本发明涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法。
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：据who统计报告，糖尿病已成为严重危害人类健康的三大主要疾病之一。提高糖尿病的治疗水平是一个国家最主要的医疗卫生目标之一。鉴于分泌胰岛素的细胞(β细胞)的缺乏是糖尿病发病的关键所在,理论上只有移植分泌胰岛素的组织或细胞，才能使血糖控制达到生理水平，且不发生低血糖现象。目前糖尿病的内科治疗难以达到此目标，并不能从根本上解决其慢性并发症的问题。胰岛细胞移植是一种非常有前景的治愈糖尿病的手段。虽然既往已经在实验动物模型中成功地根治了糖尿病，但是在临床应用上仍有很多问题需要解决，如：移植的胰岛细胞需要有足够高的活性才能逆转高血糖状态、移植的胰岛细胞需要足够多的数量、排斥反应、受者再次出现自身免疫反应，等等。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。并且，间充质干细胞具有调节免疫反应的能力，能够很好的弥补胰岛细胞移植后受体的免疫排斥现象。技术实现要素：本发明需解决的技术问题是提供一种疗效好的治疗糖尿病的干细胞制剂。为解决上述的技术问题，本发明设计了一种治疗糖尿病的干细胞制剂，其包括间充质干细胞和胰岛细胞，所述间充质干细胞的浓度为4～6×105个/ml，所述胰岛细胞的浓度为1×106-8个/ml。作为本发明进一步改进，所述治疗糖尿病的干细胞制剂还包括15-20ng/ml的低分子肝素钠、青霉素、链霉素、和体积分数为1～3％的多糖。作为本发明进一步改进，所述间充质干细胞的浓度为5×105个/ml，所述胰岛细胞的浓度为1×107个/ml。本发明还提供了一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：s1：制备间充质干细胞的步骤，其包括：s11：获得人脐带组织，经胶原酶ⅱ消化，再加入dmem/f12培养，过滤，收集滤液；s12：离心滤液，弃上清，将离心沉淀下来的细胞dmem/f12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；s13：当细胞达融合后，用胰蛋白酶不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；s2：制备胰岛细胞的步骤，其包括：s21：获得胰腺组织，去除脂肪，再灌注胶原酶，使胰腺组织膨胀；s22：在胶原酶工作液中水浴膨胀的胰腺组织，剪碎后继续水浴，至胰腺组织被消化；s23：再用筛网滤过消化组织液，加入高渗枸橼酸盐嘌呤保存溶液，冰浴至胰腺组织中的胰岛细胞全部游离出来；s24：再将游离状态的胰岛细胞分离纯化出来，得到胰岛细胞悬液；s3：配制所述治疗糖尿病的干细胞制剂的步骤，包括：将所述间充质干细胞悬液添加到所述胰岛细胞悬液中，边添加，边混合，混合均匀后，再添加15-20ng/ml的低分子肝素钠、青霉素、链霉素、和体积分数为1～3％的多糖，混合均匀。作为本发明进一步改进，所述步骤s24中的分离纯化包括以下步骤：将游离状态的胰岛细胞离心，弃上清，再加入高渗枸橼酸盐嘌呤保存溶液，得细胞悬液；再在该细胞悬液中加入纯化液，收集层与层之间的胰岛细胞，再离心，弃上清，得到胰岛细胞悬液。本发明将胰岛细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂，可通过静脉注射该干细胞制剂的方法来治疗i型糖尿病。间充质干细胞具有调节免疫反应的能力，能够很好地弥补胰岛细胞移植后受体的免疫排斥现象，因而，本发明干细胞制剂治疗糖尿病的疗效非常好。具体实施方式为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。本发明提供一种治疗糖尿病的干细胞制剂，将胰岛细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂，可通过静脉注射该干细胞制剂的方法来治疗i型糖尿病，疗效非常好。本发明干细胞制剂包括间充质干细胞和胰岛细胞，所述间充质干细胞的浓度为4～6×105个/ml，所述胰岛细胞的浓度为1×106-8个/ml。更优的是，所述间充质干细胞的浓度为5×105个/ml，所述胰岛细胞的浓度为1×107个/ml。间充质干细胞具有调节免疫反应的能力，能够很好地弥补胰岛细胞移植后受体的免疫排斥现象，因而，本发明干细胞制剂治疗糖尿病的疗效非常好。本发明干细胞制剂中，还包括有15-20ng/ml的低分子肝素钠、青霉素、链霉素、和体积分数为1～3％的多糖。低分子肝素钠具备抗凝、抗沉淀的作用,青霉素和链霉素起到联合抗菌作用,多糖的作用是保护细胞膜,维持细胞膜的透过性。本发明干细胞制剂的制备方法,包括以下步骤：s1:制备间充质干细胞的步骤s11:获得人脐带组织,经胶原酶ⅱ消化,再加入dmem/f12培养,过滤,收集滤液；s12:离心滤液,弃上清,将离心沉淀下来的细胞dmem/f12接种于培养瓶中,移入培养箱中进行培养；s13:当细胞达融合后,用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化,传至第三代后用完全消化进行传代,得到间充质干细胞悬液；s2:制备胰岛细胞的步骤s21:获得胰腺组织,去除脂肪,再灌注胶原酶,使胰腺组织膨胀；s22:在胶原酶工作液中水浴膨胀的胰腺组织，剪碎后继续水浴，至胰腺组织被消化；s23:再用筛网滤过消化组织液，加入高渗枸橼酸盐嘌呤保存溶液，冰浴至胰腺组织中的胰岛细胞全部游离出来；s24:再将游离状态的胰岛细胞分离纯化出来，得到胰岛细胞悬液；其中分离纯化的步骤包括将游离状态的胰岛细胞离心，弃上清，再加入高渗枸橼酸盐嘌呤保存溶液，得细胞悬液；再在该细胞悬液中加入纯化液，收集层与层之间的胰岛细胞，再离心，弃上清，得到胰岛细胞悬液。