内质网Ca2+阻断剂在制备治疗脑神经砷中毒的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，尤其涉及内质网ca²⁺阻断剂在制备治疗脑神经砷中毒的药物中的应用。

背景技术：

近年来，砷的毒性作用显著影响人类的生命健康。若长期接触含有砷以及砷的化合物的环境会对人体的健康产生众多的不良的影响,其中包括引发皮肤色素沉着,异常角化病、呼吸系统疾病、肠胃功能紊乱、贫血和脾肿大、相关的新生儿出生缺陷、心血管功能紊乱、肾功能衰竭等，同时增加了健康人群患肺癌、皮肤癌以及其他癌症的风险。人体中的砷暴露对机体健康产生诸多不良的影响不仅包括各种形式的癌症机率风增加险和一些良性疾病，还有其由于职业或环境暴露或者是意外中毒对神经性的影响，例如亚临床神经损伤、谵妄和神经性脑病,以及周围神经病变和其他外周神经系统疾病。此外,一些调查显示砷及砷化合物对学习和记忆可以产生影响。在儿童人群中,慢性砷暴露主要是由于孩童饮用了含有无机砷的饮用水，从而存在剂量依赖性，并逐渐降低了孩童的智力功能。

重金属砷致大脑神经毒性作用产生的重要目标部位是海马，同时海马也是脑内学习与记忆功能最为关键的部位。在大脑中海马及纹状体是边缘系统最重要的组成部分，它们参与了机体进行学习、认知、记忆及情绪产生的调节，在纹状体的尾内侧部，有大量的梭形细胞构成的纹状体边缘区，在这一神经元丰富的区域包含了较多与机体学习和记忆等功能相关的因子，并且当中的神经投射方式也和多个参与机体学习与记忆的脑室区域相关联。在机体不同的组织中，砷及砷化合物均可广泛产生蓄积作用，砷通过与细胞中的巯基结合，显著的抑制细胞分裂、细胞增殖，从而使细胞的代谢功能发生障碍。研究表明，砷在进入机体后，可以快速的分布于红细胞上，砷化合物能够与血红蛋白的球蛋白部分快速结合，形成了gs-as-(sh)x复合物，这些复合物可以在24h内，广泛分布于机体的肝、肾、脾、肺和胃肠道。若机体长期接触高砷暴露环境，不仅可使砷在肝、肾、脾、皮肤等机体重要组织器官大量蓄积，也会在脑组织蓄积。目前对如何减轻脑神经染砷的有效研究较少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了内质网ca²⁺阻断剂在制备治疗脑神经砷中毒的药物中的应用，主要目的是提供了减轻脑神经砷中毒的药物治疗方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了内质网ca²⁺阻断剂在制备治疗脑神经砷中毒的药物中的应用。

作为优选，所述内质网ca²⁺阻断剂为丹曲洛林和/或2-氨基乙酯二苯基硼酸。

作为优选，所述丹曲洛林和所述2-氨基乙酯二苯基硼酸均为口服。

内质网ca²⁺阻断剂包括：(1)l-型钙通道的特异性抑制剂是nifedipine和人参皂苷rb1；(2)t型钙离子通道阻断剂是nicl2；(3)n型钙通道特异性抑制剂是ω-conotoxingvia；(4)p/q型通道特异性的抑制剂是ω-agatoxiniva；(5)ip3r的特异性抑制剂是2-apb、sk&f96365和heparin；(6)兰尼硷受体(ryr)的特异性抑制剂是dantrolene和ryanodine；(7)磷脂酶c的抑制剂是u73122；(8)特异性质膜ca2+-atpase阻断剂是caloxin3a1；(9)内质网钙泵serca的抑制剂是环匹阿尼酸和毒胡萝卜素；(10)细胞膜钠钙交换体(ncxpm)的阻断剂是kb-r7943；(11)线粒体的钙单向转运体(mcu)的阻断刺是ru360；(12)线粒体钠钙交换体(ncxmito)的阻断剂是cgp-37157；(13)内质网(er)的肌浆网/内质网钙atp酶(serca)的阻断剂是thapsigangin。本发明仅以丹曲洛林和2-apb举例说明ca²⁺阻断剂可以减轻脑神经砷中毒。

丹曲洛林：是治疗恶性高热的特效药物。治疗的可能机制是通过抑制肌质网内钙离子释放，在骨骼肌兴奋-收缩耦联水平上发挥作用，使骨骼肌松弛。

2-apb：2-氨基乙酯二苯基硼酸，分子式：c14h16bno，分子量：225.1，是一种新型膜通透性的ip3受体(ip3r)拮抗剂，抑制ip3诱导的ca2+释放。

内质网是在真核生物体内，具有高度敏感性的且功能繁多的细胞器，正常情况下，内质网能够发挥正常生理功能来维持细胞内环境的稳定，然而，一旦机体受到缺氧等理化因素影响时，就会引起细胞内的稳态失衡，诱发内质网应激(ers)，ers是发生应激时机体产生的一种自我保护的机制，如果过度应激则有可能导致细胞产生凋亡现象。内质网应激在哺乳动物细胞中，主要包含ip3r和ryr两种钙通道蛋白，胞内钙离子的释放，主要依靠钙通道蛋白ip3r和ryr的有效调控。

2-apb作为ip3r抑制剂，可调节ip3r钙通道的钙释放，抑制或激活钙离子的信号转导，影响钙池的钙离子流动；

丹曲林作为ryr抑制剂，可有效阻断细胞中钙离子的释放，显著提升符合动作电位的幅度。

本发明以大鼠作为试验对象，对其施用一定剂量的砷盐，通过观察染砷大鼠与未染砷大鼠的行为表现，未服用钙离子阻断剂的染砷大鼠和服用钙离子阻断剂的染砷大鼠的行为表现，并对其脑神经进行研究对比，发现ca²⁺阻断剂对染砷大鼠的脑神经具有以下影响：

(1)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元形态结构的影响

(2)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元中尼氏体形态结构的影响

(3)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元定性定位观察的影响

(4)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经细胞的超微结构影响

(5)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元胞内游离ca2+浓度的影响

(6)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织蛋白浓度bca的影响

(7)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内grp78蛋白表达水平的影响

(8)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内caspase-12蛋白定位及表达表达水平的影响

(9)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内活性氧ros水平的影响

(10)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内sod活力的影响

(11)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内mda含量的影响

(12)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内gsh含量的影响

(13)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内bcl-2及bax蛋白表达水平的影响

(14)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内caspase-3酶活性的影响

本发明通过以上研究，针对naaso2毒性作用可降低大鼠海马及纹状体神经细胞的活性且影响神经细胞形态的技术问题，发现口服2-apb和dantrolene可有效改善其毒性作用；

本发明针对砷毒性作用可引起大鼠体内氧化-抗氧化还原水平的显著变化，损伤发生机制中有氧化应激及内质网应激诱导的细胞凋亡的技术问题，发现口服2-apb和dantrolene可有效降低这些应激损害，减轻细胞凋亡进而发挥对机体砷中毒性损伤后的保护作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明针对砷中毒机理，采用内质网钙离子阻断剂有效减轻或改善了砷的毒性，从而达到临床用药以降低砷的毒性作用。本发明通过使用钙离子阻断剂丹曲洛林和2-apb作用于染砷大鼠模型，发现其产生的抑制作用可有效减轻脑神经的砷毒性作用，为未来治疗及改善砷致机体毒性的方式提供新途径，可为未来临床研究提供实验依据，具有较强理论和实际意义。

附图说明：

图1是本发明实施例1提供的ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元形态结构的光镜图；

(注：a为对照组(×200)；b为对照组(×100)；c为10mg/kg中剂量naaso2染毒组(×100)，d为dantrolene处理组(×100)，e为2-apb处理组(×100)，f为2-apb+dantrolene联合处理组(×100))

图2是本发明实施例1提供的ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元中尼氏体形态结构的光镜图；

(注：a为对照组×400，b为对照组×1000，c为10mg/kg中剂量naaso2染毒组，d为dantrolene处理组，e为2-apb处理组，f为2-apb+dantrolene联合处理组)

图3是本发明实施例1提供的大鼠海马神经元甲苯胺蓝染色后的结构形态变化的光镜图；

(注：a为对照组×400，b为10mg/kg中剂量naaso2染毒组×400，c为dantrolene处理组，×400，d为2-apb+dantrolene联合处理组，×400)

