一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

旋毛虫（trichinellaspiralis）是一种人畜共患的寄生性线虫，可寄生于包括人、猪、犬、鼠、猫等150多种哺乳动物，引起旋毛虫病。猪和鼠的相互感染是人类旋毛虫病流行的重要来源，其中猪为主要的动物传染源。生食或半生食受染旋毛虫幼虫囊包的猪肉是人群感染旋毛虫的主要方式。旋毛虫病呈世界性分布，主要表现为发热、水肿等症状，继而出现肌肉疼痛、四肢乏力等症状，严重者可导致死亡。近年来，世界许多地区均出现了该病的流行与爆发。在我国，云南、河南、广西、西藏和四川等地均出现过居民由于食入生的或未煮熟的猪肉和狗肉而发病发生死亡的案例。在畜牧业中，猪旋毛虫病是肉类食品安全性的一个重要问题，给养猪业和肉类贸易造成巨大的经济损失。迄今为止，旋毛虫病尚无快速有效的诊断方法。因此研制疫苗，是预防该疾病发生发展的重要策略。在旋毛虫疫苗技术研究方面，针对旋毛虫病的各类疫苗都处于起步研究阶段，如减毒活疫苗、天然抗原疫苗、合成肽疫苗、重组抗原疫苗、核酸疫苗等多种类型。然而，目前尚无有效的旋毛虫疫苗。

在旋毛虫的整个生活周期中，抗原在宿主环境和宿主免疫应答中起着重要的作用。根据旋毛虫解剖部位将其分为表面抗原、排泄-分泌（es）抗原、虫体抗原和杆细胞颗粒相关抗原。由于旋毛虫虫体粗抗原及表面抗原成分复杂，且旋毛虫不能通过体外培养完成整个生活史，难以通过人工感染动物标准化批量生产的方法制备此类抗原，无法满足免疫诊断及免疫预防用抗原的需要。es抗由发育成熟的幼虫杆状体分泌，直接暴露于宿主的免疫系统且具有较好的特异性，是诱导宿主产生免疫应答反应的主要靶抗原，也是重要的疫苗候选分子。由于旋毛虫目前仍无法在体外进行传代培养，所获得的es抗原难以保证其稳定性，并且es抗原是多种抗原的混合物，难以区分有效抗原成分或纯化处理。随着基因工程技术日趋成熟和多样化发展，基因重组抗原具有可大量制备、特异性好等优点而越来越受到人们的重视。因此重组es抗原成为旋毛虫病免疫学防治的焦点。

研究发现旋毛虫肌幼虫es产物的培养液具有免疫原性。近年来蛋白质组学分析及质谱分析均发现旋毛虫肌幼虫es蛋白中含有一定量的半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶（cathepsin）b、h、l、x等。研究报道肠道线虫、肠道蠕虫的半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的肠道入侵、移行、生殖发育、营养摄取、肌内成囊，以及免疫入侵等过程中发挥重要作用，是抗寄生虫疫苗的重要候选分子。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过3’race-pcr技术扩增得到了一个全新的的旋毛虫组织蛋白酶b基因tscpb2，应用旋毛虫tscpb2基因构建的重组抗原具有良好的免疫原性，可用于制备预防旋毛虫感染的疫苗，制备得到的疫苗具有良好的免疫保护效果，可用于预防治疗猪旋毛虫病。

本发明的目的是提供一种旋毛虫病疫苗。

本发明的另一目的是提供所述旋毛虫病疫苗的制备方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明以tscpb2est序列（accessionno.ex501780）设计基因特异性扩增引物，利用3’race-pcr技术扩增得到了一个全新的的旋毛虫组织蛋白酶b基因tscpb2，其核苷酸序列如seqidno：1所示，其所编码的氨基酸序列如seqid：2所示。

优选地，所述特异性扩增引物序列如下所示：

tscpb2-5’gspouterprimer：5’-cggatctgttgtcctggttgg-3’（seqid：4）

tscpb2-5’gspinnerprimer：5’-ctgttgtcctggttggataaa-3’（seqidno：5）

首先，本发明提供tscpb2基因及其编码氨基酸如下所述的应用：

seqidno：1所示旋毛虫组织蛋白酶b基因tscpb2在制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。

seqidno：2所示旋毛虫组织蛋白酶b2在制备制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。

seqidno：1所示旋毛虫组织蛋白酶b基因tscpb2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。

seqidno：2所示旋毛虫组织蛋白酶b2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。

优选地，是在制备猪旋毛虫病疫苗中的应用。

一种旋毛虫排泄-分泌抗原的制备方法，所述方法为扩增tscpb2基因的成熟区并克隆至his标签的表达载体中，转化大肠杆菌，诱导表达后，ni-亲和层析纯化tscpb2重组蛋白，得到旋毛虫排泄-分泌抗原；所述tscpb2基因的序列如seqidno：1所示，其成熟区序列如seqidno：3所示。

