织样本sod抑制率和sod活力值计算：在本反应体系中sod抑制率达50％时所对应的酶量为一个sod活力单位(u)。sod抑制率(％)＝{[(a对照-a对照空白)-(a测定-a测定空白)]/(a对照-a对照空白)}*100％sod活力(u/mgprot)＝sod抑制率÷50％*反应体系稀释倍数(0.24ml/0.02ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)4.2脑皮质中gsh的检测样本前处理：取已制备的10％脑皮质组织匀浆0.1ml，加0.1ml试剂一混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清液待测。按照试验要求，设空白孔、标准孔和测定孔，待测样本经试剂一处理后，按照下表进行操作。混匀，静置5分钟，405nm处，酶标仪测定各孔吸光度值。gsh含量计算：组织gsh含量(μmol/gprot)＝[(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)]*标准管浓度(20μmol/l)*样本前处理稀释倍数(2倍)÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/l)4.3脑皮质中mda的检测按照试剂说明要求配制试剂二和试剂三的应用液。按试验要求，设空白管、标准管和测定管，按照下表进行操作。空白管标准管测定管10nmol/ml标准品(ml)-0.1-无水乙醇(ml)0.1--测试样品(ml)--0.1试剂一(ml)0.10.10.1混匀(晃动几下试管架)试剂二应用液(ml)3.03.03.0试剂三应用液(ml)1.01.01.0漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10min。取上清，加入96孔板中，532nm处测定各孔吸光度值。mda含量计算：组织中mda含量(nmol/mgprot)＝[(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)]*标准管浓度(10μmol/l)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)4.4脑皮质中8-ohdg的检测(1)将标准品稀释为12ng/ml、6ng/ml、3ng/ml、1.5ng/ml、0.75ng/ml。(2)空白对照孔不加样品，生物素标记的抗8-ohdg抗体，链霉亲和素-hrp，只加显色剂a&b和终止液，其余各步骤相同。(3)标准品孔中加入标准品50μl，链霉亲和素-hrp50μl。(4)待测样品孔加入样本40μl，然后各加入抗8-ohdg抗体10μl、链霉亲和素-hrp50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。(5)配液，将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1×应用液，备用。(6)洗涤，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干。(7)显色，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，混匀，37℃避光显色10min。(8)每孔加终止液50μl，终止反应(此刻蓝色变黄色)。(9)立即测定od450，并根据标准曲线计算。ii)检测结果富h2水对照后脑组织中内源性抗氧化剂的影响辐射照射后30天检测大鼠脑组织中的sod和gsh的含量，从图3和图4中可以看出，与ir组相比，ir+hrw组大鼠外周血sod、gsh(p<0.05)含量均升高。结果提示氢气对内源性抗氧化剂具有一定保护作用。富h2水对照后大鼠脑组织氧化损伤的作用从图5和图6中可以看出，与ir组相比，ir+hrw组mda(p<0.05)、8-ohdg浓度均降低，此结果提示灌胃给予富h2水可以减轻电离辐射对脑组织的氧化损伤作用。5、bdnf、trk-b基因表达水平检测i)检测方法5.1real-timepcr反应5.1.1总rna提取按照柱式动物组织总rna抽提纯化试剂盒说明书提取步骤提取海马总rna。提取的总rna利用蛋白核酸测定仪测定rna的含量，并在260nm和280nm处测定od值，计算a260/a280的比值以判断所提取总rna的纯度。5.1.2去除基因组dna反应按照如下成分于冰上配制反应混合液，分装到每个反应管中，最后加入rna样品。试剂使用量5×gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μltotalrna*rnasefreedh2o上限10μl*根据总rna定量结果计算1μg总rna的体积。