本发明涉及一种超临界萃取物，具体涉及一种鲜冬虫夏草超临界萃取物及其该萃取物的制备方法和在制备治疗肺癌药物领域的应用。
背景技术：
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌cordycepssinensis(berk.)sacc寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体，是一味传统的名贵中药材，与人参、鹿茸齐名并誉为中国的三大补药。中医认为冬虫夏草能补肺益肾、止咳化痰，用于肾精亏虚、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘、痨嗽咳血(《中国药典》2015版)。现代药理研究表明冬虫夏草具有降血糖、降血脂、抗炎症、抗病毒和抗肿瘤等疗效。冬虫夏草的抗肿瘤功效近年来更是成为研究热点，科学研究证明冬虫夏草能够抑制肿瘤的增殖和转移，显示出广谱的抗肿瘤作用。
肺癌是威胁人类健康的主要疾病，其中非小细胞肺癌约占全部肺癌的80％，且就诊时多数病人已届晚期，化疗效果较差，预后不良，已成为世界范围内引起肿瘤患者死亡的主要原因。目前研究表明冬虫夏草对非小细胞肺癌有抑制作用，然而现有文献报道冬虫夏草的抗肿瘤活性试验都是以烘干、晒干蛹虫草或者人工虫草菌丝为研究原料，采用水提方式进行试验。如文献《北虫草水提物对肺腺癌细胞a549的影响》报道了北虫草水提物可抑制肺腺癌细胞a549的生长，细胞形态发生明显变化。文献《冬虫夏草及人工虫草菌丝抗小鼠lewis肺癌的实验研究》报道了天然虫草及虫草菌丝水提物对小鼠皮下移植性lewis肺癌的生长均具有明显抑制作用。
超临界流体萃取技术(supercriticalfluidextraction,sfe)是近年来迅速发展的被人们所知的“绿色分离”新型技术，co2为最常用的超临界流体。现有文献中关于超临界co2流体萃取冬虫夏草的研究主要是以冬虫夏草人工发酵产物、冬虫夏草子座、虫草菌粉等为原料，且未对萃取物进行深入研究。如中国专利(zl01126909.x)一种超临界萃取虫草油的生产方法中，以虫草属真菌的人工发酵物为原料，采用超临界co2萃取技术获得虫草油。文献《超临界co2萃取冬虫夏草子座挥发性成分的gc-ms研究》和《九州虫草子座挥发油的超临界co2流体萃取剂gc-ms分析》分别仅对冬虫夏草子座部分和九州虫草的挥发性成分进行了超临界萃取。
技术实现要素：
鲜冬虫夏草不经高温晒干或烘干，而是低温冷冻干燥，能极大程度的保留其营养、有效成分，特别是挥发性成分和热敏性的大分子活性物质。本发明将鲜冬虫夏草经超临界co2流体萃取得到的萃取物对抗肿瘤有突出作用，且活性成分明确，为提取冬虫夏草中活性成分的研究提供新的方法和思路。
本发明目的是针对现有技术的缺陷和不足，提供一种鲜冬虫夏草超临界萃取物，该萃取物对非小细胞肺癌a549有明显的抑制作用，且有效成分明确；制备过程无毒，无残留，安全性高；操作简便，萃取率高，易于规模化生产。
本发明的目的是通过下述技术方案实现：
一方面，本发明提供了一种鲜冬虫夏草超临界萃取物，其特征在于，是以鲜冬虫夏草为原料，经超临界co2流体萃取而得；其中所述萃取物主要包括核苷类、脂肪酸类、甾醇类物质；其中核苷类主要包括腺苷、肌苷、鸟苷和尿苷，脂肪酸类主要包括油酸、棕榈酸、亚油酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、十五碳酸、棕榈油酸、十七碳酸、硬脂酸、亚麻酸和二十碳酸，甾醇类包括胆甾醇、麦角甾醇、豆甾醇和谷甾醇。
