一种用于弓形虫感染预防的核酸疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种用于预防弓形虫感染的核酸疫苗及其应用。
背景技术：
：弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，可引起包括人在内的所有温血动物的弓形虫病。尽管弓形虫病对健康的人群不产生明显的临床症状，但是该病容易对孕妇及孕畜产生巨大的危害。例如，怀孕期间感染弓形虫，弓形虫可通过胎盘垂直传播到胎儿继而引起孕妇及孕畜妊娠期流产、早产、胎儿畸形、死产及阻碍幼儿及幼畜的正常生长，严重的危害了人类的生育健康和畜牧业的发展。除此之外，被弓形虫感染的家畜也是致使人群感染的主要传染源。尽管弓形虫病严重威胁人类的生育健康和制约着畜牧业的发展，但是目前尚无有效、安全的疫苗和药物来预防和治疗人和动物弓形虫病。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于弓形虫感染预防的核酸疫苗及其应用，在预防弓形虫感染上具有良好的效果。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于弓形虫感染预防的核酸疫苗，以pvax质粒作为载体，融合弓形虫cdpk2基因序列，其碱基序列如seqidno:1所示。上述用于预防弓形虫感染的核酸疫苗在弓形虫感染预防中的应用。本发明的有益效果在于：本发明所提供的核酸疫苗(pvax-cdpk2)对弓形虫具有良好的免疫保护效果。附图说明图1为本发明实施例实验中，血清中igg抗体检测结果示意图；图2为本发明实施例实验中，血清中igg1、igg2a抗体亚类的检测结果示意图；图3为本发明实施例实验中细胞因子ifn-γ、il-12、il-4、il-10的检测结果示意图。具体实施方式以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。一种用于弓形虫感染预防的核酸疫苗，以pvax质粒作为载体，融合弓形虫cdpk2基因序列，其碱基序列如seqidno:1所示。钙依赖性蛋白激酶广泛的存在于植物、绿藻及顶复门原虫中，但是它们不存在哺乳动物的基因组中。在弓形虫基因组中大约含有14个cdpk基因，其发现cdpks参与弓形虫宿主细胞的入侵、宿主细胞的逸出及在宿主体内移行等多个重要过程。近期研究表明弓形虫cdpk2主要参与弓形虫的淀粉代谢途径，缺失cdpk2会导致过多的淀粉颗粒积聚在弓形虫速殖子周边，且包囊形成弓形虫株缺失cdpk2后，会导致其丧失了在小鼠体内形成包囊的能力。弓形虫cdpk2基因由5个外显子和4个内含子组成，全长3673bp，负责编码711个氨基酸，分子量约79kd。dna疫苗可经肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射等多种途径接种，方式多样便于操作。当接种dna疫苗后，重组质粒直接被体细胞摄取并表达分泌出抗原蛋白，成为内源性抗原，与mhcclassi类分子结合，形成抗原肽/mhci分子复合物，并递呈至细胞表面，与特异性cd8+t淋巴细胞结合。本实施例将弓形虫cdpk2基因融合到pvax1载体中，构建核酸疫苗pvax-cdpk2，大量提取重组质粒后通过肌肉注射免疫balb/c小鼠，然后对抗弓形虫急性的免疫效果评估。结果显示，该核酸疫苗能够有效地延长弓形虫强毒株rh急性感染balb/c小鼠的存活时间。以下将通过实验对本发明的性能作进一步的说明。一、用于弓形虫感染预防的核酸疫苗(pvax-cdpk2)的制备参照弓形虫cdpk2基因序列，设计了扩增弓形虫cdpk2基因的引物序列。包括：f-cdpk2：ggtaccatgccgctcaagacttcctggr-cdpk2：tctagattacc-ccgtagcgcgaggcg1)虫体基因组rna的提取：收集hff细胞中刚刚逸出的弓形虫rh株于1.5ml的rnase-free离心管，1000g离心10min将上清弃掉，后续实验按天根生化科技(北京)有限公司试剂盒rnapreppuretissuekit使用说明进行；2)rt-pcr扩增目的片段：以步骤1)提取的弓形虫rh株总rna为模板，进行cdpk2基因序列的rt-pcr扩增，实验步骤参考大连宝生物工程公司onesteprt-pcrkitver.2试剂盒的使用说明进行。3)rt-pcr纯化产物的连接：rt-pcr纯化产物的连接反应参照takara公司pmd18-tvector简易操作说明进行；16℃反应6～8h或4℃连接过夜，产物依次标记为pmd18-cdpk2。4)pmd18-cdpk2重组质粒的小量提取：按天根生化科技(北京)有限公司tianprepminiplasmidkit使用说明进行。5)cdpk2的序列测定：将经菌液pcr和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。6)pvax1及目的片段cdpk2的回收与连接：用kpni和xbai双酶切pvax1质粒和pmd18-cdpk2重组质粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒的使用说明分别回收载体及目的片段。然后将经切胶回收纯化得到的cdpk2基因片段定向亚克隆到相应pvax1载体中。16℃反应6～8h或4℃连接过夜，产物标记为pvax-cdpk2。