优选地，所述表达载体为pet30a（+）。

优选地，所述诱导表达为在终浓度为1mm的iptg诱导剂中，37℃诱导培养4h。

优选地，诱导表达后离心收集菌体，将菌体重悬后，冻融，加入溶菌酶裂解，再超声破碎，离心得到包涵体蛋白。

所述包涵体蛋白需用去污剂和低浓度的变性剂洗涤，除去脂类和膜蛋白，再溶解得到可溶性蛋白。

优选地，所述去垢剂为tritonx-100，所述变性剂为尿素。

更优选地，将包涵体蛋白用下列溶液各洗涤一次：

a.50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有1%tritonx-100（200ml/500ml菌液）；

b.50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有4m尿素（100ml/500ml菌液）；

c.50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有2m尿素（100ml/500ml菌液）；然后4℃，6000g离心15min；再将沉淀中的包涵体蛋白溶解在以下溶液：50mmtris/hcl,ph7.9、500mmnacl、6m尿素，室温剧烈摇匀过夜，使得包涵体蛋白完全溶解。

优选地，所述ni-亲和层析纯化为将蛋白样品轻轻加入ni柱，控制流速在5ml/h，收集流出液；10倍体积1×bindingbuffer（含6m尿素）过柱，再20倍体积washbuffer（含6m尿素）漂洗杂蛋白；最后用含有咪唑的elutebuffer（含6m尿素）含洗脱目的蛋白。

同时，上述任一方法制备得到的旋毛虫排泄-分泌（es）抗原亦在本发明保护范围内。

另外，所述旋毛虫排泄-分泌（es）抗原在制备旋毛虫病疫苗或旋毛虫病抗体中的应用亦在本发明保护范围内。

一种旋毛虫病疫苗，是将所述旋毛虫排泄-分泌（es）抗原即tscpb2重组蛋白与免疫佐剂混合乳化，得到tscpb2重组抗原疫苗。

优选地，所述免疫乳化佐剂为弗氏佐剂。

更优选地，首次免疫采用弗氏完全佐剂，二免、三免采用弗氏不完全佐剂。

另外，本发明制备得到的旋毛虫病疫苗在防控猪旋毛虫病中的应用亦在本发明保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明制备得到了一种旋毛虫重组es抗原，所述重组抗原具有良好的免疫原性，可用于制备防控旋毛虫病的疫苗。

（2）本发明制备得到了一种旋毛虫病疫苗，该疫苗免疫小鼠或猪，能诱导宿主产生免疫反应，并对旋毛虫感染起到良好的免疫保护作用，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明tscpb2基因的全长核苷酸序列和推导的氨基酸序列；其中，tscpb2的成熟区用阴影表示。

图2为tscpb2重组蛋白的表达与纯化sds-page分析电泳图。a，sds-page分析tscpb2的表达与纯化；m，marker；land1，空载体/细菌未诱导；land2，空载体/细菌iptg诱导；land3，tscpb2/细菌未诱导；land4，tscpb2/细菌iptg诱导；land5，tscpb2/细菌裂解物上清；land6，tscpb2/细菌裂解物沉淀；land7,纯化后的tscpb2蛋白。b，westernblot分析tscpb2的表达。

图3为tscpb2的免疫反应性和分泌表达的检测结果图。a，westernblot分析tscpb2重组蛋白可被旋毛虫感染不同时间（3、6、10、16、20、44天）的小鼠血清识别；b，westernblot分析肌幼虫的es产物（抗tscpb2重组蛋白兔抗体为一抗）。

图4为tscpb2抗原免疫小鼠后诱导产出的免疫反应。分别用tscpb2+fa、tscpb+fa、fa免疫babl/c小鼠，elisa检测免疫小鼠血清中的总igg（a）、igg1（b）、igg2（c）、ige（d）水平。