在一些实施例中，所述核苷类物质所占含量百分比为：0.0015％～0.0032％，其中肌苷:鸟苷:腺苷＝1:1.95～2.34:2.27～0.53:4.28～4.42；甾醇类物质所占含量百分比为：1％～2.53％，其中豆甾醇:谷甾醇:胆甾醇:麦角甾醇＝1:2.5～3.4:8.72～9.42:15.6～17.2；脂肪酸类物质中亚油酸、棕榈酸、油酸三种物质的气相色谱峰面积比例为1:0.98～1.32:2.43～2.82。
在一些实施例中，所述超临界萃取物中腺苷、鸟苷、肌苷和尿苷的含量分别为11.85μg/g、6.57μg/g、2.73μg/g、5.87μg/g；所述超临界萃取物中胆甾醇、麦角甾醇、豆甾醇和谷甾醇的含量分别为0.46％、0.84％、0.05％、0.15％；所述超临界萃取物中肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七碳酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳酸的气相色谱面积百分比(％)分别是0.15、0.07、0.08、23.85、0.74、0.05、1.19、52.34、19.72、1.05、0.10；其中气相色谱条件：agilentdb-23毛细管柱(30m×320μm，0.25μm)；进样口温度：270℃；载气：氦气；流速1ml/min；进样量1μl，分流比10:1；升温程序：初始温度130℃，保持1min，以6.5℃/min升至170℃，以1.5℃/min从170℃升至211.5℃，以10℃/min升至230℃，保持3min。质谱条件：电子轰击离子源(ei)；电子能量70ev；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；离子扫描范围15～750，全扫描方式。
在一些实施例中，所述萃取物中核苷类物质与甾醇类物质的含量百分比为1:540～560。
在一些实施例中，本发明所述所述萃取物中核苷类物质与甾醇类物质的含量百分比为1:555.6。
在一些实施例中，所述超临界co2流体萃取包括下述步骤：
a.将鲜冬虫夏草冷冻干燥、粉碎至过40目筛；
b.将粉碎好的冬虫夏草细粉装入萃取釜中，通入超临界co2流体，设置萃取参数为：萃取主泵调频18～22hz，萃取釜温度为32～37℃，萃取釜压力为20～25mpa；分离釜温度为40～45℃，分离釜压力为4～6mpa；萃取1-2h，收集萃取后产物，得到鲜冬虫夏草超临界萃取物。
在一些实施例中，本发明所得到的鲜冬虫夏草超临界萃取物为黄棕色固态物，常温放置后呈流动的液态状，置于-20℃冰箱保存。
另一方面，本发明提供了一种鲜冬虫夏草超临界萃取物的制备方法，其特征在于，包括：
a.将鲜冬虫夏草冷冻干燥、粉碎至过40目筛；
b.将粉碎好的冬虫夏草细粉装入萃取釜中，通入超临界co2流体，设置萃取参数为：萃取主泵调频18～22hz，萃取釜温度为32～37℃，萃取釜压力为20～25mpa；分离釜温度为40～45℃，分离釜压力为4～6mpa；萃取1-2h，收集萃取后产物，得到鲜冬虫夏草超临界萃取物。
在一些实施例中，其制备方法包括下述步骤：
a.将鲜冬虫夏草冷冻干燥、粉碎至过40目筛；
b.将粉碎好的冬虫夏草细粉装入萃取釜中，通入超临界co2流体，设置萃取参数为：萃取主泵调频18hz，萃取釜温度为32℃，萃取釜压力为20mpa；分离釜温度为45℃，分离釜压力为4mpa；萃取2h，收集萃取后产物，得到鲜冬虫夏草超临界萃取物。
另一方面，本发明提供了一种包含本发明所述鲜冬虫夏草超临界萃取物或本发明所述鲜冬虫夏草超临界萃取物的制备方法制备的鲜冬虫夏草超临界萃取物和制剂辅料的组合物。