图4-1是本发明实施例1提供的大鼠海马神经元的超微结构变化的电镜图；

(注：a为对照组，b为10mg/kg中剂量naaso2染毒组，c为dantrolene处理组，d为2-apb+dantrolene联合处理组)

图4-2是本发明实施例1提供的大鼠海马神经胶质细胞的超微结构变化电镜图；

(注：e为对照组，f为10mg/kg中剂量naaso2染毒组，g为dantrolene处理组，h为2-apb+dantrolene联合处理组)

图4-3是本发明实施例1提供的大鼠海马神经毡的超微结构变化电镜图图；

(注：i为对照组，j为10mg/kg中剂量naaso2染毒组，k为dantrolene处理组，l为2-apb+dantrolene联合处理组)

图5是本发明实施例1提供的大鼠海马组织蛋白浓度的变化，*与对照组比较图(p＜0.05)；

图6是本发明实施例1提供的大鼠海马组织ros水平的变化，*与对照组比较图(p<0.05)；

图7是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内超氧化物歧化酶活力的变化，*与对照组比较图(p<0.05)；

图8是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内丙二醛含量的变化，*与对照组比较图(p<0.05)；

图9是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内还原型谷胱甘肽gsh含量的变化，*与对照组比较图(p<0.05)；

图10是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内caspase-3活性的变化，*与对照组比较图(p<0.05)；

图11(a、b、c图)是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内caspase-12蛋白表达量的荧光图；

图12是本发明实施例1提供的大鼠海马组织内grp78蛋白表达量的western-blot荧光图；

图13是本发明实施例1提供的蛋白质测定bca标准曲线(r²＝0.997)图；

图14是本发明实施例1提供的caspase-3ρna标准曲线(r²＝0.999)图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明全文提到的各物质中文名称和英文名称如表1所示。

表1.本发明化学物质的中英文名称对照

实施例1

主要实验仪器见表2。

表2.实验仪器说明

主要实验试剂见表3。

表3.实验试剂说明

实验动物：选用32只12周龄spf级雄性sprague-dawley(sd)大鼠(新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供生产许可证scxk(新)2011-0004),饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(21±2)℃，湿度40％～60％。

主要溶液配制：

(1)naaso2溶液的配制：使用电子秤，精确的称取0.1299gnaaso2(纯度≥98％)粉末，操作需要在无菌的超净台内进行，取10ml双蒸水溶解naaso2粉末，因其易溶于水，此时浓度为10^-1mol/l，放置在-20℃，锡箔纸封闭避光。在使用时分别按照5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的剂量，从原液中取388μl、776μl、1552μl分别加入到1000ml双蒸水中以便供大鼠饮用。

(2)2-apb溶液的配制：使用电子秤，精确的称取0.0225g2-apb(纯度≥98％)粉末，操作需要在无菌的超净台内进行，取10mldmso溶解2-apb粉末，此时浓度为10^-2mol/l，放置在-20℃，锡箔纸封闭避光。在使用时按照100μmol/l的浓度，从原液中取20μl加入到9％的生理盐水中，按照每100g体重灌胃剂量1ml分别计算每只大鼠的灌胃量。

(3)dantrolene溶液的配制：使用电子秤，精确的称取0.0336gdantrolene(纯度≥98％)粉末，操作需要在无菌的超净台内进行，取10mldmso溶解2-apb粉末，此时浓度为10^-2mol/l，放置在-20℃，锡箔纸封闭避光。在使用时按照100μmol/l的浓度，从原液中取20μl加入到9％的生理盐水中，按照每100g体重灌胃剂量1ml分别计算每只大鼠的灌胃量。

(4)10％水合氯醛溶液：精确称量10g水合氯醛粉末完全溶解于100ml的双蒸水中，未见沉渣后过滤除菌并放置4℃冰箱保存备用。

(5)ripa裂解液：ripa裂解液与pmsf按照100:1的比例进行精确配制，1ml裂解液中需要加入10ul的pmsf，混匀配制好后低温放置。

westernbolt主要溶液配制：

(1)30％丙烯酰胺：称取丙烯酰胺58g，亚甲基丙烯酰胺2g，加入ddh2o200ml，40℃溶解后滤纸过滤，200ml定容，使用棕色瓶放置4℃冰箱保存。

(2)1.5mol/ltris-cl：精确称量18.2gtris粉末，加入200mlddh2o后充分溶解，再加入浓hcl进行缓慢滴定同时使用ph仪来精确调节ph值，不停混匀搅拌直至ph为8.8停止加入hcl，最后再加ddh2o将总体积定容至250ml，放置4℃冰箱保存。

(3)1.0mol/ltris-hcl：精确称量30.29ggtris粉末，加入200mlddh2o后充分溶解，再加入浓hcl进行缓慢滴定同时使用ph仪来精确调节ph值，不停混匀搅拌直至ph为7.5停止加入hcl，最后再加ddh2o将总体积定容至250ml，放置4℃冰箱保存。

(4)0.5mol/ltris-cl：精确称量12.2gtris粉末，加入200mlddh2o后充分溶解，再加入浓hcl进行缓慢滴定同时使用ph仪来精确调节ph值，不停混匀搅拌直至ph为6.8停止加入hcl，最后再加ddh2o将总体积定容至250ml，放置4℃冰箱保存。

(5)10％过硫酸胺(w/v)(ap)：精确称量0.1g过硫酸胺并加入1mlddh2o进行充分溶解，避光，放置4℃冰箱保存，10％ap配置好后最长保存期限为一周。

(6)10％sds：精确称量十二烷基磺酸钠(sds)10g，置于温度50℃的水浴锅中同时加入90mlddh2o，再加入浓hcl进行缓慢滴定同时使用ph仪来精确调节ph值，不停混匀搅拌直至ph为7.2停止加入hcl，常温放置保存。

(7)5×电泳液：称取甘氨酸94g和tris15.1,4g，sds5g,加入900mlddh2o搅拌使其完全溶解，再追加ddh2o使其定容至为100ml，放置常温保存。

(8)1×电泳液：5×电泳液100ml，加ddh2o400ml。

(9)10×电转液：称取甘氨酸144g，tris30.5g，甲醇200ml,再加ddh2o至使其全溶后定容至1000ml，放置常温保存。

(10)1×电转液：精确称量100ml的10×电转液，加入200ml甲醇及ddh2o700ml，混匀后放置常温保存，现用现配。

(11)10×tbs：精确称取tris6.057g和nacl43.83g，加入500mlddh2o待完全溶解后调节ph至7.4，再加入ddh2o定容至1000ml，放置常温保存。

(12)1×tbst缓冲液：量取50ml10×tbs的缓冲液，再加入450mlddh2o，同时加0.5mltween-20，待混合均匀后放置常温下保存待用。

(13)封闭液：5％脱脂奶粉封闭液：在平皿内放置称量好的0.5g的脱脂奶粉，移液器抽吸加入10ml1×tbst并用脱色摇床混匀溶解。5％bsa封闭液：在平皿内放置称量好的0.5g的bsa，移液器抽吸加入10ml1×tbst并用脱色摇床混匀溶解。

(14)显影液、定影液的配制

通用显影液：根据说明书要求，在烧杯中加入1000mlddh2o加热至50℃后，倒入显影粉a，等待a完全溶解后再加显影粉b，搅拌待溶解完全后，冷却至室温，放入棕色瓶中，避光保存。

酸性定影液：根据说明书要求，在烧杯中加入1000mlddh2o加热至25℃后，加入全部的定影粉，等待粉末完全溶解之后，放至室温，再加入棕色瓶中，避光保存。

(15)sds-page的配制：见表4.

