本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂，本发明还涉及用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法。
背景技术：
冠状动脉痉挛(coronaryarteryspasm，cas)是多种缺血性心脏病的共同病理基础，可导致心绞痛、心律失常、心肌梗死及猝死等严重后果。其临床治疗上以药物缓解为主，无法“治本”，还会产生耐药等问题。纠正血管平滑肌细胞高反应性，使其恢复正常的功能是有效控制冠状动脉痉挛发生的关键。细胞外信号调节激酶1和2(erk1/2)通路的激活，可介导内皮素受体表达上调，是引起血管平滑肌高反应性重要因素。u0126是erk1/2通路的高效抑制剂，研究发现其具有非常好的抗动脉血管收缩效果。但该小分子化合物几乎不溶于水，导致其生物利用度低，此外还存在较大的毒副作用，会对其他脏器造成损伤。
经过数十年的探索和发展，纳米材料和技术取得了长足的进步，进入临床试验和应用的纳米药物载体不断增多，根据统计，经美国fda批准上市的纳米药物就已超过20种，还有150余种纳米药物和纳米载体系统处于临床或商业化发展阶段。纳米药物载体可有效增加非水溶性化合物在水溶液中的分散度，一方面可提高其体内稳定性，增加生物利用度，还可降低毒副作用的发生。两亲性材料可通过自组装形成核壳式结构的纳米胶束，内核是疏水性超微结构，疏水性药物可被牢固的包裹在其中，而外壳则是由亲水骨架而构成，使得整个体系具有非常好的水溶液分散度。
泊洛沙姆(poloxamer)为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是一种非离子型两亲性高分子化合物，具有非常好的生物相容性，是已被批准的常规药物辅料，可用于多种剂型的制备，尤其适用于各种难溶性药物或化合物的药剂制备。泊洛沙姆用于药物载体的专利已有报道，有部分方法将其制备成水凝胶，如专利号：cn105596367a，cn104903373a及cn102989036a等；也有将其制备成油质注射剂的作法，如cn103705454a，cn103705455a和cn103768014a等。
研究发现u0126是非常具有潜力的抗冠状动脉痉挛治疗分子。然而，u0126水溶性极差，且erk1/2通路与很多正常生理功能有关，完全抑制后会产生毒副作用，单独使用u0126存在一定局限性。可通过泊洛沙姆所制备的纳米药物而解决。虽然泊洛沙姆可用于非水溶性药物的包裹，但是需要保证所制备的载药颗粒在体内能循环保持一定的稳定性，且能缓慢有效的释放包裹药物分子，还要具备长期保存能力。要同时满足上述条件十分困难，其他相关技术方法无法直接起到参考作用。例如，申请人前期公开了一种棉酚纳米制剂的制备方法(公开号：cn104523606a)，但是更换药物之后所制备的纳米药物颗粒完全无法达到理想粒径，且载药性能也比较差，无法用于进一步应用。所以需要在新的构建工艺中结合实际经验不断探索测试，对关键节点进行优化和变革。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂，解决了现有技术中存在的纳米制剂粒径达不到要求且载药性能比较差的问题。
本发明的另一目的是提供一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法。
本发明所采用的第一技术方案是，一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：泊洛沙姆为25～36％，u0126为8～12％，冻干保护剂为50-70％，以上各组分的质量百分比之和为100％。
本发明第一技术方案的特点还在于，
泊洛沙姆规格为118、237、338、407中的一种。
冻干保护剂包括甘露醇、羟乙基淀粉中的一种或者两种的混合物。
本发明所采用的第二技术方案是，一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆25～36％，u0126为8～12％，冻干保护剂50-70％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆按照比例1:3混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，待完全溶解之后除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉。
本发明第二技术方案的特点还在于，
步骤2中过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤。
步骤3中对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为400～800w，每次循环超声处理时间6～8秒，间隔时间3～4秒，总循环数100～120次。
步骤4中透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次。
步骤5中纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为200～400r/min。
步骤5中除去其他非可溶性杂质及微生物利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜去除。
步骤6中预冻是在-70至-80℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
本发明的有益效果是，一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂，粒径小于100纳米，包裹效率高，稳定性好，具有缓释效果等优势，能有效保证药物在体内的长效循环，可显著降低用药剂量，用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，直接通过自组织工艺在水环境下构建中可高度分散的u0126纳米制剂，所建立的工艺体系简单实用，各步骤均可进行精密的质量控制，获得的纳米药载颗粒具有非常高的包裹率和载药量，冻干后的制剂干粉可以稳定存放一年以上。
附图说明
图1是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法的流程示意图；
图2是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1所制备泊洛沙姆包裹u0126纳米制剂分散度情况比较图；
图3是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1泊洛沙姆包裹u0126纳米制剂重溶后透射电子显微镜照片；
图4是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1泊洛沙姆包裹u0126纳米制剂重溶后粒径分析结果图；
图5是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1所制备泊洛沙姆包裹u0126纳米制剂溶液粒径稳定性测试结果图；
图6是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1所制备泊洛沙姆包裹u0126纳米制剂溶液体外释放结果图；
图7(a)～图7(b)是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1所制备u0126纳米制剂体外抗血管收缩对影响的实验结果对比图；