二、大量制备质粒1)挑取含有目的质粒(pvax1和pvax-cdpk2)的阳性菌液于lb(含1000u/mlkan+，下同)固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于10mllb液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h。将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有400mllb培养基的1000ml锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜。2)将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，10000rpm离心6min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出。10ml预冷的solutioni重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在solutioni中完全分散。加入1ml新配制的10mg/ml溶菌酶溶液(ph8.0)，震荡混匀。3)加入20ml新配制的solutionii，轻摇并上下颠倒混匀2～4次。再加入15ml预冷的solutioniii，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加solutionii和solutioniii的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，11000rpm离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50ml离心管中。4)上清与0.6倍体积异丙醇(15ml)混匀，室温放置10min。室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟数分钟，除去残余。加入3mlddh2o充分溶解，再加入3ml预冷的5mlicl溶液，充分混匀(不可吹打)。两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50ml离心管中，加入等体积(12ml)预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。5)加入3mlddh2o或te溶液(ph8.0)溶解沉淀，并加入30μl10mg/mlrnasea，37℃水浴1h除去rna。加入2倍体积(8ml)无水乙醇和1/10体积(300μl)3mnaac溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，11000rpm离心10min，小心将上清吸出(勿倒)，并将离心管倒置于滤纸上控干(非常重要)。加入100μlddh2o或te溶液(ph8.0)，充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用。(三)质粒dna的纯度检测以ddh2o或te(ph8.0)为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(od)值。双链dna纯品的od260/od280值为1.8，若样品od260/od280值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。(四)重组质粒的免疫效果评价1.balb/c小鼠免疫与分组：为了降低应激反应，balb/c小鼠买回后需饲养1周，然后将其随机分为4个组，每组13只，具体分组见表1。表1免疫实验分组情况组别名称第ⅰ组control(不做任何处理)第ⅱ组pbs第ⅲ组pvax1第ⅳ组pvax-cdpk2以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将提取纯化的重组质粒空载体pvax1和pvax-cdpk2用pbs(ph7.4)溶液稀释至100μg/100μl，于第iii组和iv组中每只小鼠各注射100μl；第i组不给与任何免疫，第ii组则肌肉注射免疫100μlpbs。初次免疫后，第2w和第4w各自加强免疫一次分别在免疫前取3只小鼠通过尾部采血冻于-20℃。2.血清中igg抗体及igg1、igg2a抗体亚类的检测：将收集的到的血清按照1:25的比例稀释，稀释后的血清用于检测抗弓形虫igg抗体及igg1、igg2a抗体亚类。详细实验操作步骤参照美国southernbiotech公司生产的sbaclonotypingsystem/hrp试剂盒说明。检测结果如图1、图2所示。通过分析免疫前后balb/c小鼠血清中igg抗体水平的变化，发现在免疫前，各组之间的igg抗体水平没有显著地差异(p>0.05)。随着免疫次数的增加，实验组的igg抗体水平呈逐渐上升趋势，而三个对照组的igg则基本上保持不变。第三次免疫后，实验组的igg抗体达到最大，且明显高于三个对照组(p<0.05)而igg抗体在三个对照组之间没有明显的差异(p>0.05)，说明免疫pvax-cdpk2可以诱导balb/c产生较好的体液免疫应答。为进一步确定pvax-cdpk2酸疫苗引起的免疫类型，分析了最后一次免疫2周后小鼠血清中igg1和igg2a抗体亚类水平的变化。