一种复合生长因子抗菌促修复凝胶及其制备方法与应用与流程

本发明属于凝胶领域，尤其涉及复合有生长因子的凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

创面愈合指的是因为外伤或其他伤病的病变造成组织缺损后，局部组织通过再生、修复、重建而进行修补的一系列病理生理过程。其是一个动态、复杂的过程，其涉及到细胞外基质、激酶、各类细胞和许多其他因素等。由于创面愈合过程中病理和生理过程的复杂性，因此，彻底实现组织再生是极其困难的。此外，在临床创面修复过程中，创面微环境还面临着各种细菌感染风险等。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，将人碱性成纤维生长因子(bfgf)和人血管内皮生长因子(vegf)与水凝胶联用，仿生构建创面修复微环境以促进创面的愈合，从而完成本发明。

本发明的一方面在于提供一种复合生长因子抗菌促修复凝胶，具体体现在以下几个方面：

(1)一种复合生长因子抗菌促修复凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，其由包括以下重量配比的原料成分制成：

(2)根据上述(1)所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人血管内皮生长因子的用量分别为0.01～0.02重量份，优选为0.015重量份。

(3)根据上述(1)或(2)所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为15～25重量份，羟乙基纤维素的用量为10～20重量份；优选地，所述羧甲基壳聚糖的用量为20重量份，羟乙基纤维素的用量为10重量份。

(4)根据上述(1)至(3)之一所述的凝胶，其中，所述凝胶还包含甘油和蛋白保护剂，优选地，所述蛋白保护剂为甘露醇。

(5)根据上述(1)至(4)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为10～40重量份，优选为20～40重量份，更优选为30重量份。

(6)根据上述(1)至(5)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述甘露醇的用量为5～20重量份，优选为5～15重量份，更优选为8～12重量份，例如10重量份。

(7)根据上述(1)至(6)之一所述的凝胶，其中基于1000重量份凝胶，当采用醋酸氯已定为抑菌剂时，所述醋酸氯已定的用量为0.3～0.7重量份，更优选为0.5重量份。

(8)根据上述(1)至(7)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，当采用苯扎溴铵为抑菌剂时，所述苯扎溴铵的用量为0.05～0.15重量份，更优选为0.1重量份。

本发明第二方面提供了一种上述(1)至(8)所述复合生长因子促修复凝胶的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将醋酸氯已定或苯扎溴铵加入水中，得到抑菌剂水溶液；

步骤2、将羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素和甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理，得到凝胶基体；

步骤3、将人碱性成纤维生长因子、人血管内表皮生长因子和甘露醇加入水中，然后过滤除菌，得到活性成分；

步骤4、将步骤2得到的凝胶基体与步骤3得到的活性成分混合，搅拌，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

本发明第三方面提供了上述(1)至(8)所述复合生长因子促修复凝胶或第二方面所述方法得到的复合生长因子促修复凝胶用于创面修复的应用。

附图说明

图1示出实施例1(b)和空白组(a)对金黄色葡萄球菌的抗菌性能检测结果；

图2示出实施例1(b)和空白组(a)对大肠杆菌的抗菌性能检测结果；

图3示出采用实施例所述凝胶以及对照组分别对大鼠进行创面修复实验结果；

图4示出采用实施例所述凝胶以及对照组进行大鼠创面修复时，创面修复面积与修复时间的关系结果图。

具体实施方式

下面通过实施例和实验例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

本发明一方面提供了一种复合生长因子促修复凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，其由包括以下重量配比的原料成分制成：

其中，以人碱性成纤维生长因子和人血管成纤维生长因子为活性成分，以羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素形成复合凝胶基质。其中，所述羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素之间可以通过氢键进行复合，形成可降解的水凝胶，用于承载生长因子。

在本发明中，采用羧甲基壳聚糖为凝胶主体的原因在于：(1)其水溶性天然高分子，具有良好的生物相容性、生物可降解性，无毒副作用；(2)其具有抑菌作用；(3)其具有止血作用，对血液中的红血球有凝聚作用，促进凝血，这是因为其所富含的正电荷与细胞表面带负电荷的胞壁酸相互吸引，引起血细胞的聚集，达到止血的目的；(4)其具有弱碱性，其表面的zeta电势不是很高的正值，表明其不会对周围的组织产生强烈的刺激作用，故而可以止痛，还具有消炎作用；(5)其可以防止创面粘连。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人血管内皮生长因子的用量分别为0.01～0.02重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人血管内皮生长因子的用量分别为0.015重量份。

