本发明涉及一种用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，所述方法包括：以荧光使能光
如任何其他光那样，在样品中不能比在其波长情况下的阿贝衍射极限更强地定位荧光使能光，在最佳光学前提下，所述阿贝衍射极限也处于波长的一半。对于从样品中发射的荧光，其波长情况下的阿贝衍射极限适用于配属于样品的确定区域。相应地，在以荧光使能光加载以及在测量荧光时，不能将测量区域缩小到荧光使能光或荧光的波长情况下的衍射极限以下。然而，借助荧光阻止光，在成像样品中的结构或跟踪样品中的颗粒的情况下的空间分辨率可以低于阿贝衍射极限。如果测量区域中以荧光阻止光加载的部分区域覆盖除了荧光阻止光的强度分布的零位以外的整个测量区域，那么所测量的荧光仅还能来自该零位并且因此被配属于该零位在样品中的位置。随着荧光阻止光的光功率的增大，荧光阻止光的零位的尺寸可以降低到远远低于荧光阻止光的波长情况下的衍射极限，并且因此也降低到远远低于荧光使能光的以及荧光的波长情况下的衍射极限，在所述零位中，荧光阻止光的强度为零或无论如何如此小，使得荧光阻止光不阻止发射荧光，而在所述零位以外，荧光阻止光的强度如此大，使得该荧光阻止光完全阻止由荧光标记(fluoreszenzmarker)发射荧光。结果，在成像样品中感兴趣的结构或在跟踪样品中感兴趣的颗粒时达到以下空间分辨率：所述空间分辨率可以以如下因子倍优于传统的共聚焦扫描荧光显微镜中的空间分辨率：所述因子是至少5、10或更高。
荧光阻止光可以以不同的方式阻止由荧光标记发射荧光。在受激发射损耗(sted)荧光显微术中，荧光使能光是荧光激发光，所述荧光激发光将荧光标记通过电子跃迁转换到激发态，荧光标记从该激发态在自发发射荧光的情况下回到其基态。在此，荧光阻止光补偿激发态，其方式为：荧光阻止光刺激荧光标记来发射与荧光的波长不同的波长的光，所述光由于其波长与从荧光阻止光的零位自发发射的荧光的波长不同而可以被分离。
在sted扫描荧光显微术中，荧光阻止光必须在其零位以外具有非常高的强度，以便在荧光标记可以自发发射荧光之前，通过受激发射使以荧光使能光为了发射荧光而激发的荧光标记重新处于不激发状态，因为荧光标记的电子激发态的寿命仅仅是短暂的。
在使用可接通(schaltbar)的荧光团的可逆饱和荧光跃迁(resolft)扫描荧光显微术中，荧光使能光将荧光标记接通到以下荧光状态中：其中，所述荧光标记可以由附加的荧光激发光激发用于自发发射荧光。借助荧光阻止光，将除了荧光阻止光的零位的区域中的荧光标记以外所接通的荧光标记重新关断。接下来通过附加的荧光激发光来引起其发射的荧光仅仅还能来自荧光阻止光的零位区域。
相比sted扫描荧光显微术，在resolft扫描荧光显微术中对于荧光阻止光的强度要求更低，因为荧光标记——只要其不稳定——的接通状态具有比荧光标记从该状态发射荧光的电子状态至少一个更长的寿命。然而，为此需要特殊的可接通的荧光标记。
在基态耗尽(gsd)扫描荧光显微术中，借助荧光阻止光将荧光标记通过电子跃迁从其基态转换到暗态(dunkelzustand)中，在该暗态中，在以荧光激发光作为荧光使能光加载样品的情况下，荧光标记不能激发来自发发射荧光。即使在这种情况下，接下来测量的荧光也仅能来自荧光阻止光的零位。
gsd扫描荧光显微术中的困难在于，一方面，荧光标记虽然需要快速地完全转换到暗态中，然而另一方面，如果应该测量样品的相邻的测量区域，则该荧光标记也需要顺畅地又从暗态返回。
背景技术：
由在prl(物理评论快报)94期，143903(2005)中v.westphal和s.w.hell的《nanoscaleresolutioninthefocalplaneofanopticalmicroscope》已知一种用于高分辨率地成像二维样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，所述方法具有独立权利要求1的前序部分的特征并且属于sted扫描荧光显微术。荧光抑制光构造成具有线状零点。在对照示例中，将荧光阻止光的分别具有一个线状零位的两个部分强度分布以线的正交指向叠加，以便定义点状零位。为了构造荧光阻止光的两个部分强度分布，将荧光阻止光分离为两个部分射束。在光功率固定的情况下，在使用具有线状零位的荧光阻止光的情况下，在与线状零位正交的方向上实现最大的空间分辨率。然而，在线状零位方向上，空间分辨率保持为共聚焦扫描荧光显微术的水平。如果借助点状零位在两个方向上提高空间分辨率，在荧光阻止光的光功率相同的情况下，该空间分辨率则显著低于已知方法的第一实施方式中的最大空间分辨率。由us2012/0104279a1已知一种用于高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，所述方法在一种实施方式中属于sted扫描荧光显微术，然而，所述方法也可以实施为gsd或resolft扫描荧光显微术的方法。荧光阻止光构造成具有围绕点状零位的环状强度分布。在此，电场的场向量可以在环形圈(donut)中旋转或保持固定的指向，以便在环形圈区域中，要么可以与所有荧光标记的偶极定向无关地，在两个空间方向上阻止所有荧光标记发射荧光，要么有针对性地仅在与其偶极子的相应的定向正交的方向上(因此在空间方向上)阻止每个荧光标记发射荧光。