图5为tscpb2抗原免疫对小鼠旋毛虫感染的免疫保护作用。a，旋毛虫攻击感染tscpb2疫苗免疫小鼠的成虫计数；b，旋毛虫攻击感染tscpb2疫苗免疫小鼠的肌幼虫计数。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种旋毛虫疫苗的制备方法

1、tscpb2基因的克隆

利用trizol（invitrogen，usa）试剂从感染小鼠35天后的肌幼虫提取总rna。应用反转录酶(m-mlvrt,promega)将总rna反转录为cdna第一链。以tscpb2est序列(accessionno.ex501780)设计基因特异性扩增引物，tscpb2-5’gspouterprimer:5’-cggatctgttgtcctggttgg-3’；tscpb2-5’gspinnerprimer:5’-ctgttgtcctggttggataaa-3’。利用3’-race-pcr(takara,japan)扩增tscpb2全序列，操作按试剂盒推荐方法进行。pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳，利用qiaquickgelextractionkit(qiagen,usa)回收pcr产物。将pcr产物克隆至pmd19-t载体，测序获得tscpb2核苷酸序列（图1），其序列如seqidno：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

2、tscpb2重组蛋白的表达

将tscpb2成熟区（seqid：3所示编码氨基酸15～333的序列）克隆至pet30a（+）载体构建pet30a-tscpb2重组表达质粒。将重组表达质粒转化e.colibl21感受态细胞。挑取转化后的单菌落，加入含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养至od600为0.6～1.0，收集菌液。取50μl重组菌液加入到5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃过夜培养。次日将过夜培养的菌液按1:100比例转接至含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜培养基中，继续培养至od600为0.6～1.0，加入诱导剂iptg至终浓度为1mm，37℃诱导培养4h后，4℃，6000g离心15min收集菌体。将菌体重悬在50mmtris/hcl,ph8.0,500mmnacl的溶液中（按照30ml溶液/1l菌液的比例），冻融一次。加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上反应30分钟。超声破碎15min，超声2s停3s，4℃，10000g离心20～30分钟。随后将沉淀用下列溶液各洗涤一次：a,50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有1%tritonx-100（200ml/500ml菌液）;b,50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有4m尿素（100ml/500ml菌液）;c,50mmtris/hcl,500mmnacl，ph8.0含有2m尿素（100ml/500ml菌液），然后4℃，6000g离心15min：。将沉淀中的包涵体蛋白溶解在以下溶液：50mmtris/hcl,ph7.9、500mmnacl、6m尿素，室温剧烈摇匀过夜，使得包涵体蛋白完全溶解。样品溶解之后，4℃，16000g离心30min，收集上清，0.45μm滤膜过滤，准备纯化。

3、tscpb2重组蛋白的纯化（含有6m尿素的变性条件下）

（1）将1ml50%ni-ntahis-bind树脂悬液加入到空色谱柱中，待树脂自然沉降。用3倍树脂床体积的双蒸水过柱，5倍体积1×bindingbuffer（含6m尿素）平衡树脂。将蛋白样品轻轻加入色谱柱，控制流速在5ml/h，收集流出液。10倍体积1×bindingbuffer（含6m尿素）过柱。20倍体积washbuffer（含6m尿素）漂洗杂蛋白。最后用含有咪唑的elutebuffer（含6m尿素）洗脱目的蛋白。sds-page电泳和westernblot分析纯化蛋白。

（2）结果

sds-page电泳结果显示于37kda处有明显条带（图2a），与目的蛋白预测大小相符。利用抗tscpb2重组蛋白抗体进行westernblot检查，结果也显示在37kda处有单一条带（图2b），表明tscpb2重组蛋白纯化成功。

4、tscpb2免疫反应性和分泌表达的检测

（1）每只小鼠感染200条旋毛虫，于感染后第3、6、10、16、20、44d收集血清。用感染旋毛虫的小鼠血清作为一抗，利用westernblot检测重组蛋白tscpb2。结果显示在37kda（tscpb2重组蛋白大小）处，感染后10～44d均出现单一条带，且条带亮度呈递增趋势（图3a）。这表明tscpb2具有良好的免疫反应性。