图8(a)～图8(b)是本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法中实施例1制备的u0126纳米制剂对高血压大鼠模型干预实验结果对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：泊洛沙姆为25～36％，u0126为8～12％，冻干保护剂为50-70％，以上各组分的质量百分比之和为100％，其中，泊洛沙姆规格为118、237、338、407中的一种，冻干保护剂包括甘露醇、羟乙基淀粉中的一种或者两种的混合物。
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，如图1所示，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆25～36％，u0126为8～12％，冻干保护剂50-70％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆按照比例1:3混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为400～800w，每次循环超声处理时间6～8秒，间隔时间3～4秒，总循环数100～120次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为200～400r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-70至-80℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
实施例1
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为118)25％，u0126为8.3％，冻干保护剂66.7％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为400w，每次循环超声处理时间6秒，间隔时间4秒，总循环数120次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为12小时，期间更换外液5次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为200r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得纳米制剂，平均粒径为63±2.3nm，包裹率为94±4.1％。
参照图2可见，图2中标签为a的是冻干之前的纳米制剂溶液；标签为b的是u0126水分散液对照组，因为该化合物不溶于水，其分散液浑浊，静置后有明显沉淀；标签为c的是溶解后的u0126纳米制剂，较之冻干之前的纳米制剂基本一致，溶液整体清澈均匀；说明本实施例利用泊洛沙姆包裹制备纳米药载颗粒可以显著的增加非水溶性药物u0126在水中的溶出度。粒径小于100纳米，具有很好的体内循环性。
实施例2
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为237)36％，u0126为12％，冻干保护剂52％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为800w，每次循环超声处理时间8秒，间隔时间3秒，总循环数100次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为24小时，期间更换外液3次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为400r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-80℃超低温度下进行，预冻时间为12小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为60±3.4nm，包裹率为92±4.1％。
实施例3
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为118)26％，u0126为8.67％，冻干保护剂65.33％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为450w，每次循环超声处理时间6秒，间隔时间4秒，总循环数102次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为14小时，期间更换外液4次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为220r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为13小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例明所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为64±2.7nm，包裹率为92±3.7％。
实施例4
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为338)27％，u0126为9％，冻干保护剂64％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为440w，每次循环超声处理时间7秒，间隔时间3.5秒，总循环数102次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为11小时，期间更换外液4次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为260r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-75℃超低温度下进行，预冻时间为15小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为65±2.9nm，包裹率为94±5.6％。
实施例5
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为407)28％，u0126为9.33％，冻干保护剂62.67％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为480w，每次循环超声处理时间6.5秒，间隔时间3.5秒，总循环数108次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液4次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为300r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-80℃超低温度下进行，预冻时间为20小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为60±4.1nm，包裹率为93±7.4％。
实施例6
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为237)29％，u0126为9.67％，冻干保护剂61.33％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为500w，每次循环超声处理时间6秒，间隔时间4秒，总循环数105次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为14小时，期间更换外液5次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为400r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-76℃超低温度下进行，预冻时间为20小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为61±4.6nm，包裹率为94±2.4％。