由us2007/0206278a1已知了一种用于高分辨率地成像二维样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，所述方法可以实施为resolft或gsd扫描荧光显微术的方法。在resolft实施方式中，首先借助荧光使能光的线状强度分布将样品接通到可发射荧光的状态。在已知方法的gsd实施方式中，替代地，如有必要则一直等待直到荧光标记返回到其有荧光能力的基态。然后，以以下荧光阻止光的线状强度分布的荧光阻止光在同一线状测量区域中加载样品：该荧光阻止光将如下荧光标记从可发射荧光的状态关断到暗态：所述荧光标记是除了处于荧光阻止光的在线状测量区域的中央的线状零位中的荧光标记以外的荧光标记。接下来，以荧光激发光加载线状测量区域。借助线探测器(即沿线进行空间分辨的探测器)测量随后从样品的线状测量区域发射的荧光。对于多个测量区域重复在此描述的步骤，以便借助荧光阻止光的线状零位对样品进行扫描。可以借助荧光阻止光的线状零位的不同指向依次进行样品的这种扫描，并且可以由在此获得的样品的多个图像在数学上计算出在多个方向上具有提高的空间分辨率的总图像。已知的方法应该相对于逐点扫描加速样品的扫描。所以不能在具有线状零位的荧光阻止光的线状强度分布上有意义地实现sted扫描荧光显微术所需的荧光阻止光的强度，因为荧光阻止光的光功率为此分布在太大的面积上。
由us2013/0176574a1一种已知用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法以及一种扫描荧光显微镜。在此，仅仅以荧光激发光来加载样品。在此，分别在衍射限制的测量区域内进行所述加载，并且借助点探测器测量从所述测量区域发射的荧光。为了改善空间分辨率，在荧光激发光聚焦到样品中之前如此调制其相位波前，使得在测量区域中形成不同的干涉图案。在不同角位置(winkelstellung)中，这些干涉图案可以包括这种具有线状零位的干涉图案。借助测量区域中的这些干涉图案中的每个来完全地扫描样品，并且在数学上共同地分析处理对于不同干涉图案的荧光的测量值，以便获得具有比测量区域的大小更高的空间分辨率的图像。在借助测量区域采样样品时，在借助测量区域接近样品的下一个点之前，也可以在样品中测量区域的每个位置处依次调节所有干涉图案并且为此分别测量荧光。
由de102011055367a1已知一种用于跟踪样品中借助荧光标记进行标记的颗粒的运动的方法和一种扫描荧光显微镜。在此，将具有具有空间限制的最小值的强度分布的荧光激发光指向样品；使该最小值跟踪样品中运动的颗粒，其方式为：强度分布如此相对于样品移动，使得由颗粒发射的光子的比率(rate)保持为最小。只要颗粒处于荧光激发光的强度分布的最小值中即可。光束的相位关系——通过干涉由所述相位关系产生荧光激发光的强度分布——可以依次导致指向不同方向的线状的或面状的最小值，所述线状的或面状的最小值可以称为旋转带(streifen)，并且具有作为空间交集的点或线。当在这种不同的相位关系之间快速切换时，并且既单独对于相位关系中的每个相位关系、也在相位关系的整个变化上搜寻由颗粒发射的光子的比率的最小值时，可以在全部三个维度中跟踪样品中的颗粒的运动。
在图像扫描显微术(ism)中，如在具有衍射限制的测量区域——将作为荧光使能光的荧光激发光聚焦到所述测量区域中——的传统的共聚焦扫描荧光显微术中那样，对样品的借助荧光标记进行标记的结构进行扫描。与传统的共聚焦扫描荧光显微术不同，虽然从样品的测量区域发射的荧光与测量区域的每个位置共聚焦，却借助传感器阵列记录(registrieren)，其中，通过传感器阵列来记录所述荧光的强度分布。在此，由于衍射极限，虽然不能在空间上分辨衍射限制的测量区域。然而，仍然获得了关于发射荧光的荧光标记的位置的附加信息。首先，产生四维或五维数据组，其中，两个或三个维度相应于样品中测量区域的位置，并且两个另外的维度相应于传感器阵列内部的坐标，在所述坐标上，相对于测量区域的位置已经记录了荧光。从这些数据组可以计算出具有提高的分辨率的最终图像。以这种方式可实现的最大分辨率相应于结构光照明显微术(sim)中可实现的分辨率，并且以如下因子倍优于传统的共聚焦扫描荧光显微术中的分辨率，所述因子是2。在ep2317362a1中例如描述了一种ism的方法以及一种相应的扫描荧光显微镜。ism也由在《物理评论快报》，第104卷，198101(2010)中clausb.müller和
在《opticalnanoscopy》2013，第二版：第五期stephanroth，colinjrsheppard，kaiwicker和rainerheintzmann的《opticalphotonreassignmentmicroscopy(opra)》描述了对ism中的一般(sonst)数学实现的分析处理的直接光学实施。
技术实现要素：
本发明所基于的任务是，说明一种用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，所述方法样品具有权利要求1的前序部分的特征，其中，借助比目前更低的荧光阻止光的光功率在多个维度中的所有维度中实现期望的空间分辨率。此外，应该说明一种用于多维高分辨率地成像样品中的借助荧光标记进行标记的颗粒的路径的相应的方法以及一种用于执行所说明的方法的扫描荧光显微术。
本发明的任务通过一种具有独立权利要求1的特征的用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法、一种具有独立权利要求14的特征的用于多维高分辨率地成像样品中的借助荧光标记进行标记的颗粒的路径的方法、以及一种用于执行根据并列权利要求16和23所述的方法的扫描荧光显微术来解决。从属权利要求定义根据本发明的方法的优选实施方式以及根据本发明的扫描荧光显微镜的优选的实施方式。
在根据本发明的用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法中，对于样品中的多个测量区域重复以下步骤：首先以荧光使能光、即在所述方法的sted实施方式的情况下借助荧光激发光来加载测量区域。在此，将荧光使能光聚焦到样品中，并且样品中由荧光使能光照亮的区域是测量区域。测量区域通常是圆形的，也就是说，所述测量区域与以荧光使能光加载样品的方向横向地具有圆形截面。