在一些实施例中，本发明所述组合物可制备成不同的剂型，包括软胶囊、胶囊剂、注射剂、溶液型、纳米及靶向制剂等。
另一方面，本发明提供了本发明所述的鲜冬虫夏草超临界萃取物或本发明所述鲜冬虫夏草超临界萃取物的制备方法制备的鲜冬虫夏草超临界萃取物或本发明所述的组合物在制备治疗肺癌药物方面的应用。
本发明所述的“气相色谱”，其条件：agilentdb-23毛细管柱(30m×320μm，0.25μm)；进样口温度：270℃；载气：氦气；流速1ml/min；进样量1μl，分流比10:1；升温程序：初始温度130℃，保持1min，以6.5℃/min升至170℃，以1.5℃/min从170℃升至211.5℃，以10℃/min升至230℃，保持3min。质谱条件：电子轰击离子源(ei)；电子能量70ev；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；离子扫描范围15～750，全扫描方式。
本发明所述的“主要包括”是指包括的物质为主要成分，是使达到本发明所述效果的有效成分，还可能包括其他物质，其他物质含量较低，无法分离鉴别，对本发明有益效果基本无影响。
本发明的积极效果：
1.本发明所提供的超临界co2萃取方法得到的萃取物，对人非小细胞肺癌a549细胞、人淋巴瘤raji细胞、小鼠黑色素瘤b16细胞、人宫颈癌hela细胞和人肝癌hepg2细胞都有较强的抑制作用，相较普通方法得到的鲜冬虫夏草提取物在人非小细胞肺癌a549细胞、小鼠黑色素瘤b16细胞、人肝癌hepg2细胞具有更好的抑制效果。
2.本发明所提供的超临界co2萃取方法与常规水提相比，具有提取效率高、提取速度快，且萃取物无溶剂残留，对环境无污染的特点。
3.本发明所得的鲜冬虫夏草萃取物含有多种活性成分，包含腺苷、肌苷、鸟苷、尿苷等核苷类物质，麦角甾醇、胆甾醇等甾醇类物质，亚油酸、棕榈酸等不饱和脂肪酸，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为对照品和样品的高效液相色谱图(a：核苷混合对照品溶液，b：样品；1为尿苷，2为肌苷，3为鸟苷，4为腺苷)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
冬虫夏草来源：宜昌山城水都冬虫夏草有限公司新鲜采收。
实施例1
取新鲜冬虫夏草刷去泥沙，洗净，冷冻干燥，粉碎成细粉过40目筛。取粉碎好的500g冬虫夏草细粉装入萃取釜中，启动萃取、分离温控仪表，设置萃取釜温度为32℃，分离釜温度为40℃，启动制冷，当制冷温度达到6℃，打开气阀，调节主泵频率18hz，调节各阀门大小，使萃取阀的压力为20mpa，分离釜的压力为6mpa，使超临界co2循环萃取，每隔10min，打开分离釜阀门收集萃取物，萃取1h，得到30g黄棕色萃取物，提取率为6％。
实施例2
取新鲜冬虫夏草刷去泥沙，洗净，冷冻干燥，粉碎成细粉过40目筛。取粉碎好的500g冬虫夏草细粉装入萃取釜中，启动萃取、分离温控仪表，设置萃取釜温度为37℃，分离釜温度为40℃，启动制冷，当制冷温度达到6℃，打开气阀，调节主泵频率22hz，调节各阀门大小，使萃取阀的压力为25mpa，分离釜的压力为5mpa，使超临界co2循环萃取，每隔10min，打开分离釜阀门收集萃取物，萃取1.5h，得到37g黄棕色萃取物，提取率为7.4％。
实施例3