其中，人碱性成纤维生长因子可参与多种组织的创伤修复过程，是重要的创伤愈合因子之一，对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用，并且安全、有效、无不良反应；人血管内皮生长因子是已被证实是唯一对血管形成具有特异性的生长因子，其能促进血管内皮细胞的增值、迁移而调节、促进新生血管的形成，而创面新生血管的生长对于创伤的愈合、减少瘢痕组织的产生和减少感染的发生尤为重要，因此，在本发明中，选择修复用生长因子用以促进创面愈合。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，人碱性成纤维生长因子和人血管内皮生长因子的总用量为0.03重量份。

其中，生长因子总浓度应控制在30μg/g，与临床生长因子用药浓度接近，避免高浓度生长因子潜在的致癌性。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为15～25重量份，羟乙基纤维素的用量为10～20重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为20重量份，羟乙基纤维素的用量为10重量份。

其中，羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素的用量对凝胶的形成至关重要，尤其是羟乙基纤维素。具体地，若羟乙基纤维素的用量太少，体系粘度太小，不能形成凝胶；若羟乙基纤维素的用量太多，会导致体系中形成的氢键密度过大，体系的物理交联程度过大，这样，导致体系的粘度太大，无法涂抹在创面上，而且会导致凝胶中的活性生长因子不易释放。因此，在本发明中，严重控制羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素的用量。

在本发明中，所述羧甲基壳聚糖粘均分子量为200000～300000da，羟乙基纤维素在20℃下、2％水溶液中的黏度为1500～2500mpa·s，在这个黏度以及适当添加比例条件下能使凝胶保持稳定的形态。

根据本发明一种优选的实施方式，所述凝胶还包含甘油和蛋白保护剂。

在进一步优选的实施方式中，所述蛋白保护剂为甘露醇。

其中，所述甘油在凝胶中的作用为保湿剂、助溶剂，蛋白保护剂的作用是保持生长因子的活性。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为10～40重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为20～40重量份。

在更进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为30重量份。

其中，甘油在这个范围内不仅使凝胶具有较好的保湿效果，同时使凝胶保持良好的分散性。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述甘露醇的用量为5～20重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘露醇的用量为5～15重量份。

在更进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘露醇的用量为8～12重量份，例如10重量份。

其中，所述甘露醇的作用是保持生长因子的活性，因此，需要将其控制在一定剂量范围内，其用量不宜太少，太少不起作用，也不宜太多，太多可能会引起负效应。

在本发明中，甘露醇的比例在0.5％～2％，在此比例下生长因子有较好的稳定性，同时不引起皮肤毒性。

根据本发明一种优选的实施方式，当采用醋酸氯已定为抑菌剂时，基于1000重量份凝胶，所述醋酸氯已定的用量为0.3～0.7重量份。

在进一步优选的实施方式中，当采用醋酸氯已定为抑菌剂时，基于1000重量份凝胶，所述醋酸氯已定的用量为0.5重量份。

根据本发明一种优选的实施方式中，当采用苯扎溴铵为抑菌剂时，基于1000重量份凝胶，所述苯扎溴铵的用量为0.05～0.15重量份。

在进一步优选的实施方式中，当采用苯扎溴铵为抑菌剂时，基于1000重量份凝胶，所述苯扎溴铵的用量为0.1重量份。

本发明另一方面提供了一种上述复合生长因子促修复凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将醋酸氯已定或苯扎溴铵加入水中，得到抑菌剂水溶液；

步骤2、将羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素和甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理，得到凝胶基体；

步骤3、将人碱性成纤维生长因子、人血管内表皮生长因子和甘露醇加入水中，然后过滤除菌，得到活性成分；

步骤4、将步骤2得到的凝胶基体与步骤3得到的活性成分混合，搅拌，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

根据本发明一种优选的实施方式，在步骤2中，所述灭菌处理为g60灭菌或高温高压灭菌，优选g60灭菌。

在进一步优选的实施方式中，所述凝胶在10kgy剂量的g60辐射处理或者121℃高温高压下10～20分钟。

其中，在步骤2中，g60辐射灭菌或者高温高压灭菌后凝胶基质黏度均有一定程度下降，加入甘油对胶体还有一定的保护作用。

根据本发明一种优选的实施方式，在步骤4中，于无菌条件下进行。

在进一步优选的实施方式中，在步骤4中，在搅拌后分装铝管，封口处理。

在本发明所述的制备方法中，先将生长因子与甘露醇先混合，然后在于凝胶基体混合，这样的目的是生长因子能与甘露醇形成很好的混合物，同时凝胶制剂需要灭菌，先形成甘露醇-生长因子复合物。在本发明第一方面已有相关陈述，甘露醇的作用是保持生长因子的活性和稳定性。而如果不先进行甘露醇-生长因子的复配，而是直接与凝胶基质混合，则甘露醇会与羧甲基壳聚糖混合而影响其与生长因子的复配，因此，在本发明中，先将甘露醇与生长因子进行复配处理，再与凝胶基质混合。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述凝胶或本发明第二方面所述制备方法得到的凝胶用于创面修复的应用。