然后，以荧光阻止光加载测量区域的部分区域，其中，所述部分区域排除测量区域的中央，其方式为：荧光阻止光的强度分布具有经过中央延伸的线状的或面状的零位。如果以下替代线状的或面状的零位部分地仅涉及线状零位，那么因此也一直意味着面状零位，除非另有说明或从上下文关系中不能明确得出。
在所述方法的sted实施方式中，荧光阻止光是sted光，即如下光：所述光激发借助荧光阻止光激发的荧光标记来发射区别于荧光的其他光并且因此使荧光标记重新处于不激发状态。由于零位是线状的并且延伸经过测量区域的中央，所以测量区域中的荧光阻止光阻止荧光发射的部分区域不仅排除中央本身，而且排除线状零位的整个区域。在测量区域内部没有空间分辨率的情况下，测量从样品的测量区域发射的荧光。
对于零位的围绕中央的多个相继的角位置进行荧光的测量，其中，对于零位的角位置中的每个以荧光使能光加载测量区域。即在以荧光使能光分别对于测量区域相同加载的情况下，对于荧光阻止光的零位的不同角位置测量从相同测量区域发射的荧光。至少对于零位的围绕中央的两个不同角位置测量从测量区域发射的荧光，并且将其配属于通过中央位置在样品中定义的位置。
与其进一步的分析处理无关，对于零位的围绕中央的至少两个不同的角位置测量的荧光包含关于样品中的借助荧光标记进行标记的感兴趣的结构的信息，所述信息具有与零位通过测量区域的中央的最小延伸相等的空间分辨率。在根据本发明的方法中，所述零位的最小延伸以如下因子小于测量区域的衍射极限直径：所述因子为k(k≥2)。所述因子k相应于根据本发明的方法的空间分辨率相对于所述结构的共聚焦扫描荧光显微术的图像的记录的改善。在此，因子k可以明显大于2，例如也可以大于5或甚至大于10。
在根据本发明的方法中，在荧光阻止光的异常低的光功率的情况下达到相应的因子k，尽管存在线状的或面状的零位，还是在所有以下维度上作为改善的空间分辨率得出所述因子k：在所述所有维度中成像相应的感兴趣的结构。具体地，相比为了在样品的两个方向上达到相同的空间分辨率而形成点状零位，在形成线状零位的情况下在二维样品中成像结构仅需要一半、随发展趋势地甚至稍微小于50％的光功率。可以通过如下方式来解释为何仅需要大约一半的点状零位情况下的光功率：在根据本发明的方法中，二维样品情况下的测量区域的中央仅从一个而不是两个方向受到限制。这种解释也支持更详细的检验。在所述光功率情况下——即对于相同的空间分辨率仅需不到一半的光功率——的其他优点可能基于以下事实：在不损害从测量区域的中央产生荧光的情况下，线状零位比点状零位更易于构造。
在根据本发明的方法中，不同于在prl94，143903(2005)中v.wisphal和s.w.hell的《nanoscaleresolutioninthefocalplaneofanopticalmicroscope》，并非通过以下方式在所有空间方向上达到提高的空间分辨率：将荧光阻止光的多个部分强度分布如此叠加，使得总的荧光阻止光的零位的尺寸仅还相应于各个部分强度分布的各个零位的交集的尺寸。更确切地说，对于非点状、而是线状的或面状的零位的每个角位置，以荧光使能光加载样品，并且相应地也记录来自全部线状的或面状的零位的荧光。
与由us2007/0206278a1中已知的方法相比，在根据本发明的方法中实现在所有空间方向上原则上更高的空间分辨率。这此外是因为荧光使能光的强度在远离测量区域中央的所有空间方向上降低，由此，点扩散函数(psf)不在us2007/0206278a1的线状测量区域的延伸方向，而在所有方向上快速衰减。
在根据本发明的方法的确定的实施方式中，至少不仅借助零位的不同角位置记录结构的不同扫描荧光显微图像，而且随后将其在数学上合并，以便计算在所有空间方向上经高分辨的结构图像。更确切地说，替代地或附加地，可以对于零位的多个角位置合计出对于多个角位置中的每个测量到的荧光的至少一部分的强度总和，以便作为感兴趣的结构首先在所有空间方向上经高分辨的扫描荧光显微的成像来获得这种强度总和的空间分布。然后又可以进一步分析处理并处理该结构的成像。
例如可以构造强度分布，其方式为：对于荧光阻止光的零位的围绕中央的多个角位置来合计由测量区域发射的全部荧光。对于强度总和的这种图像，对于相应的测量区域，直接依次构造零位的围绕中央的不同角位置。在此，可以以简单的方式(即在没有时间分辨率的情况下)对于零位的不同角位置的调节来测量从样品发射的荧光。
然而，原则上，也可以如此执行根据本发明的用于多维高分辨率地成像样品的借助荧光标记进行标记的结构的方法，使得在调节到零位的下一个角位置并且重复完整的扫描之前，首先分别完全借助测量区域在零位的一个角位置情况下对整个样品或样品的至少一个感兴趣当前区域进行扫描。此外，可以借助零位的不同角位置逐行依次对样品进行扫描。因此，也对于零位围绕中央的多个连续的角位置测量从每个测量区域发射的荧光，其中，对于零位的每个角位置，以荧光使能光加载测量区域。因此，不是通过荧光的在时间上直接连续的测量值或其部分，而是通过分别配属于测量区域的测量值或其部分来构成强度总和。
从测量区域发射的荧光的以下部分是从测量区域发射的荧光的对于零位的多个角位置保持恒定的稳定部分：该部分可以对于多个角位置合计出强度总和并且包含特别多的关于样品中的感兴趣的结构的空间上经高分辨的信息。
即使当对于零位围绕确定的测量区域中央的多个相继的角位置直接依次测量从测量区域发射的荧光时，这也可以以时间分辨率来实现，尤其借助如此高的时间分辨率，使得在测量的荧光中对零位的多个相继的角位置在从其区域发射的荧光方面进行分辨。
与其获得的方式和方法无关，可以使用测量到的荧光的这种分辨率，以便例如主要或仅仅对荧光进行分析处理，其中，零位与样品中感兴趣的结构的变化过程横向地定向，使得所述变化过程特别高地在空间上分辨。