实施例7
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为407)30％，u0126为10％，冻干保护剂60％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为600w，每次循环超声处理时间8秒，间隔时间4秒，总循环数115次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为21小时，期间更换外液4次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为320r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为20小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为67±4.2nm，包裹率为93±4.6％。
实施例8
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为338)31％，u0126为10.33％，冻干保护剂58.67％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为700w，每次循环超声处理时间7秒，间隔时间3.5秒，总循环数116次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为21小时，期间更换外液3次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为200～400r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-78℃超低温度下进行，预冻时间为19小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为63±3.8nm，包裹率为93±4.5％。
实施例9
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为118)32％，u0126为10.67％，冻干保护剂57.33％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为650w，每次循环超声处理时间7秒，间隔时间3秒，总循环数118次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为22小时，期间更换外液5次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为270r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-79℃超低温度下进行，预冻时间为23小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为66±6.8nm，包裹率为94±3.5％。
实施例10
一种用于冠状动脉痉挛治疗的纳米制剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、称量原料：按质量百分比称取泊洛沙姆(规格为237)34％，u0126为11.33％，冻干保护剂54.67％，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2、将u0126和泊洛沙姆混合，再将混合物与二甲基亚砜按照10mg:1ml的比例进行混合，并过滤除去杂质，制成混合溶液，其中，过滤时用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜进行过滤；
步骤3、将步骤2得到的u0126和泊洛沙姆的混合溶液缓慢加入到10倍体积的生理盐水内，期间液体保持分层，之后对整个液体体系进行超声处理，处理过程中一直保持冰浴，获得纳米药载颗粒分散液，其中，对整个液体体系进行超声处理利用探头式超声破碎仪，功率为750w，每次循环超声处理时间8秒，间隔时间4秒，总循环数109次；
步骤4、将纳米药载颗粒分散液进行透析，除去分散液中的二甲基亚砜溶剂和其他可溶性杂质，其中，透析具体为：将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kda的透析袋内，以生理盐水为外液，透析时间为13小时，期间更换外液4次；
步骤5、将称取的冻干保护剂，缓慢加入快速搅拌状态下的纳米药载颗粒分散液中，纳米药载颗粒分散液的搅拌速度为360r/min，待完全溶解之后利用孔径为0.22微米的无菌水溶性滤膜除去其他非可溶性杂质及微生物，使用生理盐水定容，获得u0126浓度为0.1mg/ml的纳米制剂溶液；
步骤6、将纳米制剂溶液等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，预冻是在-72℃超低温度下进行，预冻时间为14小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。
将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能：
本实施例所得u0126纳米制剂，平均粒径为63±3.2nm，包裹率为93±4.1％。
对实施例1所制备的u0126纳米制剂的粒径分布及稳定性进行测定，并通过透射电子显微镜观察其形态特征。所得结果表明：该纳米制剂具形态特征均一，单分散性良好，稳定性高，药物包裹能力强，参见图2、图3、图4及图5。从释放性实验结果可以看出，纳米制剂具有很好的缓释效果，可保证u0126在体循环内持续释放，参见图6(注：由于u0126不溶于水，无法直接从外液测得，所以释放测定是根据透析袋内液通过冷冻干燥重溶后测得的)，u0126纳米制剂的体外抗动脉收缩效果进行了检测，结果发现相比于游离药物，该纳米制剂的激活能力更为明显。通过对大鼠高血压模型进行干预，结果发现该纳米制剂可有效降低大鼠的血压，参见图7(a)～图7(b)及图8(a)～图8(b)，其中，对于图7(a)～图7(b)，由于游离u0126相比纳米药载体系有更加明显的抗收缩能力，从最大效应图中可以发现在s6c浓度为10-7m时10μm浓度的游离u0126组血管的收缩率达到15％左右，同为10μm浓度的纳米药载组收缩率仅为6.34％，具有显著性差异，而1μm浓度纳米药载处理组的收缩率为19.63％与10μm的游离u0126组基本上处于同一个数量级，不存在显著性差异，对于图8(a)～图8(b)，所制备u0126纳米制剂(2mg/kg，尾静脉给药，4周)对高血压大鼠模型干预实验结果，需要注意的是，与同浓度游离u0126干预组相比，纳米制剂组敢于效果更为显著。
前期预实验发现，使用常用的非离子型表面活性剂，如吐温等无法形成稳定的u0126纳米制剂。更为重要的是结果重复性差，不能对制剂工艺进行质量控制。而本发明所使用的泊洛沙姆包材可有效克服u0126纳米制剂制备中存在的不足。虽有不少相关的技术方案被公布，然而经过一系列预备实验发现，直接参考其他相关文件的工艺参数无法获得所需的纳米制剂。本发明依托前期经验，通过大量实验对试剂配比，制备工艺及辅料使用等关键参数进行反复测试修改，克服了其在制备过程中存在的稳定性不足和重复性较差的缺点，最终获得最优的制备工艺。保证了制剂的质量控制。