其中，所述凝胶可以用于创面修复，在短时间内实现创面愈合。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所述复合生长因子促修复凝胶以羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素形成主要的凝胶基体，赋予所述凝胶生物相容性；

(2)本发明所述复合生长因子促修复凝胶内复合有生长因子，仿生构建创面修复微环境，改善了创面区微环境，促进了伤口和创面的愈合，显著提高创面愈合率，缩短创面愈合时间；

(3)本发明所述复合生长因子促修复凝胶内还含有甘露醇，可以保持生长因子的活性；

(4)所述羧甲基壳聚糖不仅作为凝胶基质覆盖在创面形成一层致密膜，同时还具有缓释生长因子的功能，羧甲基壳聚糖与复合生长因子协同促创面愈合，并控制生长因子进行缓释；

(5)本发明所述复合生长因子促修复凝胶具有良好的抑菌性能，具有一定的控制创面感染、促进创面愈合的作用；

(6)本发明所述方法简单，易于实现。

实施例

以下通过具体实施例进一步描述本发明。不过这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

其中，在实施例中，所述人碱性成纤维生长因子和人血管内表皮生长因子购于西格玛(sigma)。

实施例1

将0.5g醋酸氯已定加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将20g羧甲基壳聚糖、15g羟乙基纤维素和20g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理(10kgy辐射灭菌)，得到凝胶基体；

将15mg人碱性生长因子、15mg人血管内表皮生长因子和10g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

实施例2

将0.7g醋酸氯已定加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将30g羧甲基壳聚糖、8g羟乙基纤维素和30g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理(10kgy辐射灭菌)，得到凝胶基体；

将10mg人碱性生长因子、10mg人血管内表皮生长因子和7g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

实施例3

将0.1g苯扎溴铵加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将15g羧甲基壳聚糖、20g羟乙基纤维素和15g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理(10kgy辐射灭菌)，得到凝胶基体；

将20mg人碱性生长因子、20mg人血管内表皮生长因子和15g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

对比例

对比例1

重复实施例1的过程，区别在于羟乙基纤维素的用量为7g。

发现得到的凝胶粘度很大，无法涂抹在创面上。

对比例2

重复实施例1的过程，区别在于：采用等量的卡波姆替换羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素，得到凝胶。

实验例

实验例1稳定性检测

将实施例1制得的复合生长因子促修复凝胶装于试管内，密封后放置2～4℃下，分别于2周、4周、6周和8周检测凝胶的外观、重量、ph值、生物学活性和无菌检测。其中，实施例1得到的凝胶检测结果如表1所示，对比例2得到的凝胶检测结果如表2所示。

表1：

表2：

由上表可以看出，相较于对比例2得到的凝胶，本发明所述复合生长因子促修复凝胶具有良好的稳定性。

实验例2抗菌性检测

采用圆片法对实施例1制得的凝胶以及空白组(生理盐水)进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能检测，结果分别如图1和图2所示，其中，a表示空白组，b表示实施例1。

与空白组相比，实施例1得到的凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌圈(箭头处)。

实施例3大鼠创面修复实验

将体重为200～250g的大鼠麻醉后，背部皮肤剃毛，先用记号笔画圈，然后用剪刀剪皮肤，形成直径约12mm的圆形创面，每天进行创面消毒和实施例1得到的凝胶处理，观察大鼠皮肤愈合情况。每组6只重复。同时，进行对照组实验，其中，对照组为生理盐水。创面修复情况分别如图3和图4所示。

其中，在图3和图4中可知，与对照组相比，本发明所述凝胶能加快创面愈合速度，在14d左右基本愈合。

同样，采用对比例2得到的凝胶对大鼠创面进行处理，发现，在相同处理时间下，其创面愈合情况差于本申请所述凝胶对大鼠的愈合情况，并且，采用对比例2得到的凝胶，需要大约18天左右才能愈合。

猜测原因在于，本申请所述凝胶采用羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素形成复合凝胶基质，更有利于促进药物释放，达到良好的修复效果，缩短修复时间。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。