也可以使用关于零位的多个相继的角位置测量的荧光的这种分辨率用于跟踪样品中的借助荧光标记进行标记的连贯结构的变化过程，而不对整个样品进行扫描。因此，可以将测量区域有针对性地彼此排列在零位的以下角位置的方向上：在所述角位置中，荧光具有其最高强度。当零位不仅在测量区域的中央，而且在中央以外(理想情况下，在其整个延伸上)与借助荧光标记进行标记的结构重合时，荧光具有其最高的强度。在所述过程中也识别到所述结构的分支(verzweigung)，因为存在零位的多个角位置，在所述角位置中，荧光具有比在零位的其他角位置更高的强度。
为了在成像样品中的感兴趣的结构时在所有空间方向上尽可能实现相同的空间分辨率，优选将零位的多个角位置均匀地分布到围绕中央的整个圆心角或空间角上。当线状零位在至少πk/2个均匀分布的围绕中央的角位置中指向测量区域时，圆形测量区域的每个点由线状零位至少检测到一次，所述线状零位的最小延伸以因子k小于测量区域的直径。然而，从该角度看，均匀分布的角位置的数量也必须不大于πk/2+1。然而，原则上，在根据本发明的用于多维高分辨率地成像的方法中，零位的多个角位置的这种均匀分布不是强制性的。
零位的围绕每个测量区域中央的多个角位置的数量在线状零位的情况下至少为2，在面状零位的情况下至少为3。只要角位置的数量保持小于因子k，尤其保持不大于k/2，根据本发明的方法则具有对于加速样品扫描的巨大潜力，因为如果不同的测量区域具有相同的距离，则可以比在一维零位情况下更快地获得对于每个测量区域中的零位的每个角位置的有效力的数量的荧光。这是因为，在因子为k的情况下，从二维样品的零位区域发射的荧光平均下降到1/k2，而在线状零位的情况下，该荧光仅平均下降到1/k。即在线状零位的情况下，在缩短为1/k的时间内测量到相同的荧光量。如果对于零位的不超过k/2个的不同角位置进行所述测量，那么总测量持续时间总是还能降低到在点状零位情况下测量有效力的数量的荧光所需的总测量持续时间的一半或更少。显著数量的荧光或有效力的数量的荧光尤其可以理解为这种数量的荧光：所述数量的荧光显著超过用于测量荧光而使用的探测器的噪声，并且因此允许对相应零位内荧光标记的存在作出陈述。
然而，在测量荧光期间，不仅可以不连续地、而且可以连续地改变零位围绕测量区域中央的角度。在此，荧光的显著数量对于零位的全部角位置也仅能测量一次，并且因此在总体上下降到1/k的时间中测量。相反地，如果零位的角位置——对于所述角位置分别测量显著数量的荧光——的有效数量超过k，则会丧失速度优势。然而，在测量到的荧光中，在所有空间方向上包含关于感兴趣的结构的附加信息。事实上，与借助荧光阻止光在所有这些空间方向上同时限制零位相比，借助根据本发明的方法，在所有空间方向上总是能以更少的荧光阻止光实现确定的空间分辨率。
即使零位围绕中央的角位置——对于所述角位置分别测量荧光的有效数量——的数量达到k或πk/2，根据本发明的方法也降低了荧光标记——借助所述荧光标记进行标记感兴趣的结构——的变淡的风险。在根据本发明的方法的每个时刻，仅以相对于借助点状零位在测量区域内实现相同空间分辨率的方法的一半的光功率加载样品。在此，具有荧光阻止光的最高强度的区域在测量区域中不是环状或球状地分布在测量区域的整个圆周上，而是聚集到远离零位的测量区域的边缘区域，并且随着零位的多个不同角位置，测量区域的受这些强度影响的部分发生改变。当在根据本发明的方法中测量每个测量区域的时间比在借助点状零位的方法中更长时，因此，荧光标记的变淡的风险的有关的降低一次都不会消失。
因为根据本发明的方法实现具有对于测量区域中央的零位的最小尺寸的空间分辨率，所以在与所述高空间分辨率相协调的栅格尺度中借助测量区域对样品进行扫描。具体地说，栅格尺度应该在应该实现高空间分辨率的每个方向上小于零位的最小延伸。当栅格尺度为零位最小延伸的一半时，则实现最高的空间分辨率。以更高的栅格尺度，空间分辨率不再改善。
为了尽量少地在样品中加载荧光标记，即为了使荧光标记的变淡风险最小化，可以对于彼此不重叠的测量区域直接依次实施加载的步骤和测量的步骤。也就是说，在对于测量区域实施根据本发明的方法的步骤之后，不转向(anfahren)栅格中相邻的测量区域，而转向与该测量区域间隔至少为测量区域的直径的测量区域。然而，如果直接依次转向栅格中相邻的测量区域，则可以注意的是，它们在零位的角位置中的一个角位置的方向上相邻，因为在所述方向上布置在样品中的荧光标记最小地由荧光阻止光负载。
如果对由合计的荧光强度总和合成的结构成像进行高通滤波，即在所包含的空间频率方面对强度总和的空间分布进行高通滤波，那么所述结构成像从强度总和的以下部分中释放(befreien)：所述部分可以称为共聚焦背景，然而，也可以包括样品中的较大结构的信号。以这种方式，经高通滤波的成像可以注重于感兴趣的结构的精细的细节，所述精细的细节可以以高分辨率重新呈现。相反地，对结构的初级成像(
根据本发明的用于多维高分辨地率成像样品中的借助荧光标记进行标记的颗粒的路径的方法具有对于样品中的多个测量区域重复的步骤：以荧光使能光加载测量区域。以荧光阻止光加载测量区域的部分区域，其中，所述部分区域排除测量区域的中央，其方式为：荧光阻止光的强度分布具有经过中央延伸的的线状的或面状的零位。对于零位围绕中央的多个相继的角位置，以时间分辨率测量从样品的测量区域发射的荧光，其中，对于所测量的荧光，所述时间分辨率对零位的多个连续的角位置进行分辨
在这种根据本发明的跟踪方法中，根据所选择的偏置如此大地选择多个零位的数量，对于所述多个零位依次测量从测量区域发射的荧光，使得颗粒在至少两个角位置的情况下落入零位中，从而不仅可以检测颗粒相对于中央的角位置(winkellage)，而且可以检测颗粒与测量区域中央的距离。优选地，在检测从测量区域发射的荧光时，使零位围绕测量区域中央的角位置连续变化。
在两种根据本发明的方法中，可以用点探测器测量从样品的测量区域发射的荧光，该点检测器优选与测量区域共聚焦地布置。这表明，测量区域在两种根据本发明的方法中是圆形的。