取新鲜冬虫夏草刷去泥沙，洗净，冷冻干燥，粉碎成细粉过40目筛。取粉碎好的500g冬虫夏草细粉装入萃取釜中，启动萃取、分离温控仪表，设置萃取釜温度为35℃，分离釜温度为45℃，启动制冷，当制冷温度达到6℃，打开气阀，调节主泵频率20hz，调节各阀门大小，使萃取阀的压力为23mpa，分离釜的压力为4mpa，使超临界co2循环萃取，每隔10min，打开分离釜阀门收集萃取物，萃取2h，得到34g黄棕色萃取物，提取率为6.8％。
实施例4
取新鲜冬虫夏草刷去泥沙，洗净，冷冻干燥，粉碎成细粉过40目筛。取粉碎好的500g冬虫夏草细粉装入萃取釜中，启动萃取、分离温控仪表，设置萃取釜温度为35℃，分离釜温度为43℃，启动制冷，当制冷温度达到6℃，打开气阀，调节主泵频率18hz，调节各阀门大小，使萃取阀的压力为24mpa，分离釜的压力为5mpa，使超临界co2循环萃取，每隔10min，打开分离釜阀门收集萃取物，萃取2h，得到36g黄棕色萃取物，提取率为7.2％。
实施例5
取新鲜冬虫夏草刷去泥沙，洗净，冷冻干燥，粉碎成细粉过40目筛。取粉碎好的500g冬虫夏草细粉装入萃取釜中，启动萃取、分离温控仪表，设置萃取釜温度为32℃，分离釜温度为45℃，启动制冷，当制冷温度达到6℃，打开气阀，调节主泵频率20hz，调节各阀门大小，使萃取阀的压力为20mpa，分离釜的压力为4mpa，使超临界co2循环萃取，每隔10min，打开分离釜阀门收集萃取物，萃取2h，得到40g黄棕色萃取物，提取率为8％。
实施例6
鲜冬虫夏草超临界萃取物核苷类成分的液相色谱分析
(1)对照品混合溶液的配制：分别称取对照品尿苷17.50mg、肌苷20.47mg、鸟苷22.18mg、腺苷22.18mg，用超纯水溶解定容至100ml，制成对照品混合溶液。
(2)供试品溶液的制备：称取实施例5的鲜冬虫夏草超临界萃取物501.82mg，置2ml离心管中，加入超纯水1ml，密封，混匀，在50℃条件下超声30min，摇匀，离心(12000rpm)5min，取下层水层转移至2ml离心管中，用80℃氮吹至干，加入100μl超纯水复溶，经0.45μm水系滤头滤过后即得待测样品。
(3)色谱条件：agilentzorbaxsb-aq色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.04mol/l磷酸二氢钾溶液(a)和乙腈(b)，梯度洗脱：0-7min，0％b；7-20min，0％-3％b；20-30min，3％-18％b；30-35min，18％-18％b；35-40min，18％-0％b；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样体积5μl；检测波长260nm。
(4)检测结果：分别精密量取混合对照品溶液，制成一系列浓度，测定。如图1所示为核苷混合对照品和鲜冬虫夏草萃取物样品的高效液相色谱图。以对照品峰面积对数为纵坐标，对照品对应的浓度对数为横坐标，得到标准曲线；然后将样品的峰面积代入方程，得到样品的实际浓度c(mg/ml)；核苷含量计算公式：
c为核苷浓度(mg/ml)；v为定容体积(ml)；m为称样量(m)
由表1可知，本发明萃取物经液相色谱分析，萃取物中腺苷、鸟苷、肌苷和尿苷的含量分别为11.85μg/g、6.57μg/g、2.73μg/g、5.87μg/g。
表1本发明萃取物的核苷液相色谱分析结果
由实施例6和实施例7的结果可知，实施例5的萃取物当中核苷类物质与甾醇类物质的含量百分比为1:555.6，如表2所示。
表2核苷类物质与甾醇类物质的含量百分比
实施例7
鲜冬虫夏草超临界萃取物甾醇类物质气相色谱-质谱分析