表4.sds-page配制方案

实验方法：

将72只大鼠随机分配为4个大组，各组18只，使用苦味酸染料进行标号，登记。

将大鼠随机分为空白对照组及低、中、高染毒组,各组18只。将naaso2用蒸馏水分别配制成5、10、20mg/kg溶液供染毒组大鼠自由饮用，正常对照组可自由饮用蒸馏水。四组大鼠均自由进食普通饲料。染砷期满12周后，将实验组分为：

a:染砷后自然恢复组；

b：药物丹曲洛林100μmol/l处理组；

c：药物2-apb100μmol/l处理组；

d：药物丹曲洛林100μmol/l+2-apb100μmol/l联合处理组；

使用丹曲洛林和2-apb进行药物干预时，按照1ml/100g剂量稀释药物进行隔天灌胃，药物灌胃周期为21天。

大鼠染毒期满12周并药物处理21天后,四组大鼠随机各取6只,于处死前24h禁食，可自由饮水。用10％水合氯醛腹腔麻醉,使用4％多聚甲醛经左心室及升主动脉插管再灌注固定。使用75％酒精润湿动物的全身皮毛进行消毒处理。开颅取脑,冰上迅速分离海马、纹状体和大脑皮质组织，清晰剥离周围皮质。

取出海马、纹状体之后，立即放入预冷生理盐水中漂洗，将其表面的血污清洗干净后使用滤纸，把各组织表面水分吸干后称重，动作要快速轻柔，为了防止镊子等锐器损伤到脏器表面。电子天平在称重之前注意调零，等待读数调整为零以后记录数据并保存。

准确称量组织脏器之后进行分批保存并标记。海马：取双侧海马，一侧海马称取准确数值之后使用眼科剪尽快剪碎组织块，以预冷的ripa裂解液+pmsf为匀浆介质，提取样本做western-blot。一侧海马4％戊二醛进行固定做电镜样本用。每组各取三只大鼠海马组织，眼科剪剪碎后，加入胰酶进行消化，加入fluo-4荧光探针进行钙离子浓度检测。同组各取六只大鼠海马及纹状体取出，一侧使用4％多聚甲醛固定做石蜡切片用，另外一侧取出按照试剂盒不同要求分成五份保存放置-80℃待用。

病理切片的he染色的研究流程：切取适宜大小的组织标本放在组织包埋盒中，使用铅笔做好每个样本的标记，经4％甲醛固定过夜。

酒精梯度脱水：分别使用70％和80％的酒精各脱水一个小时，90％酒精和纯乙醇各脱水一个小时；二甲苯透明40min。

浸蜡：将透明的组织块放入蜡缸中2小时。

包埋切片：包埋好的组织錯块经冷冻台冷冻定型，以5μm厚度连续冠状位进行切片。切好的切片放入烘干箱2小时进行再固定。

二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ，酒精70％、80％、90％、100％梯度脱水各5min，再自来水水洗浸泡1分钟。

使用苏木素浸泡5分种，流水冲净苏木素直到水缸中无苏木素的颜色。

再用酸酒精浸泡5秒，流水冲洗5分钟，使其充分返蓝。

伊红染色：时间为3分钟。

自然风干，中性树胶进行封片。

大鼠海马神经元尼氏染色

新鲜组织经福尔马林固定，常规采用脱水包埋，步骤同he染色。

切片厚度5μm，采用常规脱蜡至水。

将切片放在染缸中，加入cresylvioletstain，在56℃的温箱浸染1h。

使用ddh2o冲洗后在切片上滴加nissldifferentiation中分化，时间数秒至2min，此时需要在显微镜下进行观察，切片背景接近无色停止分化。

使用无水乙醇快速脱水并用二甲苯透明，自然风干后用中性树胶封片。

大鼠海马神经元电镜样本制备前的甲苯胺蓝染色

取经过透射电镜常规制样，epon812包埋后的海马组织块，放在超薄切片机上进行切片，切取厚度在0.5-2μm之间的半薄切片,随后将切片放置到到，加有蛋白甘油混合水滴的特殊载玻片上面,再放置在37℃的烘干箱中烘干，等待染色，取出切片滴加甲苯胺蓝染液,反应时间约在3～5分钟之间，滴液染色液时如果室温较低,可将切片放置于酒精灯上加热，时间控制在数秒钟内,并且不能加热至沸腾状态,反应结束后用滴管冲洗多余的染色液,再用滤纸将水分吸干,放至通风处等待自然风干,即可使用显微镜镜检。

大鼠海马神经元电镜样本的制备：

将需要做电镜的海马样本组织放置在4％戊二醛中，固定时间24h。

第一天：首先抽弃离心管中的4％戊二醛，并用0.1molpbs冲洗样本，用时约1.5h，前3次需要连续冲洗样本。

用移液器吸干pbs，再加入2％的锇酸进行固定，时长1h。

固定结束后移液器抽弃锇酸，并用0.1molpbs缓冲液，冲洗样本约30min。

对冲洗完的样本进行梯度酒精脱水：酒精浓度为30％、50％、60％，各脱水10min，最后放置在70％的酒精溶液中置4℃冰箱过夜。

第二天：将样本放置在80％、90％、95％酒精脱水，各浸泡10min，最后用100％酒精ⅰ、ⅱ，分别浸泡样本30min。

将蒸馏水和丙酮按照1:1的比例进行配制，将脱水完的海马组织放置在配好的溶液中30min。再将蒸馏水和丙酮按照1:4的比例进行配制，将样本放置在此溶液中30min。最后在纯丙酮中浸泡30min。样本在纯丙酮溶液中，在浸泡的过程中，需要用小刀将大块的组织样本切成约1mm大小的小块。样本切成小块后，再放置在纯丙酮溶液中浸泡，时间在10～15min之间，浸泡结束后吸弃丙酮溶液。将丙酮和环氧树脂按照1:1的比例进行配制，并将样本放置在此液中浸泡1h。再将丙酮和环氧树脂按照1:4的比例进行配制，再次将样本放置在此液中3h。时间到后抽出1:4的溶液，在离心管中加纯环氧树脂(epon812)进行包埋，提前做好标记，放置在室温，过夜。

第三天：进行铺模块，用油性笔在称量纸上写下各样本的编号，小心剪下编号，并倒扣在小模块内。使用牙签小心取出在纯环氧树脂中的组织块，将取出的小块组织用牙签挑起来放在模具中，小模块尖端放一块，组织块稍大的部分尽量放在模具顶端。

在每个小模块中用纯环氧树脂加满漫过组织。随后放在烘干箱中静置，待晚上下班前打开烘干箱，组织块在烘干箱中烘三天后，取出对组织块进行修块。首先对待测样本进行半薄切片，切片厚度在0.5-2μm之间，进行甲苯胺蓝染色，然后在光学显微镜下进行形态学的观察，对海马区域定位，随后再使用超薄切片机进行切片，切片完成后使用醋酸铀和硝酸铅进行双重染色。放置一小时后在使用透射电子显微镜(日立h-600型)进行海马内部结构观察，对于海马神经细胞内部超微结构的变化进行取像记录存储。

流式细胞仪测定样本中的钙离子浓度

fluo-4若以游离配体形式存在时，几乎是非荧光性的，但是，当其与细胞内钙离子结合后，即可产生较强的荧光。

使用时钙荧光探针fluo-4,am的浓度需要提前配制成2mm，将预先取出的海马组织用眼科剪剪碎后，加入不含edta的胰酶消化液，放置在37℃水浴锅中，水浴30min，期间不断吹打组织，随后加入胎牛血清终止消化，离心收集沉淀，pbs洗涤2次，再用pbs重悬。

此时需将钙荧光探针fluo-4,am工作液的浓度稀释至5μm，此浓度为海马组织测定钙浓度的最适浓度.