在两种根据本发明的方法(尤其根据本发明的用于高分辨率地成像的方法)的另一优选的实施方式中，从样品的测量区域发射的荧光如此共聚焦地借助传感器阵列测量：例如像从ism已知的那样。然后，也可以根据ism的原理来分析处理借助传感器阵列测量的荧光。在此，分别在不受荧光阻止光影响的方向上、即在线状零位在其当前角位置中延伸的方向上得出相对于简单共聚焦分辨率以如下因子提高的分辨率：所述因子是2。该分辨率的提高随后通过零位的不同角位置也导致所有方向上的相应的分辨率的提高。
根据本发明的用于多维高分辨率地成像借助荧光标记进行标记的结构的扫描荧光显微镜具有：用于以荧光使能光加载测量区域的荧光使能光源、用于以荧光阻止光加载测量区域的部分区域的荧光阻止光源。在此，部分区域排除测量区域的中央，其方式为：荧光阻止光的强度分布具有经过中央延伸的线状零位或面状零位，其中，零位通过测量区域中央的最小延伸以因子k≥2小于测量区域在相同方向上的直径。此外，荧光阻止光源具有角度调节装置，该角度调节装置构造用于调节零位围绕中央的多个连续的角位置，其中，荧光使能光构造用于对于零位的每个角位置以荧光使能光加载测量区域。扫描荧光显微镜的探测器设置用于，在测量区域内部没有空间分辨率的情况下，对于零位围绕中央的多个相继的角位置测量从样品的测量区域发射的荧光，并且对于多个角位置将从测量区域发射的荧光的至少一部分合计出强度总和。编码装置设置用于将强度总和配属于通过中央位置在样品中定义的位置。扫描装置设置用于借助测量区域的中央对样品的感兴趣的空间区域进行扫描。本领域技术人员可以基于扫描荧光显微镜在此描述的功能、根据其已知的扫描荧光显微镜的现有技术无障碍地构造根据本发明的扫描荧光显微镜的各个构件。
探测器可以构造用于将从测量区域发射的总的荧光对于多个角位置合计出强度和。替代地，该探测器可以构造用于对于多个角位置仅将从测量区域发射的荧光的稳定部分合计出强度总和。
优选地，探测器构造用于，以时间分辨率测量从样品的测量区域发射的荧光，所述时间分辨率可以实现将当前测量的荧光配属于零位的当前角位置。随后，扫描装置可以具有跟踪模块，其中，所述扫描装置选择性地将测量区域彼此排列在零位的以下角位置的方向中：在所述角位置中，荧光具有其最高的强度。
同样地，根据本发明的用于执行用于多维高分辨率地成像样品中借助荧光标记进行标记的颗粒的路径的方法的扫描荧光显微镜具有：用于以荧光使能光加载测量区域的荧光使能光源、用于以荧光阻止光加载测量区域的部分区域的荧光阻止光源，其中，该部分区域排除测量区域的中央，其方式为：荧光阻止光的强度分布具有经过中央延伸的线状零位或面状零位，其中，零位通过测量区域中央的最小延伸以因子k≥2小于测量区域在相同方向上的直径。此外，在此，荧光阻止光源的角度调节装置也构造用于对零位围绕中央的多个相继的角位置进行调节，其中，荧光使能光源构造用于对于零位的每个角位置以荧光使能光加载测量区域。根据本发明的扫描荧光显微镜的探测器设置用于，在测量区域内部没有空间分辨率情况下，却以对于零位的围绕中央的多个相继的角位置的时间分辨率测量从样品的测量区域发射的荧光。基于所述测量，跟踪装置使样品中的测量区域如此跟踪颗粒，使得该跟踪装置将对于线状的或面状的零位的多个角位置的时间上的强度变化过程保持为预给定的值，即保持为预给定的变化过程。
在两种根据本发明的扫描荧光显微镜中，角度调节装置可以构造用于将零位的多个角位置均匀地分布到围绕中央的整个圆心角或空间角上。此外，角度调节装置构造用于连续地和/或以离散的步骤改变零位围绕测量区域中央的角度。
具体地，角度调节装置可以具有波前调制器以及用于旋转荧光阻止光的偏振方向的至少一个泡克尔斯单元(pockelszelle)。将泡克尔斯单元布置在波前调制器的后面，以便如此旋转从波前调制器出射的光的偏振方向，使得其以λ/2沿笔直平分相位波前的相位跳变延伸。以下以此为前提：在荧光阻止光接下来聚焦到样品中的情况下，得出由两个强度丘
替代波前调制器——借助所述波前调制器可以原则上任意调节波前，角度调节装置可以具有用于荧光阻止光的至少两个部分光路，所述至少两个部分光路分别构造用于调节零位的多个角位置中的一个。在所述部分光路中的每个中，例如可以设置相位延迟片，该相位延迟片沿着为此匹配的方向相对于波前的另外一半以λ/2延迟半个波前。在此，荧光阻止光依次入射到不同的部分光路中，或使不同的部分光路通过光学延迟彼此相协调，使得样品中的荧光阻止光依次构造零位的不同角位置，其中，对于每个角位置，以荧光使能光加载样品。
根据本发明的扫描荧光显微镜的两个实施方式可以作为唯一的光敏元件而具有构造为点探测器的的探测器。然而，替代共聚焦布置的点探测器，也可以设置共聚焦布置的传感器阵列。原则上，也可以借助共聚焦布置的摄像机来测量来自样品的荧光。在具有衍射限制的尺寸的测量区域中，这种摄像机在测量荧光时也不在空间上分辨测量区域。
对于分析处理在根据本发明的方法的情况下或借助根据本发明的扫描荧光显微镜测量并且配属于样品中的测量区域的中央的各个位置的荧光，除了已经表明的以外，还存在其他可能性。
对借助荧光标记进行标记的结构进行重建的离散法在于构造已经提及的强度总和，即将对于线状零位的不同角位置测量的荧光相加。这种相加或集成可以在位置空间或频率空间中进行，并且可以在不了解点扩散函数(psf)情况下实现。然而，所述方法由于低频的过度加权在psf情况下提供了共聚焦的阴影(schatten)，并且应该视为可实现的分辨率的下限。
可以通过补充措施来提高借助强度总和可以实现的分辨率。例如可以对其加数(summand)在频率空间中加权。对于这种方法，考虑强度总和的光学传递函数(otf)。在此，借助适合的加权函数来抑制上面所述的低频的过度加权。由此，共聚焦的阴影消失，然而，至少需要对于psf的大致认识。
既可以在频率空间中也可以在位置空间中使用其他重建方法，例如平均值法、最大值法、最小值法。对于多焦点共聚焦显微术，相应的数学法则由在《appl.opt》，osa，2006，45，第5037-5045页中r.heintzmann和p.a.benedetti的《high-resolutionimagereconstructioninfluorescencemicroscopywithpatternedexcitation》所描述。