(1)对照品混合溶液配制：精密称取对照品胆甾醇3.06mg和麦角甾醇6.94mg，用吡啶溶解并定容至10ml，精密称取对照品豆甾醇4.96mg和谷甾醇4.92mg，用吡啶溶解并定容至50ml，制成对照品储备液。分别吸取1ml各对照品储备液混合，即得对照品混合溶液。取500μl至10ml气相瓶中，加入bstfa500μl，于70℃下衍生30min，过0.22μm有机滤膜，取续滤液即得待测样品。
(2)供试品溶液的制备：称取实施例5鲜冬虫夏草萃取物100.2mg，加入0.5mol/l氢氧化钾-乙醇溶液5ml，于85℃下水浴皂化30min，趁热加入乙醇5ml，摇匀。吸取溶液5ml加于氧化铝柱中，以100ml梨形瓶收集洗脱液，打开活塞，放出溶剂直到液面达氧化铝顶层。先用5ml乙醇洗涤不皂化物，再用40ml乙醚洗涤，流速大约为2ml/min。用旋转蒸发仪去除溶剂，用5ml吡啶复溶，取500μl至10ml气相瓶中，加入bstfa500μl，于70℃下衍生30min，过0.22μm有机滤膜，取续滤液即得待测样品。
(3)气相色谱条件：agilentdb-5毛细管柱(60m×250μm，0.25μm)；进样口温度：330℃；载气：氦气；流速1.5ml/min；进样量1μl，分流比2:1；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以15℃/min升至300℃，保持42min。质谱条件：电子轰击离子源(ei)；电子能量70ev；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；离子扫描范围15～750，全扫描方式。
(4)结果：由表3可知，本发明萃物取经气相色谱-质谱联用分析，萃取物中胆甾醇、麦角甾醇、豆甾醇和谷甾醇的含量分别为0.46％、0.84％、0.05％、0.15％。
表3萃取物中甾醇的气相色谱-质谱联用分析结果
实施例8
鲜冬虫夏草超临界萃取物脂肪酸类成分气相色谱-质谱联用分析
(1)供试品溶液的制备：称取实施例5鲜冬虫夏草萃取物15.2mg，于50ml梨形瓶中，加入0.5mol/l氢氧化钾-甲醇溶液4ml，混匀，沸水回流30min后取出，加入12％的bf3-甲醇溶液5ml，混匀，沸水回流30min后取出，加入异辛烷3ml和饱和氯化钠溶液20ml，振荡15s，继续加入饱和氯化钠溶液至容器颈部，静置待分层后，用一次性注射器吸取上层溶液2ml，再加入无水硫酸钠1g去除痕量水，混匀分层后，取上层经0.22μm有机系针头过滤器过滤后待分析。
(2)色谱条件：agilentdb-23毛细管柱(30m×320μm，0.25μm)；进样口温度：270℃；载气：氦气；流速1ml/min；进样量1μl，分流比10:1；升温程序：初始温度130℃，保持1min，以6.5℃/min升至170℃，以1.5℃/min从170℃升至211.5℃，以10℃/min升至230℃，保持3min。质谱条件：电子轰击离子源(ei)；电子能量70ev；离子源温度230℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；离子扫描范围15～750，全扫描方式。
(3)结果：由表4可知，本发明萃取物中包含有11种脂肪酸类物质，其中油酸、棕榈酸和亚油酸所占比例最大，气相色谱分别占52.34％、23.85％和19.72％。
表4萃取物中脂肪酸类成分气相色谱-质谱联用分析结果
实施例9
鲜冬虫夏草超临界萃取物对肿瘤细胞的抑制作用