将fluo-4,am工作液加入消化好的细胞中，并在37℃条件下，孵育20分钟。

孵育后，加入5倍体积的含有1％胎牛血清的hbss，继续孵育40分钟。

孵育完成后，用hepesbuffersaline洗涤细胞3次，再用hepesbuffersaline使细胞重悬，以此制备成1×105cells/ml的细胞悬液。

将此细胞悬液在37℃下，孵育10min，随后用流式细胞仪对该细胞进行钙离子浓度检测。检测条件：激发波长488nm，发射波长516nm，fitc通道。

bca蛋白浓度测定：

配制工作液：按照标准品和样品数量，每50体积bca试剂要加入1体积的cu试剂(50:1)，充分混匀配制成bca工作液，在混合时可能会产生浑浊现象，若混合均匀后浑浊就会消失。配置好的bca工作液放置在室温，于24小时内性质稳定。

稀释标准品：移液器量取10μlbsa标准品，再用pbs稀释至终体积100μl，即终浓度为0.5mg/ml。将配置好的标准品按：0,2,4,6,8,12,16,20μl，分别加到96孔板中，作为蛋白标准品孔，再加pbs补足体积至20μl。

把待测样品作适当稀释后每孔加20μl到96孔板样品孔中。可能移液器在量取小量样品的时候误差会偏大，使得标准线之前的点会不是很精确，因而在绘图时尽可能的让样品的点，落在绘制的标准线1/2的后面，如图13所示。

各孔分别加入200μl的bca工作液，于37℃放置15-30min后用酶标仪测定，吸光度值a562nm，结果需要根据标准曲线来计算出最终蛋白浓度。在使用温箱进行孵育时，需要注意：防止在烘干箱中水分过度蒸发，从而影响检测结果。

蛋白样本的制备：

大鼠染毒期满12周并药物处理21天后选择中浓度10mg/kg组,再选择空白组，染毒恢复组，2-apb处理组，dantrolene组，2-apb+dantrolene处理组共五组大鼠随机各取3只,快速取出海马组织并与大脑皮质分离后，剥离干净周围的组织，使用生理盐水漂洗干净，再用眼科剪尽快剪碎组织块，放置在标记好的ep管中，以预冷的ripa裂解液+pmsf为匀浆介质，按照100mg组织配1mlripa裂解液+pmsf的体积配制，加入此溶液的过程需要在避光、低温的条件下进行操作，加好液体后用细胞超声粉碎仪将海马组织进行完全粉碎，随后放置在冰上充分裂解大于20min，裂解完成后在使用离心机之前需要配平，配平以后4℃离心机以12000g/min离心，离心后取上清放进提前预冷的高压无菌离心管中，并使用记号笔标记清楚，置于-80℃冰箱待用。

蛋白样品的测定和配平：蛋白样本浓度的测定：每组蛋白的浓度使用nanodrop2000/2000c超微量核酸蛋白测定仪进行检测，每个样本在进行测量前都需要对检测仪进行调零，移液器抽取1μl无酶水或者是ddh2o进行冲洗探头，多次进行冲洗直至测量的浓度值在±0.03之间，冲洗结束后使用无菌的滤纸，吸干探头上的无酶水或者ddh2o，再抽取1μl的待测蛋白样本液，在核酸蛋白测定仪上，多次测量，准确记录测量所得数值，平均每组样本都需要测量三次以上，最后取得数据平均值，记录为该样本的最终蛋白浓度值。

蛋白样本液的配平：样本通过多次测量所得的数据，按照配平方程以最小数值的浓度组的蛋白测量值作为配平的最低标准浓度，此时加入ripa裂解液，调整各组浓度的差异，使每组的蛋白终浓度确保与选择的最低样本的浓度数值相互一致。配平后将每组蛋白样本抽取定量至无菌高压的ep管中，按照说明书加入5×loadingbuffer，即蛋白样本:loadingbuffer的比例为4:1，使用移液器进行吹打混匀，随后放在提前加热至100℃的蛋白加热器上进行煮沸，用时8min。煮沸完成后在室温条件之下进行冷却处理，封口膜封闭离心管管口，放至-20℃低温保存待用。

sds-page凝胶电泳过程：

(1)配制分离胶和浓缩胶：制胶之前将玻璃板用干净纱布清洗，然后用双蒸水流动冲洗至无水渍，将洗好的梳子立起来晾干，随后用塑料夹夹好玻璃板，保证不会损伤到玻璃板的情况下装在制胶架上面，使整个制胶架和玻璃板保持水平，再向两块玻璃板中间加入ddh2o进行测漏，静置10min后，肉眼仔细观察玻璃板之间液面的高度，若液面并未向下凹陷则证明玻璃板并不漏液，此时倒掉ddh2o，倾斜制胶架并用干净滤纸将多余水分吸干，再将制胶架摆在水平实验台上，移液器加入10％的分离胶，此时使用移液器应当均匀的来回滑行，为避免胶面发生变形将分离胶加至胶架3/4处再加入ddh2o封胶，在室温下静置30分钟，若气温较低可以适当延长凝固时间。等分离胶充分凝固以后，再用干净的滤纸将封胶用的ddh2o充分吸干净，随后迅速加入5％的浓缩胶，快速的垂直插入已经晾干的梳子，再补胶，同样室温静置大于30分钟，浓缩胶要充分凝固之后才可方便使用。

(2)蛋白样品上样：将提前制备好的凝胶，小心装到垂直电泳槽的内槽架上后夹好，此时加入新鲜配制的1×电泳缓冲液，于水平的实验台上静置大约10min，此目的是为了检查：电泳槽的内槽是否漏液，若未发现漏液即可拔掉梳子，此时应当按照插入方向垂直拔出。随后在凝胶的加样孔中，依次加入提前制好的蛋白组织样品，再放到外槽中，加入新鲜配制的1×电泳液，在外槽中加到电泳槽的指定刻度即可，插上电源进行电泳，若电泳过程中温度过高，可制造冰浴环境进行电泳。进行电泳条件：浓缩胶电压：60-80v，用时30min；跑到分离胶时调整电压：80-120v，用时150-210min。

转膜：

(1)电泳快要完成前需要提前配好1×电转液。精确剪裁同等大小的厚滤纸和pvdf膜，放置在1×电转液中20分钟后才能使用，使滤纸和pvdf膜充分接触电转液。再将pvdf膜预先放入甲醇溶液，浸泡4min后与滤纸放在同样的电转液中。

(2)进行电转时需要提前用胶铲将胶裁剪至等同滤纸的大小。在电转架子上按照胶对黑板，膜对白板的方向，分别在胶和膜的两侧放置滤纸，用胶铲轻轻的赶除气泡，这是为了避免在转膜过程中影响转膜效果。

(3)转膜的条件：内参：250ma，25分钟；bcl-2和bax：250ma，25分钟。

免疫反应：

(1)封闭：按照抗体的不同条件配制封闭液，转膜结束后将膜放入对应的封闭液中，放在速度为55-60rpm的水平脱色摇床上封闭1-2h。

(2)孵育一抗：不同抗体比例不同，浓度需要多次试验摸清，β-actin比例为1:1000，grp78比例为1:800，bcl-2比例为1:1000，bax比例为1:500，按比例分别抽取相应抗体至封闭液，混合均匀后加入pvdf膜。将膜的正面朝上，确保一抗的孵育液充分没过膜，同时也可使用pe手套封闭pvdf膜，无论用何种方法都应该使膜与一抗孵育液进行充分结合，将样本放置4℃冰箱过夜。

(3)清洗一抗：一抗回收利用，再将膜放在1×tbst溶液的玻璃皿中，使用转速为80-90rpm的水平脱色摇床匀速摆动，内参和目的洗3次×10min。

(4)孵育二抗：不同抗体二抗浓度不同，内参山羊抗小鼠二抗：1:20000，grp78山羊抗小鼠二抗：1:25000，bcl-2山羊抗兔1:10000，bax山羊抗兔1:30000，内参和bcl-2的二抗用5％脱脂奶粉封闭液来稀释，bax的二抗用5％bsa封闭液来稀释。混匀后将膜放入玻璃平皿在室温下于摇床上孵育2h，若气温较低，可适当延长反应时间。

(5)清洗二抗：二抗仅回收一次，再将膜放在1×tbst溶液的玻璃皿中，使用转速为80-90rpm的水平脱色摇床匀速摆动，内参和目的洗3次×10min。

曝光：

(1)化学发光：发光试剂混合液是取相同体积的a液与b液，在ep管中充分混合，取适量混合液缓慢、均匀的滴加在膜上，随后用保鲜膜包好，赶走膜之间的气泡。

(2)于黑暗条件下取出胶片，裁剪跟上样孔等大的胶片，小心放在膜上，使用压片盒垂直按压，在压片过程中，不要随便挪动胶片位置，以免出现重影，每次实验需要多次重复压片，实验条件不同，曝光时间也不尽相同，所以要根据抗体的不同条件选择最佳的曝光时间。压片结束后将胶片放到显影液里面，发现显影后立即放到红光灯下，显影观察。若已经选到合适显影胶片应沥干胶片上的显影液，快速放入定影液中定影，大约10min后取出胶片并用清水冲洗干净，摆放不重叠并晾干备用。

