一种il-1ra-pep融合蛋白及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001 ]本发明属于缺血再灌注技术领域，具体涉及一种IL-IRA-PEP融合蛋白及其制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 缺血再灌注损伤是在缺血性损伤的基础上发展而来的，涉及很多疾病和病理过 程。凡是在组织器官缺血基础上的血液再灌注都可能成为发生缺血再灌注损伤的原因。常 见的有，休克时微循环障碍的缓解，心、脑、肺复苏后及冠状动脉痉挛的缓解，或是断肢再植 术及器官移植术后。
[0003] 缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前认为炎症反应是其继发性损伤机理的 一部分，伴随其发生发展过程。炎症反应在缺血再灌注损伤发生后几小时开始持续数天，是 一种迟发型过程，因此针对炎症的治疗就比其他的保护治疗方法有更长的治疗时间窗，是 治疗缺血再灌注损伤的重要靶点。
[0004] IL-IRA是天然的抗炎分子，研究表明，其对于缺血性脑卒中和急性心肌梗塞等缺 血性疾病，均具有一定的治疗作用。但IL-IRA渗透到炎症损伤部位的有效浓度较低，因此限 制了 IL-IRA的治疗疗效。
[0005] PEP是一种细胞渗透肽，两性多肽，其可以携带生物大分子渗透细胞膜及一些生物 膜结构，使这些大分子可以定位到细胞质，胃肠循环，皮下真皮组织，及脑实质等部位，发挥 其生物学效应。IL-IRA和PEP融合蛋白是否可以帮助IL-IRA渗透到一些组织炎症部位，提高 IL-IRA发挥作用的有效浓度，目前，还没有详细的研究报告。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种IL-IRA-PEP融合蛋白。
[0007] 本发明的目的还在于提供上述融合蛋白的制备方法及用途。
[0008] 一种IL-IRA-PEP融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NOl所 不。
[0009] 所述IL-IRA-PEP融合蛋白的基因序列如序列表SEQ ID N02所示。
[0010] 一种含上述IL-IRA-PEP融合蛋白的基因载体。
[0011] 含有上述IL-IRA-PEP融合蛋白的基因载体的宿主菌。
[0012] 扩增上述的IL-IRA-PEP融合蛋白基因的任一基因片段的引物。
[0013] 一种IL-IRA-PEP融合蛋白的制备方法，在构建缺失信号肽的IL-IRA基础上，利用 基因体外重组技术将细胞渗透肽PEP序列与IL-IRA基因相融合。进而构建融合蛋白高效表 达载体，经过发酵和纯化分离技术获得高纯度IL-IRA-PEP融合蛋白。活性实验表明，与IL-IRA比较，IL-IRA-PEP具有更强的拮抗IL-I的效应。
[0014] 所述纯化的IL-IRA-PEP融合蛋白为经过阴、阳离子交换和凝胶过滤层析，3种色谱 分离技术纯化制备的蛋白。
[0015] 上述IL-IRA-PEP融合蛋白在制备缺血再灌注损伤的药物方面的应用。
[0016] 所述IL-IRA-PEP融合蛋白用生理盐水稀释至0.1-5mg/ml，制成静脉注射药物，静 脉注射，治疗缺血再灌注损伤。
[0017] 所述IL-IRA-PEP融合蛋白大鼠体内注射用量为l-100mg/kg。
[0018] 所述的IL-IRA-PEP融合蛋白对缺血再灌注损伤的保护作用，主要是IL-IRA-PEP通 过抑制缺血再灌注诱发的继发性炎症反应，从而达到这种保护作用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明制备了具有抗炎和透膜功能 的IL-IRA-PEP融合蛋白，同时利用PEP具有携带大分子渗透生物膜结构的功能，提高抗炎分 子IL-IRA渗透缺血再灌注损伤大鼠组织的效率，提高IL-IRA到达组织炎症部位有效浓度， 有效地发挥了抑制缺血再灌注损伤继发性炎症反应的作用。
【附图说明】
[0020] 图1为双酶切鉴定构建的PBV/IL-1RA-PEP重组表达载体电泳图。