在频率空间中的最大值法中，由具有固定角位置的线状零位对每个在位置空间中记录的具有一维分辨率提高的单个图像进行傅里叶变换。所得的otf分别示出沿着零位的横向方向上的分辨率增益。对于每个频率向量，接下来确定对于该频率提供最大贡献(beitrag)的otf。对于该频率，将最大贡献添加到重建的otf。傅里叶逆变换提供具有二维分辨率提高的位置空间的图像。在此，缺点是丢失信号，因为一直仅考虑最大贡献。有利的是，不需要关于psf的认识。
在位置空间(ortsraum)中的最小值法中，相互计算位置空间中的不同模型定向的数据。对于每个位置向量，保留提供最小贡献的模型定向的贡献。因此，仅考虑“稳定部分”(gleichanteil)。该最小值法的优点和缺点类似于最大值法。
在另一种方法中，通过迭代算法重建感兴趣的结构。借助理查德森露西反卷积(richardsonlucyentfaltung)来逼近对象。对于具有线状零位的不同角位置的图像执行基于最大似然法(maximumlikelihoodmethode)的所述近似。接下来，对这些单个近似取平均值。所述方法的缺点是，必须至少大致地已知psf。所述方法的最大优点在于，考虑整体信号。执行这种方法的指导存在于josa62(1):55-59,1972中w.h.richardson的《bayesian-basediterativemethodofimagerestoration》中以及astronomicalsocpac，1992中r.n.hook的《co-addingimageswithdifferentpsf's》中。
此外，当借助传感器阵列测量来自测量区域的荧光时，可以将重建方法与重新扫描方法或ism组合，该重新扫描方法此外由stephanroth等人描述。相对于传统的二维sted显微术，根据本发明的方法在每次测量来自测量区域的荧光的情况下具有共聚焦轴线。沿着该共聚焦方向，可以将内部空间频率不等于零的区域根据重新扫描方法扩展为原来的2倍。因此，通过重建获得附加的信息并因此获得更高的分辨率。关于重复扫描法参见《opticalnanoscopy》2013，2：5中stephanroth，colinjrsheppard，kaiwicker和rainerheintzmann的《opticalphotonreassignmentmicroscopy(opra)》；关于ism参见physrevlett，104(198101)：1-4，2010中c.b.müller和j.enderlein的《imagescanningmicroscopy》。
本发明有利的扩展方案由权利要求、说明书以及附图中得出。说明书中提及的特征的优点以及多个特征的组合的优点仅仅是示例性的，并且可以替代地或累积地生效，而不必须由根据本发明的实施方式实现所述优点。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，在原始的申请材料的公开内容和专利的公开内容方面适用的是：可以从附图——尤其从多个构件相互之间示出的几何形状和相对的尺寸、以及它们的相对布置和有效连接——得出其他特征。同样地，可以与权利要求所选择的引用偏离地实现并且借此引起本发明的不同的实施方式的特征的组合或不同的权利要求的特征的组合。这也涉及在独立的附图中示出的或在其描述中提及的特征。所述特征也可以与不同的权利要求的特征组合。同样地，对于本发明的其他实施方式，可以缺少在权利要求中列举的特征。
在权利要求和说明书中提及的特征应该在它们的数量方面如此理解：存在恰好所述数量或大于所提及数量的数量，而不需要明确地使用副词“至少”。例如当谈及一个元件时，应如此理解：存在恰好一个元件、两个元件或多个元件。所述特征可以通过其他特征得以补充或是产生相应结果的唯一特征。
权利要求中包含的附图标记不表示对通过权利要求所保护的主题的范围的限制。所述附图标记仅仅用于使权利要求便于理解的目的。
附图说明
以下根据在附图中示出的优选的实施例来进一步阐述和描述本发明：
图1示意性地示出一种根据本发明的扫描荧光显微镜；
图2在测量区域(a)中示出在根据图1的扫描荧光显微镜中构造的线状零位，作为对照，在测量区域(b)中示出点状零位；
图3示出借助根据图(1)的根据本发明的扫描荧光显微镜对测量区域的测量，所述测量关于根据图2(a)的零位的在此调节的不同角位置；
图4示出在调节多个离散角位置的情况下(a)并且在连续旋转根据图2(a)的零位的情况下(b)的借助根据图1的扫描荧光显微镜记录的单个荧光标记的成像；
图5示出具有空间光调制器(slm)的根据图1的荧光扫描显微镜的角度调节装置的第一实施方式；
图6描绘出具有双轴晶体的角度调节装置的第二实施方式；
图7还描绘出具有用于荧光阻止光的区段式地彼此独立的两个部分光路的角度调节装置的另一实施方式；
图8示出偏振旋转装置的三个不同的实施方式，所述三个不同的实施方式包含在根据图5和6的角度调节装置的每个实施中；
图9示出用于多维高分辨率地成像样品中借助荧光标记进行标记的颗粒的路径的根据本发明的方法；
图10是对在图9中绘制的方法中的荧光强度变化过程的记录。
图11示出一种可行方案，所述可行方案对在线状零位的角位置连续变化的情况下产生的光晕进行抑制。
具体实施方式