(3)所以凝胶成像系统对胶片照相采图，并用gel-pro软件进行灰度值的分析。

共聚焦免疫荧光技术：检测caspase-12在大鼠海马神经元的表达及定位

切片准备：快速分离空白组及实验组的海马组织，使用ph为7.2的pbs缓冲液对组织清洗3次，随后将样本放置在4％多聚甲醛中，固定时间大于24h。包埋样本前使用ph为7.2的pbs缓冲液进行常规洗涤。各样本组织的脱水及透明、浸蜡及切片过程同以上病理切片制作过程。

抗原修复：强各组切片脱蜡之后用蒸馏水冲洗，此时需要对切片组织的抗原，进行高压修复过程，先在塑料器皿中加入0.01mol/l的柠檬酸盐缓冲液(其ph为6.0)，随后将待测样本切片按顺序放入塑料器皿，一同放在微波炉中，调至高火，逐渐加热至其沸腾，时间为3min，此时需提前准备装有沸水的高压锅，待微波炉加热之后转移至高压锅内，旋紧高压锅的锅盖，启动后加热，等待高压锅上的喷气阀第一次喷气之后，快速调整高压条件：修复功率800w，修复温度150℃，修复时间为8min，时间到后取出切片，放置在通风处，冷却至室温。

3％h2o2封闭：冷却后的切片需要用自来水进行冲洗，再将切片染色架取出，置于3％h2o2溶液中浸泡10min，此过程结束后，切片需要用自来水冲洗干净。

洗片：在染色架上取出已经封闭好的切片，每两张未裱片的切片上背靠背贴放，再放进提前加有pbs磷酸盐缓冲液的染色缸中，随后将染色缸置于水平摇床上，洗片条件：5min/次×3次。

一抗反应：取出切片，使用吸水纸抹去样本周围多余的液体，再将提前配制好的一抗滴加在各样本切片上，一般滴加抗体剂量约为50μl(根据样本组织的大小决定具体的滴加剂量)。随后小心将切片置于暗盒内，孵育条件：4℃冰箱过夜(空白对照组不加一抗，使用pbs代替)。

洗片：次日从4℃冰箱取出暗盒，再放在37℃的恒温箱内，进行复温，时间30min。随后每两张未裱片的切片上背靠背贴放，再放进提前加有pbs磷酸盐缓冲液的染色缸中，置于水平摇床上，洗片条件：5min/次×3次，洗去一抗。

二抗反应：进行此步骤时需要在不影响自身视觉的暗室中完成，为了避免正常光照对荧光信号标记的抗体产生影响。擦去组织表面的液体，按照实验浓度为1：100进行滴加由fitc标记的荧光二抗，滴加抗体剂量约为50μl(根据样本组织的大小决定具体的滴加剂量)。用移液器枪头将样本组织表面的抗体拨匀，再将暗盒放入37℃恒温箱中，避光孵育60min。

洗片：重复(8)操作。

pi染核浆：将暗盒中待测切片组织表面的液体擦去，待组织表面的缓冲液刚好干燥后，逐个滴加提前配置好的pi(50μg/ml)染液，避光，染色时间为3min。

封片：洗片条件：5min/次×3次，再在组织上滴加50％的甘油10μl，在滴有甘油的组织上盖好盖玻片，放置暗盒中，待测。

共聚焦显微镜观察：将待测样本放在共聚焦荧光显微镜下选取视野拍照并保存。

活性氧ros的测定：

选取的海马组织放入预冷的pbs中，清洗血迹，清理完周边脂肪组织后用眼科剪剪碎组织块至1mm³左右的小块。

加入适合剂量的胰酶消化液，使用37℃恒温水浴锅消化半小时，消化期间不断吹打细胞。

pbs终止消化，组织团块使用300目的尼龙网进行过滤除去，随后收集细胞，离心机500g，10min，离心结束后去除上清液，再重悬制备海马单细胞悬液，显微镜下计数≥10⁶个细胞即可。

在单细胞悬液中，加入荧光探针dcfh-da，工作浓度10μm，于37℃孵育1小时后再次收集悬液，离心机1000g，5min，收集最后的单细胞再用pbs洗涤1-2次后收集，荧光检测波长设置为激发光500nm，发射波长525nm，结果按照荧光度值表示。

wst-1超氧化物歧化酶sod活力：

该试剂盒采用的是嘌呤氧化酶法检测sod的活力，按照表5加样：

表5.加样方案

计算公式：

tba法检测丙二醛mda的含量：

将组织标本，以预冷的生理盐水为匀浆介质，制成10％的组织匀浆，离心取上清液。按照表6操作。

表6.检测丙二醛mda含量的操作方案

使用漩涡器混匀后封口膜封好，针头在封口处刺一个小口，水浴锅调整至95℃，40min，将试管取出后在流水下冲洗至冷却，离心机4000g,10min,抽吸上清液在532nm处以蒸馏水调零，采用1cm光径测试吸光度值并记录。

组织中mda含量计算公式：

微板法检测组织中还原性谷胱甘肽gsh的含量：

将组织，以预冷的生理盐水为匀浆介质，标本制成10％的组织匀浆，离心取上清液。抽取待测样本0.5ml，加入试剂一应用液2ml,混合均匀后4000/转分离心，共离心10min，离心结束后取上清液1ml按照表7操作进行显色反应。

表7.检测还原性谷胱甘肽gsh含量的操作方案

混合均匀后静置5min，在420nm处，选择1cm光径进行蒸馏水调零，比色管测定各管od值并记录数据。

组织中gsh含量计算公式：

caspase-3活性检测试剂盒-检测亚砷酸钠、2-apb、dantrolene对大鼠海马、纹状体内caspase-3酶活性的影响

caspase-3ρna标准曲线的测定：

(1)标准品制备：将10mmρna的标准品用反应缓冲液依次梯度稀释至浓度为：200μm、100μm、50μm、20μm、10μm、0μm的标准品，待用，同时需要设置不加ρna的对照零管。

(2)每个样本分别抽取100μl，加入96孔板，使用酶标仪在a405nm处测定吸光度值。

(3)计算：测定标准品孔减掉空白对照组分别在a405处的吸光度值，计算所得数据使用elisa软件绘制ρna在od405nm处的标准曲线，如图14所示。

亚砷酸钠、2-apb、dantrolene作用于大鼠海马、纹状体内caspase-3酶活性的测定：

(1)各组分别选取三只大鼠，断头处死之后将分离的的海马及纹状体组织放入预冷的pbs中，清洗血迹，清理完周边脂肪组织后用眼科剪剪碎组织块至1mm³左右的小块。按照每100mg组织加入1ml的裂解液，再用细胞超声粉碎仪进行粉碎组织，超声完成后在冰盒中静置，随后放置在冰上充分裂解大于20min，裂解完成后在使用离心机之前需要配平，配平以后4℃离心机以12000rpm/min离心，离心后取上清放进提前预冷的高压无菌离心管中，记号笔做好记录标记。

(2)应用bradford法，多次测量各个样本组的数值，选取平均值后再用裂解液将其配平。

(3)按照表8将每个样本分别加到96孔板中：

表8.96孔板的操作方案

(4)样本迅速加样完成后，需要封口膜将酶标板进行密封，在37℃恒温孵育时需要锡箔纸包裹，避光，反应时间2h之后观察酶标板中样本的颜色是否产生变化，如果明显变黄，可以立即用酶标仪检测，但是如果颜色未见明显变化，就需要适当延长反应样本与试剂的时间，待到样本的颜色产生显著的变化时，测定od值，本次实验需要独立重复操作3次。(5)汇总所得的标准曲线数据以及测得样品a405数据，计算在样品中所生成的ρna的浓度。使用spss19.0处理实验数据，进行统计学分析。

统计学处理：

实验重复3次。使用spss19.0统计软件进行统计学分析，数据以mean±sd表示,多组间进行比较使用单因素方差(anova)统计分析，若组间两两比较使用lsd-t检验。以α＝0.05为检验水准，以p<0.05为差异有统计学意义。