结果显示pvax-cdpk2核酸疫苗免疫组中的igg1与igg2a抗体水平明显的高于三个对照组(p<0.05)，而igg1与igg2a抗体水平在三个对照组之间没有显著地差异(p>0.05)。通常认为，若igg2a的抗体水平高于igg1，则主要引起th1型免疫应答反应。反之，则引起th2型免疫应答反应。在抗弓形虫感染中，th1型免疫应答反应起主导作用。通过分析igg2a与igg1比值发现，pvax-cdpk2酸疫苗引起机体产生的igg2a抗体水平的增长速度快于igg1，说明pvax-cdpk2酸疫苗可引起机体产生较好的th1型免疫反应。3.细胞因子ifn-γ、il-12、il-4、il-10的检测：在三免后2周，每组取3只小鼠采血后经颈椎脱臼致死。采脾前，将小鼠置于75％乙醇溶液中浸泡消毒。用无菌手术镊将小鼠取出置于无菌滤纸上，用无菌手术剪剪开小鼠左腹侧中下部，提起腹膜，剪开腹膜后上翻，呈红色长条状脏器即是脾脏。用手术镊提起脾脏，手术剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。在rpmi-1640溶液中清洗后，将脾脏置于无菌200目的尼龙网上，用无菌研磨棒轻轻研压脾脏。用rpmi-1640洗网筛后，收集细胞悬液，将细胞悬液用1500×g离心10min。洗涤2次后，加入适量红细胞裂解液，小心吹打3min以破除红细胞。然后用rpmi-1640洗涤2次，最后细胞悬浮于10％fbs的rpmi-1640细胞培养液中，取脾淋巴细胞悬液45μl，与5μl0.4％台盼蓝染液混合染色，在显微镜下计数活细胞应在95％以上才可进行下一步实验。调整上述制备好的脾淋巴细胞浓度为3×106个/ml，在96细胞培养板中每孔加入100μl，然后加50μl5μg/mlcona或者10μg/mlstag，置于37℃5％co2培养箱中培养。每组每只balb/c小鼠须接4个平行孔，分别收集细胞上清用于il-10、ifn-γ、il-4及il-12细胞因子的检测。培养24h后收集脾淋巴细胞上清检测细胞因子il-4，72h后收集脾淋巴细胞上清检测细胞因子il-10、96h后收集脾淋巴细胞上清检测细胞因子ifn-γ和il-12，检测细胞因子的详细步骤参照ebioscience公司mouseelisakitwithpre-coatedplates系列试剂盒的说明书。检测结果如表2所示。表2将经stag刺激的脾淋巴细胞培养液的上清，检测细胞因子ifn-γ、il-4、il-12、il-10。结果显示：与三个对照组(pbs、pvaxi和control)相比，pvax-cdpk2核酸疫苗免疫组待检血清中ifn-γ、il-12和il-10含量显著性升高(p<0.05)，而il-4的含量在实验组与三个对照组没有明显的差异(p>0.05)，提示pvax-cdpk2重组质粒多次免疫balb/c鼠，可刺激机体产生较强的th1型细胞免疫应答。4.脾淋巴细胞增殖实验：调整上述制备好的脾淋巴细胞浓度为3×106个/ml，在96细胞培养板中每孔加入100μl，每组每只小鼠须接种3个平行孔，前两孔分别加50μl5μg/mlcona和10μg/mlstag，第三孔加50μl10％fbs的rpmi-1640置于37℃5％co2培养箱中培养68h。在培养结束前4h，每孔加入10μlcck-8溶液，于振荡器上混匀2～3min后，然后放在培养箱内继续培养4h。培养结束后，用酶联免疫检测仪在570nm波长读取吸光度值。脾淋巴细胞的增殖能力即刺激指数(stimulationindex，si)用odstag/odcontrol与odcona/odcontrol的比值来表示。实验结果如表3所示。表3通过用cck-8法检测pvax-cdpk2核酸疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，结果显示：实验组pvax-cdpk2中的脾淋巴细胞的增殖能力显著地高于三个对照组(p<0.05)(表5.3)。但是三个对照组之间的差异并不显著(p>0.05)。利用流式细胞术进行检测，结果如下：pvax-cdpk2核酸疫苗免疫组中的cd3+cd8+cd4-和cd3+cd4+cd8-t细胞占全淋巴细胞的百分比显著性地高于三个对照组(p<0.05)。但是cd3+cd8+cd4-和cd3+cd4+cd8-t细胞的含量在三个对照组之间没有明显地差异(p>0.05)。5.腹腔注射感染弓形虫rh株：将rh速殖子接到25t或者75thff细胞瓶中，当大约有75％的虫体逸出时，用细胞刮子将hff从瓶底刮起，将细胞悬液转移到15ml无菌的离心管中，用18g针头破碎3-5次后，再用27g针头破碎3-5次，使宿主hff细胞在机械作用下破碎，让在宿主细胞内的虫体逸出，用3μm滤器过滤虫体，除去细胞碎片。在室温条件下，500g离心10min，弃掉上清，加入适量pbs通过血球计数板计数，使虫体的浓度达到5000个/ml。三免之后，通过腹腔注射感染弓形虫rh株200μl即每只小鼠攻1000rh个速殖子。实验结果如图3所示。结果显示：三个对照组在感染弓形虫rh速殖子后，balb/c小鼠均在8天内死亡，且三个对照组之间不存在显著性差异(p>0.05)，而pvax-cdpk2核酸疫苗免疫组的死亡时间显著地长于三个对照组(p<0.05)。说明pvax-cdpk2核酸疫苗可引起机体产生较好产生了抗弓形虫感染的免疫保护性。