在图1中强烈示意性地示出扫描荧光显微镜1。扫描荧光显微镜1具有脉冲激光形式的荧光使能光源2，所述荧光使能光源以脉冲形式发出荧光使能光3。荧光使能光3激发荧光标记来发射荧光7，借助该荧光标记来标记样品4中感兴趣的结构。借助物镜5将荧光使能光3聚焦到样品中。在此，样品4中的由荧光使能光3照亮的区域具有通过荧光使能光3的波长情况下的衍射极限预给定的最小尺寸。在此，该照亮区域也称为测量区域。探测器6设置用于测量从样品的测量区域发射的荧光7。在此，探测器6是点探测器，该点探测器借助孔板8与物镜5的焦点共聚焦布置，测量区域围绕该焦点延伸。在没有测量区域内部的空间分辨率的情况下，探测器6测量从测量区域发射的荧光。附加的荧光阻止光源9设置用于将荧光阻止光10指向样品，借助荧光阻止光使测量区域的部分区域中的由荧光使能光3激发的荧光标记重新处于不激发状态，使得所述荧光标记无法对由探测器6测量的荧光做出贡献。具体地，荧光阻止光10通过受激发射使激发的荧光标记重新处于不激发状态。在此，测量区域的在其中使处于不激发状态的部分区域排除样品中的荧光阻止光10的线状零位，该线状零位借助荧光阻止光源9的角度调节装置11构造并且依次指向相对于测量区域的中央的不同的角位置中。荧光阻止光10来自脉冲激光器12。可以涉及所谓的光束扫描仪的扫描装置13对具有测量区域的样品4进行扫描，更确切地说，以线状零位的最小尺寸的一半的小步形式经过测量区域中央对样品进行扫描。在此，对于每个测量区域、即对于样品4中的测量区域的中央的每个位置，借助探测器6测量对于线状零位的借助角度调节装置11调节的不同角位置的荧光7，其中，以荧光使能光源2的荧光使能光3在角位置中的每个中加载样品4。控制装置14设置用于协调荧光使能光源2、脉冲激光器12、荧光阻止光源9的角度调节装置11、探测器6以及扫描装置13，该控制装置通过控制信号或触发信号15来对所述装置起作用。以这种方式，如此存储探测器6的输送给存储器17——所述存储器同样从控制装置14获得控制信号15——的输出信号16，使得输出信号16配属于样品4中的测量区域的中央的所属位置。这可以通过确定的存储空间或与输出信号16一起存储的位置编码来进行。在此，附加地，探测器6的输出信号16包括强度总和，探测器6对于零位的围绕测量区域的固定中央的多个角位置合计(aufsummieren)出该强度总和。可以将来自测量区域的总的荧光7或将总的荧光中的仅一部分、例如其稳定部分合计出该强度总和，所述稳定部分不对于线状零位的不同角位置改变，并且进而可以比荧光7的可变部分更强地配属于测量区域的中央。
图2(a)示出一种根据图1的扫描荧光显微镜1的圆形测量区域18。测量区域18具有直径19。以荧光使能光源2的荧光使能光3在整个测量区域18上加载根据图1的样品4。相反地，测量区域18的分成两半的部分区域20排除经过测量区域18的中央22延伸的线状零位21，在所述分成两半的部分区域20中，以荧光阻止光源9的荧光阻止光10加载测量区域18。在本示例中，中央22上的零位的最小尺寸23如此示出，使得该最小尺寸相应于测量区域18在同一方向上的直径19的1/5。因此，通过荧光阻止光10将测量区域18在一方向上减小到其衍射限制的尺寸的1/5。
由此，还由测量区域18可获得的荧光7的强度也下降到大约1/5，所述荧光仅可以来自零位21的区域。
作为比较，图2(b)示出在具有相对于直径19的经过中央22的相同的最小尺寸的点状零位21′。也就是说，也在此，尺寸23与直径19的比值也为1:5。通过点状零位21′二维地限制测量区域18，并且由测量区域18还可获得的荧光7具有下降到大约1/k2的强度。这表示，相反地，用于测量来自零位21′的显著数量(signifikantemenge)的荧光所需要的时间是用于测量来自根据图2(a)的零位21的显著数量的荧光所需要的时间的k倍。即使在每个测量点处对根据图2(a)的零位21的不同角位置进行调节，具体来说，只要零位21的角位置的数量显著低于k，则也保留线状零位21的这种速度优势。此外，荧光阻止光10的用于构造根据图2(a)的零位21的光功率仅为荧光阻止光10用于构造根据图2(b)的零位21′所需的光功率的一半。即根据图1的脉冲激光器12可以是更低功率的，并且相应地是更加成本有利的，或借助相同的脉冲激光器12可以实现更大的因子k，即可以实现更高的空间分辨率。相同因子情况下更低的光功率也表示，通过入射到测量区域18的光强度降低荧光标记的变淡(bleichen)的风险。
图3示出对于根据图1的扫描荧光显微镜1的测量区域18的步骤顺序，在借助扫描装置13转向(ansteuern)另一测量区域之前执行所述步骤顺序。在步骤(a)中，以荧光使能光3加载测量区域18。在步骤(b)中，以荧光阻止光10加载测量区域18的部分区域20，其中，排除线状零位21。在步骤(c)中，借助探测器6测量从零位21发射的荧光。对于零位21的另一角位置，步骤(d)、(e)和(f)相应于步骤(a)、(b)和(c)，所述另一角位置相对于步骤(b)、(c)中的角位置以45°偏移。这同样适用于步骤(g)到(i)以及(j)到(l)，其中，零位21分别围绕中央22以另外的45°旋转。因此，在所有步骤(a)至(l)中，围绕零位21的圆心角(kreiswinkel)均匀地被零位21的四个角位置所覆盖。在此，可以对于零位21的每个角位置测量样品的显著数量的荧光。因此，也可以对零位21的各个角位置的荧光进行分析处理，或对于零位21的所有角位置仅测量显著数量的荧光。因此，虽然缺少用于单个分析处理的可能性，然而，实现在测量来自测量区域18的荧光的情况下的最大加速。
图4(a)示出在扫描包含荧光标记的样品4的情况下的通过来自样品4的荧光7的对于每个测量区域18合计的强度总和形式的单个标记的成像24。通过零位21的线状延展，不仅对于其中央22落入荧光标记中的测量区域18，而且也对于相邻的测量区域测量荧光标记的荧光7。在此，成像24的尾部25反映出零位21在测量区域18中的定向和延伸。
作为对照，图4(b)示出荧光标记的成像24，在零位21的角位置连续改变的情况下，借助根据图1的扫描荧光显微镜1对于每个测量区域18已经记录成像24。在此，在没有空间上的优选方向的情况下，光晕26在以下点周围分布：测量区域以其中央22与荧光标记在该点相遇。