根据本发明实施例1的实验过程以及检测数据从以下几个方面研究ca²⁺阻断剂对染砷大鼠脑神经的影响：

(1)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元形态结构的影响：

光镜下显示：

正常对照组，海马神经元多层密集整齐排列，胞体形态规整，胞质丰富，胞体与胞浆界限清晰可见(参见图1中的a、b)(×200，×100)；

10mg/kg中剂量naaso2染毒组海马神经细胞层数锐减，排列稀疏,胞体形态不规则，部分细胞坏死脱落较明显(参见图1中的c)(×100)；

dantrolene处理组以及2-apb处理组的海马神经细胞较染毒恢复组数量及层数有所增加，排列不规律，可见部分细胞形态欠规则但较单独恢复组形态较规则(参见图1中的d、e)(×100)；

2-apb+dantrolene联合处理组的神经元形态较为规整，排列层数明显增加，脱落细胞明显减少。

(2)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元中尼氏体形态结构的影响

nissl染色染色显示：

正常组的核仁明显，神经细胞的细胞核大且圆，界限清晰，尼氏体丰富，可见明显轴丘及突触结构(参见图2中的a、b)(×400，×1000)；

10mg/kg中剂量naaso2染毒组(参见图2中的c)与正常组进行比较，大鼠海马ca3区的神经元细胞分层明显不清晰，着色较浅，并且细胞每层的排列明显不规则，神经元排列紊乱，失去正常排列组合顺序，出现神经元的部分丢失，以及细胞数量减少，细胞核变形及萎缩明显，视野可见细胞中核异染色质向周边聚集，尼氏体及突触结构不清晰且数量减少(×1000)；

dantrolene处理组以及2-apb处理组(参见图2中的d、e)虽然尼氏小体较正常组少，排列紊乱正常排列结构仍然缺失，细胞核形态大小不一(×1000)，但较染毒恢复组海马神经元细胞的损伤已经得到了明显的改善；

2-apb+dantrolene联合处理组(参见图2中的f)的神经元细胞镜下可见：细胞分层较明显，排列较整齐，细胞膜的结构未见明显缺损，较为完整，与单独用药组相比细胞核形态规则，神经元胞核形态正常，在细胞核内异染色质分布均匀，尼氏体可见，并且尼氏体的数量显著增加。

(3)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元定性定位观察的影响

正常组排列规整(参见图3中的a)，可见明显规则细胞核，神经细胞排列规则且细胞核边界清晰，细胞质边界可见(×400)(参见图3中的b)；

10mg/kg中剂量naaso2染毒组排列不规则，层数较少，可见多边形细胞形态，且可见神经细胞和神经胶质细胞交叉排列，细胞核形态不规则(×400)，(参见图3中的c)；

dantrolene处理组以及2-apb处理组排列较染毒组较为规整，可见较完整细胞边界(×400)，(参见图3中的d)；

2-apb+dantrolene联合处理组排列较单独用药组规则，可见清晰细胞核及细胞质边界，层数较染毒组增加，细胞形态较整齐均匀(×400)。

(4)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经细胞的超微结构影响

神经元：

参见图4-1中的a，正常神经元，可见细胞核，核仁清晰可见，核染色质均匀分布，神经细胞界限轮廓清晰可见，线粒体及内质网等细胞器丰富，细胞结构完整。

参见图4-1中的b，染毒组细胞核裂解为碎块，染色质分布减少较为稀疏，胞质肿胀呈现空泡状，胞质及胞质内的细胞器明显减少，线粒体空泡明显，线粒体嵴呈絮状变性，水肿明显，神经细胞核内有异染色质明显聚集，并且呈现出早期的凋亡改变；

参见图4-1中的c，dantrolene处理组以及2-apb处理组细胞核中有空泡状改变，异染色质稀疏数目较少，细胞核中有水肿表现，可见轻微线粒体水肿；

参见图4-1中的d，2-apb+dantrolene联合处理组可有效改善海马神经元的细胞损伤，细胞核中染色质较为均匀，神经元的形态较规则，细胞膜轮廓清晰，细胞质中线粒体肿胀较轻，核膜较为完整，较单独用药组明显缓解。

神经胶质细胞：

参见图4-2中的e，正常神经胶质细胞，边界轮廓清晰，可见核仁，异染色质核糖体丰富且均匀分布，核膜完整；

参见图4-2中的f，染砷组核膜固缩，细胞质水肿明显，细胞器明显减少，核染色质分布不均匀，有团块状并向核膜边缘聚集；

参见图4-2中的g，dantrolene处理组以及2-apb处理组胞质水肿，胞核固缩，溶酶体增多；

参见图4-2中的h，2-apb+dantrolene联合处理组细胞核形态完整，胞核位于中央，胞质水肿减轻。

神经毡：

参见图4-3中的i，正常神经毡，可见清晰的线粒体嵴结构，神经突触结构较为完整，并可观察到数量适中的突触小泡；

参见图4-3中的j，染砷组神经丝水肿明显，内质网扩张，空泡明显；

参见图4-3中的k，dantrolene处理组以及2-apb处理组可见线粒体水肿，溶酶体增多；

参见图4-3中的l，2-apb+dantrolene联合处理组神经丝水肿减轻，基质内空泡依然明显。

(5)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经元胞内游离ca2+浓度的影响

为了检测砷及内质网钙离子阻断剂对大鼠海马神经元细胞中钙离子浓度的变化，我们以fluo-4/am为荧光指示剂,采用流式细胞仪进行测定，收集胰酶消化的海马神经元，加入5μmol/l的fluo-4/am置于37℃中水浴30min，洗涤后将细胞移入测定管中，分别在激发波长488nm，发射波长516nm进行ca²⁺浓度测定。

由流式细胞仪检测结果可见，与正常对照组相比，亚砷酸钠处理后，神经元钙离子浓度明显增加(p<0.05)；

使用内质网钙离子阻断剂2-apb和dantrolene单独作用染砷大鼠后，钙离子浓度明显下降(p<0.05)；

两种内质网钙离子阻断剂共同作用后，钙离子浓度也表现出了显著的降低趋势(p<0.05)。

(6)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织蛋白浓度bca的影响

参见图5，海马组织bca检测：根据标准曲线绘制，计算回归方程后，所得数据如下：正常组蛋白浓度均高于10mg/kg中剂量naaso2染毒组及药物处理组，组间存在显著性差异，p<0.05。

(7)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内grp78蛋白表达水平的影响

10mg/kg中剂量naaso2染毒组与正常组比较，海马组织糖调节蛋白grp78蛋白的表达水平下降(p＜0.05)；

2-apb和dantrolene单独用药组与10mg/kg中剂量naaso2染毒组比较，海马组织糖调节蛋白grp78蛋白表达水平升高(p＜0.05)；

2-apb+dantrolene联合用药组与2-apb和dantrolene单独用药组比较，联合用药组海马组织糖调节蛋白grp78蛋白表达水平升高(p＜0.05)。

(8)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内caspase-12蛋白定位及表达表达水平的影响

免疫荧光定位的检测结果证实，正常组的大鼠海马组织中内，如图10所示，caspase-12在神经元中表现绿色的荧光信号，而神经元细胞核则会表现出红色的荧光信号，图11中的merge图显示：绿色荧光信号主要分布在海马神经元细胞质内，染砷组组a与正常组相比，绿色荧光强度明显增强；单独药物b作用于染砷大鼠与染砷组相比，绿色荧光强度逐渐减弱；联合用药组c荧光强度减弱明显；但绿色荧光信号在图11中c所示，始终聚集在海马神经元的细胞质内。

(9)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内活性氧ros水平的影响

参见图6，为了进一步研究naaso2及2-apb和dantrolene药物对海马组织中ros水平的影响，我们分别进行：定性观察需要使用荧光显微镜，定量分析需要使用荧光分光光度计测定组织中ros的含量；使用荧光显微镜进行观察结果表明：10mg/kg中剂量naaso2染毒组的绿色与正常组相比较，荧光强度明显增强；而在单独药物作用组荧光强度有所减弱；在联合用药组时荧光强度明显减弱；此时荧光的强弱程度反映了：不同药物处理之后的组织中的活性氧的水平。

荧光分光光度计分析结果表明：采用单因素方差分析显示组织中的ros含量在各组间的比较存在差异，具有统计学意义，随后使用lsd进行组间多重比较，10mg/kg中剂量naaso2染毒组的ros含量与正常组相比较明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，提示砷中毒可导致海马及纹状体组织的ros水平显著升高；

dantrolene处理组以及2-apb处理组的ros含量低于10mg/kg中剂量naaso2染毒组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；