[0021]图2为纯化制备的IL-IRA-PEP融合蛋白鉴定图。
[0022]图3为制备的IL-IRA-PEP融合蛋白拮抗IL-I生物学活性。
[0023]图4为IL-IRA-PEP融合蛋白对缺血再灌注大鼠脑组织的渗透效率；
[0024] 其中，A:静脉注射的IL-IRA渗透到缺血再灌注脑组织大脑皮层部位;B:静脉注射 的IL-IRA渗透到缺血再灌注脑组织大脑纹状体部位;C:静脉注射的IL-IRA-PEP渗透到缺血 再灌注脑组织大脑皮层部位;D:静脉注射的IL-IRA-PEP渗透到缺血再灌注脑组织纹状体部 位。
[0025]图5为IL-IRA-PEP融合蛋白对缺血再灌注大鼠脑组织中炎性因子含量，炎性细胞 活化和浸润的抑制作用；
[0026] 其中，A:缺血再灌注脑组织中IL-6含量变化;B:缺血再灌注脑组织中TNF-α含量变 化;C:缺血再灌注脑组织中中性粒细胞活化数量变化;D:缺血再灌注脑组织中巨噬细胞浸 润程度变化。
[0027]图6为IL-IRA-PEP融合蛋白减轻缺血再灌注大鼠脑梗死比较图；
[0028] 其中，A:正常大鼠脑组织;B:模型组大鼠脑组织；C=IL-IRA-PEP治疗组大鼠脑组 织。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。由于脑缺血损伤在全身组织缺血损伤中，相同时间所 造成的损伤更为严重，同时，静脉注射IL-IRA在脑中的药物浓度最低，因此，利用脑缺血损 伤再灌注模型研究全身组织缺血再灌注损伤具有代表性，实施例中未详细说明的操作步骤 请参照《分子克隆实验指南》第三版[1]相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版 社)或参阅所用试剂盒的说明书。
[0030] 实施例1IL-1RA-PEP融合基因的构建
[0031] 根据GenBank中IL-1 RA基因序列及TOV2 2 0表达载体多克隆酶切位点，设计引物，上 游引入EcoRI酶切位点，下游引入BamHI酶切位点。重叠 PCR方法扩增IL-IRA-PEP融合基因。 将融合基因与表达载体分别经双酶切和连接反应，并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)， 筛选阳性单克隆，最后经双酶切和测序鉴定构建的重组表达质粒roV220/IL-lRA-PEP(如图 1所示）。
[0032] 实施例2IL-1RA-PEP融合蛋白的表达和纯化
[0033]将含有重组表达质粒的工程菌，42°C诱导表达，通过40L发酵罐进行发酵培养，获 得含有IL-IRA-PEP目的蛋白的菌体。利用阴、阳离子交换层析（Hit rap QFF，Hit rap SPFF)和凝胶过滤(S印hacry I S200)层析纯化目的蛋白IL-IRA-PEP(如图2所示）。
[0034]实施例3活性分析
[0035]设置IL-IRA-PEP融合蛋白 4个浓度梯度lng/ml、10ng/ml、50ng/ml和 100ng/ml，检 测其抑制50pg/ml IL_la(R&D 878七61118，1]54辣丨措如1^4产生11^-2的量，并以11^-11^(1?&0 systems，USA)为对照，37°C，5 % CO2培养细胞24h，每个样品均设3个复孔。比较不同浓度下 IL-IRA-PEP和IL-IRA拮抗IL-Ia的能力，结果如图3所示，IL-IRA-PEP的拮抗能力明显优于 IL-IRA0
[0036] 实施例4动物模型建立
[0037]采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉2h后再通，形成脑缺血再灌注模型，模拟临床缺 血性脑卒中疾病。将大鼠用含4%异氟烷混合空气(N02/02，70/30 % )麻倒，维持体温37°C及 麻醉状态（1.5%异氟烷），分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈 内动脉（ICA)，在ICA近端备线，远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入直径为0.26_ 的尼龙线2〇11。211后，拔出尼龙线lcm，使血流再通。