图5示出具有空间光调制器(slm)27的角度调节装置11的实施方式。线性偏振的荧光阻止光10照射到slm上。slm如此调制荧光阻止光10的相位波前(phasenfront)，使得所述相位波前在光轴的一侧上相对于另外的相位波前延迟λ/2，其中，λ是荧光阻止光的波长。接下来，旋转装置28如此旋转荧光阻止光10的偏振方向，使得该偏振方向平行于相位跳变之间的边界延伸，即平行于波前的两个彼此以λ/2延迟的部分区域延伸。以下以此为前提：在接下来借助物镜5使荧光阻止光10聚焦的情况下构造线状零位21。控制装置29以相互协调的方式操控slm27及旋转装置28。
在根据图6的角度调节装置11的实施方式中，设置另外的旋转装置30和31。射束路径中的第一旋转装置30如此旋转入射的线性偏振的荧光阻止光10的偏振方向，使得双轴晶体32在充分利用所谓的锥形衍射(conicaldiffraction)的情况下并且与另一旋转装置31以及分析处理装置33结合地以所需的方式来调制波前，以便可以构造具有相应的期望的角位置的线状零位21。接下来，旋转装置28又如此定向偏振装置，使得在使荧光阻止光10聚焦的情况下实际地构造零位21。
在根据图7的角度调节装置11的实施方式中，借助偏振射束分离装置34将入射的荧光阻止光10分离为在不同的部分光路42、43上的两个部分射束，其中，相同的相位片35却以围绕射束轴线不同的定向布置。随后，借助偏振射束分离装置34将所述两个部分射束重新合并。在此，部分射束的部分光路42、43的长度如此不同，使得沿着较长的部分光路43延伸的荧光阻止光10相对于沿着较短的部分光路42延伸的荧光阻止光10以脉冲激光器12的脉冲频率倒数的一半延迟。为此，在部分光路中可以布置有在此未示出的光学延迟装置。因此，从角度调节装置11出射的荧光阻止光10具有入射的荧光阻止光10的双倍的脉冲频率，其中，出射的荧光阻止光10交替地由脉冲组成，所述脉冲构造具有以90°偏移的角位置的零位21。为了构造根据图3的所有四个角位置，必须将入射的荧光阻止光10分离成四个部分射束。替代仅借助一个脉冲激光器12提供的荧光阻止光10的分离，也可以使用多个同步脉冲激光器12。根据图7的角度调节装置11的实施方式可以在没有旋转装置28的情况下正常工作。
图8示意性地示出旋转装置28的不同的实施方式。相应地，可以构造根据图6的旋转装置30和31。根据图8(a)，旋转装置28由彼此成45°定向的两个泡克尔斯单元36组成。根据图8(b)，泡克尔斯单元36与固定安装的λ/4片37组合。原则上，这足以将偏振方向旋转到期望方向上。图8(c)示出作为旋转装置28的可旋转支承的λ/2片38。必须一直如此调节λ/2片38围绕光轴的旋转角，使得最终的偏振方向旋转恰好得出期望的偏振方向。在根据图8(a)及(b)的实施方式中，这通过操控泡克尔斯单元36来实现。
图9示出在根据本发明跟踪样品中的颗粒40的路径时借助荧光标记进行标记的颗粒40之间的偏置39。偏置39存在于测量区域18的中央22与颗粒40或荧光标记之间。如果偏置39恒定，对于零位21的不同角位置则得出图10中用实线示出的来自测量区域18的荧光的强度i的期望变化过程41。如果偏置19减小，则强度变化过程41变宽，这在图10中用虚线表明；如果偏置39增大，则强度变化过程41变窄。在偏置39改变定向的情况下，变化过程41的相位相对于图10中描绘的零位21的角位置是不同的。当借助根据图1的扫描装置13使测量区域18总是如此跟踪颗粒40使得强度变化过程41在其形式以及其相位方面不改变的时候，借助中央22以空间上的高分辨率跟踪颗粒40的路径，其中，应该考虑偏置39。
图11(a)示出具有荧光阻止光的强度分布的点状零位的成像。在此，相对于传统的共聚焦扫描荧光显微镜，分辨率提高的因子是k＝5。相应的光学传递函数(otf)的(沿空间频率的)径向下降在图11(b)中示出为点线(gepunktetelinie)并且表示为otf2d(k＝5)。
图11(c)示意性地示出具有与图11(a)相同的光功率、相同的总记录时间、但具有旋转的线状零位的成像。在这种情况下，与传统的共聚焦扫描荧光显微术相比，零位的最小尺寸方向上的单个记录提供具有更高的分辨率提高(k＝8)的成像。各个图像的强度总和导致测量区域的中央中的同样更强高分辨的成像。然而，低频的强权重导致了光晕(hof)的形成。由强度总和所得的otf在图11(d)中示出为虚线并且表示为otf1d(k＝8)。与点线(otf2d(k＝5))相比，相对于点状强度零位的成像，可看出f<1的区域中的低频的更强权重。此外，在具有线状零位的方法中，也更强地传输f>4区域中的高频率，这导致所得成像的附加的信号增益和分辨率增益。对于导致形成光晕的频率的有针对性的抑制，提供根据图11(e)的无光晕的成像。根据图11(f)表明otf的相应的权重。使原始发射的强度总和(虚线，otf1d(k＝8))与合适的加权函数(实线，重新加权的otf1d(k＝8))相适应(angleichen)。因此，对于f<2的区域中的低频率，存在以下信号传输：该信号传输最大相应于具有点状零位(点线，otf2d(k＝5))的方法的信号传输。对于f>2区域中的较高频率，不对强度总和的otf(otf1d(k＝8))进行调制，并且不损害上面所述的信号增益和分辨率增益。
附图标记
1扫描荧光显微镜
2荧光使能光源
3荧光使能光
4样品
5物镜
6探测器
7荧光
8孔板
9荧光阻止光源
10荧光阻止光
11角度调节装置
12脉冲激光器
13扫描装置
14控制装置
15控制信号/触发信号
16输出信号
17存储器
18测量区域
19直径
20部分区域
21零位
22中央
23尺寸
24成像
25尾部
26光晕
27空间光调制器(slm)
28旋转装置
29控制装置
30旋转装置
31旋转装置
32双轴晶体
33分析处理装置
34偏振射束分离装置
35相位片
36泡克尔斯单元
37λ/4片
38λ/2片
39偏置(offset)
40颗粒
41强度变化过程
42部分光路
43部分光路
44镜
i强度