42℃反应2min；4℃保存5.1.3反转录反应总rna10μl和逆转录混合液10μl混匀成20μl的反应体系，放入pcr仪，经37℃反应15min，85℃反应5s后终止反应。pcr反应条件为：以2μlcdna为模板，混合液10μl，上下游引物各0.8μl，双蒸水6.4μl混匀形成20μl的反应体系进行pcr反应，经95℃，30s预变性；95℃变性5s；60℃退火和延伸20s；40个循环，每个样品做三次重复。5.1.4样品归一化处理以β-actin为参比基因，对所有样品进行归一化处理，实验结果用lightcycler480版软件分析。采用“2-△△ct”相对定量法估算出大鼠海马bdnf和trkb的相对表达量。5.2western-blot5.2.1蛋白提取(1)将30mg海马组织块置于1.5ml离心管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。(2)按100mg/1ml加入蛋白裂解液(含pmsf)，在冰上进行组织超声匀浆。(3)将组织匀浆液放入4℃冰箱，放置3小时。(4)取出后在4℃下13000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。(5)bca法测定蛋白浓度。5.2.2蛋白电泳、转膜及显影(1)制板：玻璃板对齐后放入卡子中夹紧，垂直放在架子上准备灌胶。(2)配胶：12％分离胶；5％积层胶。(3)上样：蛋白浓度测定完毕后，根据其计算含45μg蛋白的溶液体积即为上样量。将上样样品置于0.5ml离心管中，加蛋白裂解液至10μl，再加入10μl的sds上样缓冲液。上样前将样品95℃金属浴5min使蛋白变性，将样品小心加至加样孔中。(4)电泳：电泳时间1.5小时左右，电压为80v转120v，电泳槽周边放冰袋降温。(5)转膜：按照标准的“三明治”方法将条带转移至pvdf膜上，条件为15v恒压转15min.(6)封闭：5％bsa封闭1小时。(7)孵一抗：加入一抗后，4℃冰箱封闭孵育过夜。(8)加二抗：用tbst洗脱一抗3次，每次5min，加入hrp标志的二抗密封，置于摇床上，室温孵育2小时，tbst洗脱2次，tbs洗脱1次，每次5min。(9)显影：将a和b两种试剂等体积混合；将膜蛋白面向上放置于显影板上，混合液与膜蛋白面充分接触，并显影。(10)凝胶图像分析：将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值。5.3数据采集和处理5.3.1westernblot数据处理westernblot图像由fluorchemhd2凝胶成像系统采集，用其系统软件进行灰度值分析。目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的蛋白相对含量。5.3.2数据统计分析所有数据使用spss16.0统计分析软件进行分析，全部数据均以均数±标准差(means±sd)的形式表示，多组间均数比较采用单因素anova方差分析，采用snk法进行两两比较。当p<0.05认为有统计学差异。ii)检测结果bdnf、trk-b的rt-pcr结果如图7和图8所示，利用2－δδct法对检测结果进行分析，其中c组的bdnf、trk-b表达量设为1，与c组相比，ir组bdnfmrna水平显著下降(p<0.05)，ir+hrw组bdnfmrna水平较ir组升高(p<0.05)。ir组与c组trkbmrna水平基本一致，ir+hrw组trkbmrna水平较ir组显著提高(p<0.05)。6、bdnf、trk-b蛋白表达量检测i)海马组织蛋白质浓度检测方法：bca法稀释标准品：将标准品储存液稀释至25-2000μg/ml。稀释液可用生理盐水或pbs。配制适量bca工作液：按照试剂a：试剂b以50﹕1混匀。将25μl的标准品和合适浓度范围的样本分别加入96孔板的微孔中。各孔加入200μlbca工作液，充分混匀。盖上96孔板盖，37℃孵育30min。冷却到室温，用酶标仪测定562nm吸光度值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。ii)检测结果用alphaviewsa软件对蛋白图像进行截取，并对图像中蛋白条带做定量分析，其中以c组蛋白量作为1，其余组与其计算比值，结果如图9和图10所示，与c组相比，ir组的bdnf和trk-b的蛋白表达量明显下降，但ir+hrw组bdnf和trk-b的蛋白表达量显著高于ir组(p<0.05)。7、结论综上所述，富h2水可以通过抗氧化应激作用和上调bdnf及其受体trkb蛋白表达量来减轻电离辐射致认知功能损伤。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。当前第1页12