[0038]实施例5应用治疗方案，结果分析和治疗结果 [0039]治疗方案：
[0040]脑缺血再灌注大鼠，在中动脉阻塞2h，再灌注6h和12h，三个时间点，分别静脉注射 纯化的IL-IRA-PEP融合蛋白24mg/kg。
[0041 ]结果分析方法：
[0042] 缺血再灌注24h，将大鼠断头取脑，进行TTC染色，比较大鼠脑梗死体积。
[0043] 取甲醛固定后的脑组织，石蜡包埋切片，对其免疫组化染色。首先观察与IL-IRA比 较，IL-IRA-PEP融合蛋白渗透脑组织的效率，随后分析IL-6和TNF-a炎性因子表达含量和中 性粒细胞活化数量，以及巨噬细胞浸润周围正常组织程度。
[0044] 治疗结果：
[0045] 如图4所示，与IL-IRA比较，IL-IRA-PEP融合蛋白增强了渗透缺血再灌注大鼠脑组 织的效率，提高了到达脑组织炎症部位的有效浓度。治疗24h后，与模型组相比，IL-IRA-PEP 显著减轻了大鼠脑梗死体积（如图6所示）。同时，IL-IRA-PEP治疗组大鼠脑组织中IL-6和 TNF-a炎性因子含量，以及中性粒细胞活化数量明显减少，巨噬细胞浸润周围正常组织的程 度显著减轻(如图5所示）。因此，构建的IL-IRA-PEP融合蛋白具有显著地渗透血脑屏障和抗 炎功能，其有效地抑制了缺血再灌注脑损伤继发性炎症反应，减轻了脑梗死。
[0046]以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的 技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种IL-1RA-PEP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N01所示。2. 根据权利要求1所述的IL-1RA-PEP融合蛋白，其特征在于，所述IL-1RA-PEP融合蛋白 的基因序列如序列表SEQ ID N02所示。3. -种含权利要求1所述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体。4. 含有权利要求3所述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体的宿主菌。5. 扩增权利要求2所述的IL-1RA-PEP融合蛋白基因的任一基因片段的引物。6. -种IL-1RA-PEP融合蛋白的制备方法，其特征在于，在构建缺失信号肽的IL-1RA基 础上，利用基因体外重组技术将细胞渗透肽PEP序列与IL-1RA基因相融合。7. 权利要求1所述IL-1RA-PEP融合蛋白在制备缺血再灌注损伤的药物方面的应用。8. 根据权利要求7所述的IL-1RA-PEP融合蛋白在制备缺血再灌注损伤的药物方面的应 用，其特征在于，所述IL-1RA-PEP融合蛋白用生理盐水稀释至0. l-5mg/ml，制成静脉注射药 物。
【专利摘要】本发明公开了一种IL-1RA-PEP融合蛋白及其制备方法和用途。该融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ？ID？NO1所示。利用基因体外重组技术将细胞渗透肽PEP序列与抗炎分子IL-1RA基因相融合，构建了融合蛋白表达载体，通过诱导表达，发酵和纯化制备了IL-1RA-PEP融合蛋白。将制备的IL-1RA-PEP融合蛋白用缓冲液稀释至一定的浓度，静脉注射，治疗缺血再灌注损伤。本发明制备的IL-1RA-PEP融合蛋白能显著抑制缺血再灌注继发性炎症反应，减轻组织梗死发生的概率。
【IPC分类】A61P29/00, A61P9/00, C12N15/11, A61K47/48, C12N15/62, A61K38/20, C07K19/00
【公开号】CN105504068
【申请号】CN201610055143
【发明人】徐东刚, 张冬冬, 邹民吉, 付文亮, 徐涛
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月27日