取适量实施例5鲜冬虫夏草萃取物，用dmso溶解配成浓度为6.60mg/ml的初始浓度，用dmso对初始浓度进行2倍梯度稀释，共设10个浓度。收集对数生长期的人非小细胞肺癌a549细胞、人淋巴瘤raji细胞、小鼠黑色素瘤b16细胞、人宫颈癌hela细胞和人肝癌hepg2细胞，传代后隔天观察，待细胞生长至整个培养瓶的80％之后，用一定体积胰酶消化，待细胞变圆﹑上浮后，加入等体积的完全培养基终止消化，再转移至15ml无菌离心管中，1000r/min离心4min，弃上清液用完全培养基重新悬浮细胞，活细胞计数仪计数，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板，每孔接种体积为100μl。在37℃，5％co2条件下孵育24h后，按2μl/孔加入不同浓度的鲜冬虫夏草萃取物，然后每孔再加入98μl完全培养基，使整个体系体积为200μl，整个体系药物的终浓度分别为6.604mg/ml、3.302mg/ml、1.651mg/ml、0.826mg/ml、0.413mg/ml、0.206mg/ml、0.103mg/ml、0.0516mg/ml、0.0258mg/ml、0.0129mg/ml。对每个细胞株，每个浓度设2个复孔。加完药之后，置于37℃，5％co2培养箱中，孵育72h后加入cck-8，每孔加20ul，置于37℃培养箱中继续孵育1-2小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度值。
表5萃取物对肿瘤细胞生长抑制结果
实验结果如表5所示，冬虫夏草超临界流体萃取物对以上所述的癌细胞株都有抑制作用。其半数抑制率分别为0.064mg/ml、1.34mg/ml、0.43mg/ml、0.85mg/ml、1.00mg/ml，其中，对人非小细胞肺癌a549细胞具有很强的抑制作用，ic50仅为0.064mg/ml。
对比例实施例
鲜冬虫夏草冷提物和热提取物对肿瘤细胞的抑制作用
(1)鲜冬虫夏草冷提取物的制备：取鲜冬虫夏草10g，剪碎，加12倍量的水，匀浆，控制温度为20℃，将鲜冬虫夏草粉碎成细小颗粒悬浊液，超声辅助提取30min，超声功率为600w，控制温度为20℃，然后将鲜冬虫夏草提取液置于-20℃冰箱冷冻静置40min取出，匀浆并分散均匀，再次超声提取30min，控制温度控制在20℃，离心15min，收集上清液，冷冻干燥得鲜冬虫夏草提取物。
(2)鲜冬虫夏草热提取物的制备：鲜冬虫夏草冷提取物的制备：取鲜冬虫夏草10g，剪碎，加12倍量的水，匀浆，控制温度为25℃，将鲜冬虫夏草粉碎成细小颗粒悬浊液，超声辅助提取30min，超声功率为600w，控制温度为100℃，然后将鲜冬虫夏草提取液置于-20℃冰箱冷冻静置40min取出，匀浆并分散均匀，再次超声提取30min，控制温度控制在100℃，离心15min，收集上清液，冷冻干燥得鲜冬虫夏草热提取物。
(3)鲜冬虫夏草冷提取物和热提取物对肿瘤细胞的抑制作用
取适量上述鲜冬虫夏草冷提取物和热提取物，用dmso溶解配成浓度为6.60mg/ml的初始浓度，用dmso对初始浓度进行2倍梯度稀释，共设10个浓度，其余步骤与实施例9相同。使整个体系终浓度分别为6.604mg/ml、3.302mg/ml、1.651mg/ml、0.826mg/ml、0.413mg/ml、0.206mg/ml、0.103mg/ml、0.0516mg/ml、0.0258mg/ml、0.0129mg/ml。
表6鲜冬虫夏草冷提取物和热提物对肿瘤细胞生长抑制结果
实验结果如表6所示，鲜冬虫夏草超临界萃取物除了能达到冬虫夏草冷提取物或热提取物对以上所述的癌细胞株的作用，对人非小细胞肺癌a549细胞、小鼠黑色素瘤b16细胞和人肝癌hepg2细胞的鲜冬虫夏草超临界萃取物具有更好的选择性，效果较好。