（2）收集肌幼虫0.1ml（约17万条），用无血清的1640培养液（含双抗）冲洗3遍。以5000条/ml的培养密度用无血清的1640培养液（0.25%葡萄糖，2mm的谷氨酰胺，100u/ml的双抗）于37℃培养24h。收集培养基，用300目无菌虑筛过滤，回收滤液。滤液于无菌生理盐水4℃透析48h后，用amiconultra-15超滤离心管（millipore）超滤浓缩得到肌幼虫分泌蛋白。肌幼虫分泌蛋白用10%sds-page电泳分离，以抗tscpb2重组蛋白抗体为一抗进行westernblot分析，结果显示在34kda处出现单一条带，表明tscpb2是一种排泄-分泌（es）蛋白（图3b）。

5、tscpb2免疫小鼠后诱导产出的免疫反应

（1）tscpb2重组蛋白去除内毒素

重组蛋白用pbs透析后加入1%tritonx-114，4℃30min不间断搅拌使成均质，然后37℃水浴10min，25℃14000g离心15min，小心转移上层水相蛋白。重复此抽提步骤2次完全去除内毒素。

（2）抗原与佐剂乳化

将纯化后的重组蛋白与等体积的佐剂混合制成抗原乳剂（首次免疫采用弗氏完全佐剂（fa,sigma，usa），二免、三免采用弗氏不完全佐剂（sigma，usa），旋涡震荡1小时。将制成的乳剂滴一滴在水表面，若滴入水面保持滴珠完整而不分散则乳化完全。

（3）tscpb2重组蛋白免疫小鼠

balb/c小鼠共3组：tscpb2+fa、tscpb+fa、fa。将两组实验组小鼠皮下注射40μg用完全fa乳化的重组tscpb2蛋白或tscpb蛋白。对照组仅注射pbs配制的fa。随后，以10天间注射相同剂量的用不完全fa乳化的重组蛋白，而对照组注射pbs配制的不完全fa。在免疫后0，10，20和30天收集免疫小鼠尾巴血液。

（4）elisa检测tscpb2免疫小鼠血清的抗体水平变化

用免疫小鼠0、10、20、30天的血清为一抗，羊抗鼠hrp-标记的igg、igg1、igg2、ige为二抗，按照间接elisa检测方法检测抗体水平变化。实验结果显示tscpb2和tscpb三免后，小鼠血清中总igg水平明显升高，并且tscpb2免疫的升高幅度显著大于tscpb免疫（图4a）。tscpb2第三次免疫小鼠后，血清igg1、igg2a均显著增高，而tscpb1第三次免疫小鼠后，igg1水平也显著升高，但igg2a并不明显变化（图4b和4c）。这些结果表明tscpb2免疫后诱导小鼠产生th1/th2混合免疫。此外，tscpb2免疫小鼠后，血清中ige水平在三免后显著升高，统计具有统计性差异（图4d）。

6、tscpb2疫苗免疫对小鼠旋毛虫感染的免疫保护作用

末次免疫小鼠后2周，每只小鼠用400条旋毛虫肌幼虫经攻击感染。攻击后6天计算免疫小鼠小肠中的成虫数目。结果发现，tscpb2免疫后，小鼠小肠中成虫数目显著降低，降低率达52.3%（图5a）。攻击后42天计算免疫小鼠肌幼虫数目。结果显示，tscpb2免疫后，小鼠小肠中肌幼虫数目显著降低，降低率为51.2%（图5b）。