2-apb+dantrolene联合处理组的ros含量与染毒恢复组具有明显差异，有统计学意义(p＜0.05)。

(10)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内sod活力的影响

参见图7，10mg/kg中剂量naaso2染毒组与对照组相比,大鼠海马组织内sod活力均显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)；

当dantrolene以及2-apb分别作用于大鼠时，大鼠海马组织内sod活力和10mg/kg中剂量naaso2染毒组相比较均表现为上升趋势；

2-apb+dantrolene联合处理组表现为明显的上升趋势,差异均具有统计学意义(p<0.05)。

(11)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内mda含量的影响

参见图8，10mg/kg中剂量naaso2染毒组与对照组相比,大鼠海马组织内mda含量均显著上升，差异具有统计学意义(p<0.05)；

当dantrolene以及2-apb分别作用于大鼠时，大鼠海马组织内mda含量和10mg/kg中剂量naaso2染毒组相比较均表现为下降趋势；

2-apb+dantrolene联合处理组表现为明显的下降趋势,差异均具有统计学意义(p<0.05)。

(12)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内gsh含量的影响

参见图9，10mg/kg中剂量naaso2染毒组与对照组相比,大鼠海马组织内gsh含量均显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)；

当dantrolene以及2-apb分别作用于大鼠时，大鼠海马组织内gsh含量和10mg/kg中剂量naaso2染毒组相比较均表现为上升趋势；

2-apb+dantrolene联合处理组表现为明显的上升趋势,差异均具有统计学意义(p<0.05)。

(13)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内bcl-2及bax蛋白表达水平的影响

参见图11，10mg/kg中剂量naaso2染毒组与正常组比较，海马组织抗凋亡蛋白bcl-2蛋白的表达水平下降(p＜0.05)，凋亡蛋白bax蛋白表达显著升高(p＜0.01)；

2-apb和dantrolene单独用药组与10mg/kg中剂量naaso2染毒组比较，海马组织抗凋亡蛋白bcl-2蛋白表达水平升高(p＜0.05)，凋亡蛋白bax蛋白表达水平显著降低(p＜0.01)；

2-apb+dantrolene联合用药组与2-apb和dantrolene单独用药组比较，联合用药组海马组织抗凋亡蛋白bcl-2表达水平升高(p＜0.05)，凋亡蛋白bax蛋白表达显著降低(p＜0.05)。

10mg/kg中剂量naaso2染毒组与正常对照组比较，蛋白bcl-2/bax比值明显下调(p＜0.05)；

2-apb+dantrolene单独用药组和联合用药组与10mg/kg中剂量naaso2染毒组比较，蛋白bcl-2/bax比值明显升高(p＜0.05)。

(14)ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织内caspase-3酶活性的影响

参见图12，大鼠用naaso2、2-apb和dantrolene及药物联合作用之后，制备样本使用caspase-3试剂盒检测，在用elisacalc软件作出a405nm处所得的数据的标准曲线，进一步计算出不同待测样品中的(ρna)的浓度。naaso2、2-apb和dantrolene不同药物处理大鼠后海马组织样本数据与对照组比较，各药物组与空白对照组均存在统计学差异(p<0.05)；10mg/kg中剂量naaso2染毒组的caspase-3活性表达较其他样本组显著增强，但2-apb和dantrolene药物处理组caspase-3的活性表达较染毒组减弱，联合处理组caspase-3的活性表达进一步降低，caspase-3活化减少，表明药物作用降低了神经元的调亡。

通过上述实验过程、实验数据以及对各组实验数据的分析可知：

内质网ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经细胞形态的影响：

神经生理学的实验研究结果表明，海马区域在动物体内不仅是综合情感及行为、学习记忆等进行高级神经活动的重要结构，同时也是对神经活动的信息进行处理的重要部位。动物对事物产生的一系列认知功能都由其进行支配，同时也涉及动物的空间定位导航能力。正常的神经元细胞排列方式是由密集的细胞构成的带状，其排列及层数规则，细胞轮廓界限清晰，而海马结构的完整对其行为能力和认知的获取相当重要。

本实验的研究病理结果显示，经过he染色的切片观察到，正常组神经元形态完整，结构轮廓清晰可见，排列规则，而染毒组的海马神经细胞的排列混乱，细胞脱落及坏死水肿明显。2-apb及dantrolene药物可以通过减轻细胞的氧化应激损伤，进一步减少细胞凋亡来抵抗抗神经组织的损伤，在本发明的研究中，使用2-apb及dantrolene治疗后的大鼠恢复组，其海马中的神经细胞从形态和结构排列方面来说，虽未能达到正常组的细胞水平，但与naaso2染毒组比较已有明显改善，其细胞脱落及胞质减少情况减轻；

本发明的上述实验结果说明，2-apb及dantrolene可以有效改善抑制砷中毒所致的神经元细胞的应激损伤。

另一方面，本实验研究通过对大鼠脑片进行尼氏染色后可以观察到，naaso2染毒组的海马区域神经细胞的数量显著减少，神经细胞当中尼氏体含量减少，胞质着色变浅，存活的神经细胞的形态也有不同程度的受损，而2-apb及dantrolene药物处理组的大鼠海马区域的神经细胞的受损程度要明显小于naaso2染毒组，其神经细胞着色较深，尼氏体及胞浆异染色质丰富，胞质未见明显水肿，这说明2-apb及dantrolene对慢性砷中毒大鼠的海马中的神经细胞起到了明显的保护作用；

本发明的上述实验结果说明，2-apb及dantrolene可以有效恢复及改善慢性砷中毒所致的神经细胞的形态，以此来维持神经系统的钙离子稳态，保证其正常生理功能的执行，同时可以有效调控组织正常基因的表达。

内质网ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经细胞氧化应激的影响：

上述实施例1的实验结果表明，naaso2染毒组的ros水平显著高于正常对照组，2-apb及dantrolene的ros水平趋于正常，使细胞内的氧化应激反应明显减轻并改善；在机体的各种细胞中都有谷胱甘肽存在，其主要存在形式有两种：还原型谷胱甘肽(reducedglutathione，gsh)、氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione，gssg)。

gsh作为自由基清除剂可以由电子和质子传递进一步清除自由基，其作为机体中最重要的抗氧化剂可以降低细胞的氧化水平，进一步减少细胞发生的氧化损伤。每当机体发生氧化应激时，gsh的还原过程就会被gssg阻断，从而导致在细胞液中gssg大量的蓄积，此过程会使原细胞内维持的氧化还原平衡被破坏，进一步导致细胞及组织发生损伤反应；上述实验结果表示，naaso2染毒组与对照组比较，gsh含量明显减少，而使用2-apb及dantrolene处理后的大鼠gsh含量有显著回升，说明2-apb及dantrolene能有效改善已被破坏的氧化还原平衡状态，使细胞内损伤减轻；

本发明的上述实验结果显示，naaso2染毒组对照组相比，sod含量明显降低；而2-apb及dantrolene药物组的sod较naaso2染毒组有显著回升，说明药物对其sod组分产生拮抗作用，效果显著。

当机体中氧自由基ros大量的生成会促使超氧化物歧化酶sod的活性下降,此结果会导致细胞膜的脂质产生过氧化损伤，从而生成大量的mda,mda作为脂质氧自由基可以跟氨基和巯基等结构发生交联，其中蛋白质和核酸中富含氨基和巯基，当mda与其结合后会破坏其正常的基本结构构型,影响其原有特征和功能，从而使细胞损伤更为严重。本实验通过检测组织中的mda含量，不仅能够反映各组织细胞中的脂质过氧化的程度高低,同时证明，因其活性产生的变化，可能会影响机体内物质的代谢状态。

本发明的上述实验结果表明，当大鼠在砷中毒的影响之下，机体内mda含量由于过氧化损伤增加而含量升高较为明显，但是当使用钙离子阻断剂2-apb及dantrolene对大鼠进行药物干预的结果显示，其mda含量较染毒组明显下降，并且在联合用药组的效果更加显著，这也说明2-apb和dantrolene能够有效地改善细胞内的过氧化损伤，对组织细胞起到一定的保护作用。