对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>一种用于弓形虫感染预防的核酸疫苗及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2136<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1atgccgctcaagacttcctggcattgttcgtgcaacgccacctttccaggtgacttgctc60atggttgttgctaaccacgatcgcgtgggcaactggaatcctcagaactcggtggttctt120tcgacagacgcatcctctttcccgacatggcgctctggcgaggtctgcttcgacgagcag180cagcccgtccggctcgagtacaagctgattattcgccgcgcctcaggagaaatttactgg240gagccgattcccaccaaccgcgtagtcacgctgactgcgaatacgtcctcagtcatcgaa300aacgtttggggttcgctggccacttgctccatcaccttcttcccgctgcagccgattccg360tccccgtccttctacaagcacgcagaaaggacgaagaaagaggccagttccgtccatctg420cactccgcctccatttccgacgactccgggtccgacactgggacatgttcacaggtcgac480gaatcgcgaacgcaacgcaacgtccgcggacagcctgcctccgtggggacggggaaggcc540acagccgccgagagaggcggcaaaggatacgtcatgccgcatcaccagtgcagcaccagc600cagagacgccactccatcagtacgcaagctgcggacgaagcggccggcggagggaatcgc660gtttccttcaaacgctccgccttcattttggccaacactggtcccatcacaaactactac720acagtctcaaagacaattgggcgtggcacatggggagaagtgaagctggtcattgacaac780gggaccggagcgcgtcgcgcggcgaagaagattcccaagtgttacgttgaagacgccgac840cgttttcgtcaggaaatcgagatcatgaagagcctcgaccacccaaacattgtgcgactc900tacgagactttcgaggatatgacggacttctacctggtgatggagtactgcactgggggc960gagctctttgatcgcttggttcaccagggtgtcttcacagaggctctggcctgccgcatc1020atgcggcagattctcgcagctgttgcttattgccatgcccaccgcgtcgcccaccgagac1080ctgaagccggagaacttcctgtttttgcatgacaaccccgaatctcccatcaagctcatc1140gacttcggcctcgccgctcgtttcaagtctggacagcccatgaggacgagagccgggacg1200ccttactatgtatcgccgcaggtgttggagggacggtatggcccagagtgcgacgtctgg1260tccgccggagtcatgatgtacattctgctttgtgggtatcctccgttcaatgcgccgtcg1320gacagggcgattatgaacaaagtgcgtgcgggacattacaccttcccagacagcgaatgg1380agtcgagtgtcactacaggccaaggatctcatctcgcgtcttcttgatcgccatccgcgc1440actcgaatcagtgccgagcaagcgctccgacacgcctggttcgccatgcatgctccggga1500gaccattttgagcctctaggcttggacattttgagcaaatttcggcgattccagggcttg1560agtcgactgaagaagctggctctgacggttattgcacagcatttggaggactcggaaatc1620gagggtctcaagaacttgttcactcagctcgacaccgagggtgacggtgtcctgacagtg1680gaggaaattcgcaagggcatcgagcggagcggcgtccacttacctccggacatggtcctc1740gaagatgtcttgagggaagtggacaccgccggcactggaagcattgattacacagagttc1800attgcagcttgcctccaccagtcccactacatccgagaggaggcgtgtcgagctgctttc1860cgcgtgctagatatcaatggagacggcctcgtcagtgctcaagaactgcgccaggtgttc1920cacatggctggtgatttggagacagacgcggcggcggagttgctggaggcagacgcggat1980ggtgacgggcacataactttcgatgagttttgcggactcatgcggaaggtgccgtcgctc2040gccttggtcacggagcacacagtgtcgatgatgcggcgaacgtgttcgcgcacaaacatc2100agcgaagccagtctgacgcctcgcgctacggggtaa2136当前第1页12