sequencelisting

<110>中山大学

<120>一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用

<130>2017

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1002

<212>dna

<213>tscpb2基因

<400>1

atgaaaattttgttgctcagcttgtttgctttcgctttggcggaaaattatgaagaaaat60

tatgaacgcttgaaagtcgaattggaacgacaacggcaagccaatggcaacactttctct120

tggaaatttggacgaaatgcatatttcaaaaataagtcaattggtgaaatcaaaaagctg180

ttgggctacaggatgttgcctaagacggtgaaagagcgaaatgaaatgccaatgccggaa240

gatttattaaatttggaaaatttcaattatccggtggaatttgactccagaaaacattgg300

cctcagtgtgaaaaagtgatcagcttcataaaagatcaagcaaactgtggaagctgttgg360

gccgtatccagcgcgtccgtcatgtccgaccggacgtgcattgctactgatggtcaattt420

acgacattgctttccgatgccgaacttctttcctgttgtacatcatgcggttatggttgt480

aacggtggatatcctcagagaactttcaaatattgggtgtacagcggtatgccaactggt540

ggaccgtacggctcgaatgacacctgcaaaccatacccaattccaccctgcagtaactgc600

tctgaaacaaggactccaaaatgttccaaaagttgcatctccacttatccactttctttg660

aatgaagatcgacattatggaagcacatattatcaattttggcttggtgaaaaatcaatg720

atgaaagatatttcactatacggacccattgttgcaggaatgtcagtttatgaagacttt780

ttgcattacaaagaaggtgtttatacacaagagagtggaatgtttcttggaggacacgcc840

gtaagaattattggatggggtgaacaagacaacattccgtattggcttgtagccaactca900

tggaatactacatttggtgaagacggattattcaaaataagaagaggctttgacgaatgt960

ggcattgagtcgtatgtgagtgctggacgtgcaaaagtataa1002

<210>2

<211>333

<212>prt

<213>旋毛虫组织蛋白酶b2

<400>2

metlysileleuleuleuserleuphealaphealaleualagluasn

151015

tyrglugluasntyrgluargleulysvalgluleugluargglnarg

202530

glnalaasnglyasnthrphesertrplyspheglyargasnalatyr

354045

phelysasnlysserileglygluilelyslysleuleuglytyrarg

505560

metleuprolysthrvallysgluargasnglumetprometproglu

65707580

aspleuleuasnleugluasnpheasntyrprovalglupheaspser

859095

arglyshistrpproglncysglulysvalileserpheilelysasp

100105110

glnalaasncysglysercystrpalavalserseralaservalmet

115120125

seraspargthrcysilealathraspglyglnphethrthrleuleu

130135140

seraspalagluleuleusercyscysthrsercysglytyrglycys

145150155160

asnglyglytyrproglnargthrphelystyrtrpvaltyrsergly

165170175

metprothrglyglyprotyrglyserasnaspthrcyslysprotyr

180185190

proileproprocysserasncyssergluthrargthrprolyscys

195200205

serlyssercysileserthrtyrproleuserleuasngluasparg

210215220

histyrglyserthrtyrtyrglnphetrpleuglyglulyssermet

225230235240

metlysaspileserleutyrglyproilevalalaglymetserval

245250255

tyrgluasppheleuhistyrlysgluglyvaltyrthrglngluser

260265270

glymetpheleuglyglyhisalavalargileileglytrpglyglu

275280285

glnaspasnileprotyrtrpleuvalalaasnsertrpasnthrthr

290295300

pheglygluaspglyleuphelysileargargglypheaspglucys

305310315320

glyileglusertyrvalseralaglyargalalysval

325330

<210>3

<211>959

<212>dna

<213>tscpb2基因成熟区

<400>3

aaaattatgaagaaaattatgaacgcttgaaagtcgaattggaacgacaacggcaagcca60

atggcaacactttctcttggaaatttggacgaaatgcatatttcaaaaataagtcaattg120

gtgaaatcaaaaagctgttgggctacaggatgttgcctaagacggtgaaagagcgaaatg180

aaatgccaatgccggaagatttattaaatttggaaaatttcaattatccggtggaatttg240

actccagaaaacattggcctcagtgtgaaaaagtgatcagcttcataaaagatcaagcaa300

actgtggaagctgttgggccgtatccagcgcgtccgtcatgtccgaccggacgtgcattg360

ctactgatggtcaatttacgacattgctttccgatgccgaacttctttcctgttgtacat420

catgcggttatggttgtaacggtggatatcctcagagaactttcaaatattgggtgtaca480

gcggtatgccaactggtggaccgtacggctcgaatgacacctgcaaaccatacccaattc540

caccctgcagtaactgctctgaaacaaggactccaaaatgttccaaaagttgcatctcca600

cttatccactttctttgaatgaagatcgacattatggaagcacatattatcaattttggc660

ttggtgaaaaatcaatgatgaaagatatttcactatacggacccattgttgcaggaatgt720

cagtttatgaagactttttgcattacaaagaaggtgtttatacacaagagagtggaatgt780

ttcttggaggacacgccgtaagaattattggatggggtgaacaagacaacattccgtatt840

ggcttgtagccaactcatggaatactacatttggtgaagacggattattcaaaataagaa900

gaggctttgacgaatgtggcattgagtcgtatgtgagtgctggacgtgcaaaagtataa959

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>tscpb2-5'gspouterprimer

<400>4

cggatctgttgtcctggttgg21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>tscpb2-5'gspinnerprimer

<400>5

ctgttgtcctggttggataaa21