基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种基于18SrRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，由无菌去离子水、PCR反应液、TaqDNA聚合酶、GoldViewDNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品组成。本发明试剂盒即可快速、准确地检测出被检标本中的猪旋毛虫DNA，也可用于猪旋毛虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本试剂盒操作步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的大规模检测时，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，大大提高了检测准确率，降低了假阳性率，可在检测猪旋毛虫中的应用。
【专利说明】基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，尤其涉及一种检测猪旋毛虫这种食源性寄生虫的试剂盒， 可在鉴别检测感染猪旋毛虫的标本中应用。
【背景技术】
[0002] 旋毛虫病是一种严重危害公共卫生安全的人畜共患病，它是由旋毛虫 spira/is)成虫寄生于哺乳动物肠道以及幼虫寄生于肌肉组织所引起的疾 病。
[0003] 旋毛虫病呈世界性分布，其中不乏发达国家，而我国是世界上旋毛虫危害最为严 重的几个国家之一。旋毛虫可感染的宿主范围很广泛，对人和动物均有明显的致病性，家畜 中除猫和犬等肉食动物之外，猪患病率最高。旋毛虫感染后可在宿主体内常年寄生，被感染 动物终生带虫。但患病猪往往没有临床症状，人类因生食半熟或生的含有旋毛虫的猪肉而 感染，常常出现胃肠道症状、发热、水肿、血液嗜酸粒细胞增多、原因不明的常年肌肉酸痛等 的病征，重者丧失劳动能力，甚至死亡。由于旋毛虫病的临床表现较为复杂，特别在感染早 期或轻度感染时动物临床症状不典型，常引起忽视或误诊，从而延误救治时机而引起重大 损失，所以准确诊断旋毛虫病并及时治疗是控制该病比较有效的方法。因此，要控制旋毛虫 病的流行必须首先从源头抓起，严格控制食源性寄生虫病在畜禽中流行，把好屠宰检疫关。
[0004] 然而，目前食品安全卫生问题非常严峻，但屠宰检疫技术却相当落后。屠宰动物旋 毛虫病的检测仍采用约180年前发现该寄生虫时的显微镜镜检法，极易造成漏检。这严重 影响了肉品质量，同时也给消费者的健康造成巨大威胁。因此，对建立一种操作简单、快速、 敏感、特异的检测猪旋毛虫方法势在必行。PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的 分子生物学检测方法，它可以在一个反应体系中扩增DNA样本的目的基因片段，特别适用 于感染的大量临床样本的快速诊断。因此，建立旋毛虫PCR快速检测方法，可为临床上防治 该病的提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有 重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，该试剂盒包 含：无菌去离子水、PCR反应液、DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标 准品、对照品。 其中，PCR反应液由PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用引物组成，检测用引物分别为检 测猪旋毛虫的上游引物和下游引物共2条： 猪旋毛虫上游引物（SEQ ID No :1) :5' -CATTCGTGGTTGCTGTTGTTGC-3'， 猪旋毛虫下游引物（SEQ ID No :2) :5' -CGTTGACGCTTTCATTGTAG-3'， 标准品为具有猪旋毛 spira/is)的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
[0006] 对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪旋毛虫DNA片段的DNA样 品，阴性对照为无猪旋毛虫DNA的DNA样品。
[0007] 本试剂盒保存于-20 °C，尽量减少反复冻融。
[0008] 本发明另一个目的是提供所述试剂盒在检测猪旋毛虫这种食源性寄生虫中的应 用。
[0009] 本发明试剂盒使用方法： 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为60 ng/μ 1。
[0010] 1. PCR反应管制备：总体积为25 μ 1，PCR反应液于冰上融化及制备PCR反应管。 依次取PCR反应液22. 8 μ 1，7? DNA聚合酶0· 2 μ 1，浓度60 ng/ μ 1的样品DNA (待检测 样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品）2 μ 1于PCR反应管中混合。用手指轻弹制备好的 PCR反应管或用微量移液器吹打混匀，瞬时高速离心2 s。
[0011] 2.扩增检测：把PCR反应管置于PCR仪上，设置反应条件为：95 °C预变性5 min， 94 °C变性45 s、60 °C退火45 s、72 °C延伸60 s共30个循环，72 °C延伸8min，4 °C保存。
[0012] 3.检测结果判定：将1 g琼脂糖溶于100 ml的0. 5 XTBE电泳缓冲液中，然后加入 5 μ 1 GoldView DNA染料，混匀后煮沸，倾倒凝胶板。凝胶冷却凝固后，将PCR产物8 μ 1与 适量上样缓冲液混合，加入凝胶孔中进行电泳。电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍 照。标准品孔和阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成 功。被检样本孔出现的电泳条带与标准品孔、阳性对照孔相应条带大小一致则判定为阳性， 反之则为阴性。
[0013] 本发明的优点：本发明提供了一种猪旋毛虫单重PCR检测试剂盒，其优点是一个 反应即可快速、准确地检测出被检标本中的猪旋毛虫DNA，也可用于猪旋毛虫感染的分子流 行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的 大规模检测时，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建 立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，大大提高了检测准确率，降 低了假阳性率。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1猪旋毛虫标准品的PCR产物电泳结果。
[0015] 图2猪旋毛虫阳性样本的PCR检测结果。
[0016] 图3本发明对采集的部分标本检测结果。
【具体实施方式】
[0017] 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明 目的，而不用于限制本发明范围。
[0018] 实施例一 本发明提供一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫PCR检测试剂盒，该试剂盒包含：无菌 去离子水、PCR反应液、DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对 照品。 其中，PCR反应液由PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用引物组成，检测用引物分别为检 测猪旋毛虫的上游引物和下游引物共2条(表1)。
【权利要求】
1. 一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由无菌去离 子水、PCR反应液、DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品 组成，其中，PCR反应液由PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用引物组成，检测用引物分别为 ： 猪旋毛虫上游引物：5'-CATTCGTGGTTGCTGTTGTTGC-3'， 猪旋毛虫下游引物：5'-CGTTGACGCTTTCATTGTAG-3'， 标准品为具有猪旋毛spira/is)的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No :3所示， 对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪旋毛虫DNA片段的DNA样品，阴 性对照为无猪旋毛虫DNA的DNA样品。
2. 根据权利要求1所述的一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，其特征在 于，试剂盒保存于-20 °C，尽量减少反复冻融。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒在检测食源性寄生虫猪旋毛虫中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104059974SQ201410268877
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】杜爱芳, 俞颖超, 闫宝龙, 蓝丽华 申请人:浙江大学