内质网ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马神经细胞超微结构的影响：

由上述结果可知，在大鼠体内的生理状态发生了较为显著的变化，机体的各项生理生化指标与正常值相比较也出现较为明显的改变，这不仅仅影响着机体组织的功能同时也会对其内部形态的改变有显著影响。在进行透射电镜观察之前需要使用切片机进行超薄半切片并对海马组织进行定位染色处理，甲苯胺蓝结果显示染毒组的大鼠海马神经细胞变化与正常组相比较，脱落明显，神经细胞与神经胶质细胞伴行排列，同时因砷毒性作用是神经细胞受损，细胞胞质着色较浅，在使用药物处理之后其形态明显改善，神经细胞增多排列较为整齐规整，细胞质与细胞核轮廓清晰可见。而通过透射电镜进行观察显示，砷染毒组大鼠海马的神经元胞体出现了不同程度皱缩，细胞核变形甚至消失，在细胞核内的染色质分布较正常组不均匀，而在细胞浆内的变化则是：线粒体肿胀并有脱颗粒现象，胞浆空化，细胞器明显减少等病理改变，而当使用2-apb和dantrolene进行药物干预大鼠时，发现其超微结构较染毒组症状减轻，细胞核内的异染色质分布较为均匀，胞浆的水肿程度明显减轻，线粒体空泡及水肿虽然存在但是症状较轻，联合药物处理组改善更为明显，神经丝水肿减轻，神经毡结构清晰可见，突触结构典型。

本发明的上述实验结构显示，砷染毒致大鼠的海马神经元超微结构发生了明显的病理变化，而2-apb和dantrolene有效改善了神经元和神经毡的病变特征，促进了大鼠神经系统相关生理功能的正常发挥。

内质网ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织钙离子浓度的影响：

本实验采用亚砷酸钠制作sd大鼠染砷模型，并以内质网钙离子阻断剂干预，结果显示亚砷酸钠处理后，神经元钙离子浓度明显增加；使用内质网钙离子阻断剂2-apb和dantrolene联合作用染砷大鼠后，钙离子浓度明显下降。

本发明的上述实验结果表明，砷化合物能够和胞内相关的嗜神经细胞依赖性ca²⁺受体相互结合，进一步引发ca²⁺内流，最终则会导致神经元的功能发生障碍；内质网ca²⁺阻断剂能显著减少大鼠的异常活动，并明显改善砷中毒造成的神经元损害，内质网ca2+阻断剂组与正常恢复组相比活动能力明显改善，其机制可能是内质网ca²⁺阻断剂抑制脑细胞ca²⁺内流以发挥抗砷中毒作用。

内质网ca²⁺阻断剂对染砷大鼠海马组织蛋白水平表达的影响：

运用westernblot技术，进一步检测染砷大鼠海马组织中grp78蛋白的表达。与此同时在证实大鼠海马组织中存在grp78蛋白的基础上，使用免疫荧光检测海马神经细胞中，ers引起的另一个标志性蛋白caspase-12的表达水平及定位。在上述实验中本发明人发现，砷中毒大鼠海马组织中grp78在基因及蛋白水平的表达较正常组大鼠显著增加，因grp78是在ers当中的标记性分子之一，因此，若其在蛋白水平的表达上调，则能够说明：在砷致大鼠神经损伤的过程中，存在神经细胞ers反应。ers在有害因素刺激时，能够激活机体的未折叠蛋白反应，从而维持细胞免受损伤，保护细胞的正常功能；但如果应激损伤过于严重，导致不能及时恢复细胞中的内环境稳态，ers就会诱导细胞发生凋亡。

本发明的上述实验结果显示，钙离子阻断剂2-apb和dantrolene在干预染砷大鼠的情况下，能够使grp78的蛋白表达水平降低，说明钙离子阻断剂可能具有抑制染砷大鼠海马神经元中ers产生的作用，从而使海马神经元免受应激产生的损伤。

荧光共聚焦显微镜观察结果显示：2-apb和dantrolene可有效抑制caspase-12蛋白的表达，其中联合用药组较单独用药组的作用较为明显。因而可以推测钙离子阻断剂2-apb和dantrolene，可能通过抑制ers介导细胞凋亡通路，进一步发挥抑制染砷大鼠中海马神经元细胞凋亡的影响及作用。

综上所述，钙离子阻断剂2-apb和dantrolene能够明显抑制染砷大鼠中海马神经元的凋亡，进一步调节grp78和caspase-12蛋白的表达水平，2-apb和dantrolene可能通过有效抑制内质网应激介导的细胞凋亡通路，进而产生抑制大鼠海马神经元凋亡的影响。

由以上结果可知，砷对海马组织的影响主要表现在对其组织内细胞的损伤情况，若砷及砷化合物剂量过高引起氧化损伤严重则有可能会导致细胞发生凋亡。尤其是细胞中相关的这些生理功能长期紊乱，能够造成神经元发生损伤并促进其产生凋亡。细胞凋亡的概念是指：为了有效调控机体的正常发育，同时维护机体内的稳定，生物体发生了由多种基因所调控的细胞主动性的死亡的过程。

本发明的上述实验结果显示，naaso2砷染毒组与对照组进行比较，海马神经细胞的凋亡情况显著增加，凋亡蛋白bax表达水平显著升高，而抗凋亡蛋白bcl-2蛋白表达水平则显著下降。2-apb和dantrolene药物处理组与染毒组相比较，凋亡蛋白bax表达水平显著降低，抗凋亡蛋白bcl-2蛋白表达水平则显著回升，联合用药组效果更加显著。对bcl-2和bax蛋白表达水平进一步分析；上述实验结果表明，naaso2染毒组细胞中凋亡蛋白bax表达水平与海马神经细胞凋亡水平之间呈正相关，当使用药物干预后呈负相关；而抗凋亡蛋白bcl-2蛋白表达水平与海马神经细胞凋亡水平之间则呈负相关，当使用药物干预后呈正相关。

由于细胞凋亡不是一个单一因素就可调控的过程，它的启动主要依赖于，半胱氨酸蛋白酶家族caspase-3的激活，由以上结果可知，当机体的细胞产生应激反应发生损伤，或者是应激过度导致细胞凋亡的时候，抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平就会随之受到影响而降低；随后与其相关联的凋亡效应分子，即caspase-3就会启动。在凋亡发生过程中，caspase-3作为蛋白酶家族最主要的终末剪切酶可以发挥其抑制dna修复的作用，进一步促使dna降解，最终导致细胞发生凋亡，因而在细胞凋亡的发生过程中caspase-3起到关键的枢纽作用。

本发明实验在对大鼠海马及纹状体组织提取蛋白进行检测caspase-3活性时发现，正常大脑组织中caspase-3活性最低，因在此时未发生细胞凋亡，因而无凋亡程序启动，当用砷染毒方式作用于大鼠检测其活性时发现，caspase-3活性显著升高，但在使用药物干预处理之后，其活性又表现为逐渐下降的趋势，说明药物能够有效阻断caspase-3活性的表达。

综上所述：naaso2毒性作用可降低大鼠海马及纹状体神经细胞的活性，影响神经细胞的形态，通过光学显微镜、电子显微镜观察，表明砷对海马神经细胞能够直接产生毒性作用，口服2-apb和dantrolene可以有效改善其毒性作用。

砷毒性作用可引起大鼠体内氧化-抗氧化还原水平的显著变化，损伤发生机制中有氧化应激及内质网应激诱导的细胞凋亡参与，而口服2-apb和dantrolene可有效降低这些应激损害，减轻细胞凋亡进而发挥对机体砷中毒性损伤后的保护作用。

westernblot、免疫荧光和caspase-3试剂盒检测内质网应激与氧化应激诱导细胞凋亡的grp78、caspase-12、bcl-2和bax及caspase-3凋亡信号，参与了2-apb和dantrolene对砷中毒大鼠海马损伤的保护机制。

本发明针对砷中毒机理，推测内质网钙离子可能参与砷致机体产生毒性的发病过程，研究采用内质网钙离子阻断剂有效减轻或改善砷的毒性，从而达到临床用药以降低砷的毒性作用。本发明通过使用钙离子阻断剂丹曲洛林和2-apb作用于染砷大鼠模型，探究其产生的抑制作用可有效减轻脑神经的砷毒性作用，为治疗及改善砷致机体毒性的方式提供新途径，为治疗脑神经砷中毒的药物制备提供了科学的实验依据，具有较强的理论和实际意义。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。