s3：配制所述治疗糖尿病的干细胞制剂：将所述间充质干细胞悬液添加到所述胰岛细胞悬液中，边添加，边混合，混合均匀后，再添加15-20ng/ml的低分子肝素钠、青霉素、链霉素、和体积分数为1～3％的多糖，混合均匀。下面结合具体的实施例对本发明进一步详细说明1、获取间充质干细胞在本实施中，间充质干细胞来源于人的脐带。取足月剖宫产胎儿的脐带约4～6cm长，在无菌条件下抽净脐带血，pbs中侵渍，4℃保存，4h后进行分离纯化。将该4～6cm长脐带放入超净台中，去除动静脉及外膜，pbs进行初次漂洗几次，剪成1cm小段，再用pbs多次漂洗以尽可能去除血液，最后剪成肉糜状。再移入50ml离心管，加入5ml的、经37℃预热的、质量分数为0.1％的胶原酶ⅱ消化，在37℃水浴摇床中振荡消化180min左右。再加入30mldmem/f12培养，反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液。将该滤液用1000转/min离心10min，弃上清，将离心沉淀下来的细胞按1×106/ml的密度用含10％fbs(胎牛血清)的dmem/f12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养,次日首次换液，以后每3d换液1次。当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶液配制：pbs缓冲液200ml，胰蛋白酶0.5g，edta(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化进行传代纯化，传代代数标记分别为p1、p2、p3。传至第三代(p3)后用完全消化进行传代，传代后得到脐带间充质干细胞悬液。2、获取胰岛细胞胰腺组织的预处理:去除脂肪：将胰腺放在置于冰上的一小弯盘内,用d-hbss冲洗胰腺,尽快去除脂肪和胰腺表面的包膜及血管和淋巴结，再用d-hbss冲洗胰腺。胰腺灌注：找到胰管开口,将18g聚四氟乙烯导管插入胰管内并于开口处结扎固定,用50inl注射器将180-240ml的37℃胶原酶工作液注入，灌注时将胰腺轻轻提起，并用动脉夹将渗漏处夹住，使胰腺充分膨胀，拔出聚四氟乙烯导管，用动脉夹夹住胰管开口，以防胶原酶溢出。胰岛细胞的分离：37℃水浴：将膨胀的胰腺置于装有100ml胶原酶工作液的500ml塑料烧杯内，37℃水浴5分钟。两步消化法：(1)将膨胀的胰腺均匀剪成0.5-1cm3的碎块，放入三个玻璃珠(直径约1.5cm)，继续37℃水浴，并轻轻摇动，12-15分钟后大多数胰腺组织被消化。(2)用80目的筛网滤过消化组织液，加入体积为胰腺组织悬液的1/3的4℃hc-a保存液(高渗枸橼酸盐嘌呤保存溶液)，冰上轻摇，冰浴，继续消化至胰岛细胞全部游离。(以上60分钟内完成,其间多点监测ph和温度,使ph在7.8士0.1,温度在37士0.5℃)胰岛细胞的纯化：(l)冰上贮存90分钟后，离心l分钟(250g)，弃上清，加入9ml的hc-a保存液，制成细胞悬液。(2)再将的细胞悬液与1.125g/cm3的纯化液混匀于50ml的离心管内，收集层与层之间的胰岛细胞，再离心10分钟，弃去上清，得胰岛细胞悬液。3、配制将间充质干细胞悬液添加到胰岛细胞悬液中，边添加，边混合，并调节间充质干细胞的浓度为5×105个/ml、胰岛细胞的浓度为1×107个/ml。混合均匀后，再添加18ng/ml的低分子肝素钠、20μl的200000单位/ml的青霉素、20μl的200000单位/ml的链霉素、和体积分数为2％的多糖，混合均匀。为进一步验证本发明提供的干细胞制剂治疗糖尿病的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。验证实验：实验动物分组和模型构建:12只健康秘猴，由昆明医学生物研究所动物中心提供，雌雄各半，年龄5-8岁，体重6-10kg，饲养在不锈钢丝笼中。适应性喂养2w后，经fbg、血脂、胰岛素、c-肽检测未见异常。本实验釆用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素(stz)诱导猴模型，成模标准：空腹血糖(fastingbloodglucose,fbg)，11.1mmol/l，持续4w(4周)，本发明干细胞制剂组和单纯的胰岛细胞制剂组(每组随机分配6只猴)分别于静脉注射本发明干细胞制剂和单纯的胰岛细胞制剂3ml，(注射方法：实验猴用3％戊巴比妥钠iml/kg静脉麻醉，手术野备皮，仰卧位固定于手术台上，常规碘伏消毒，铺巾，沿腹中线靠近胰尾上方行纵行切口，逐层切开，切口约5-7cm，找到胰腺及胰尾背部部胰尾动脉，用血管钳轻轻剥离胰尾动脉，游离一段长约2cm胰尾动脉，用动脉夹夹闭血管两端,将1ml注射器针头套于5ml注射器上，将制剂注入胰腺动脉，输入的同时松开远心端的动脉夹，输注完毕后压迫动脉3-5min止血，松开压迫后确定没有出血、渗血后，逐层缝合肌肉、皮肤，手术中保护好胰腺及周围组织。术后3d肌注青霉素及碘伏冲洗切口,防止伤口感染。)连续4周，每周注射一次，从第5周开始测量空腹血糖的测定(fastingbloodglucose，fbg)周数本发明干细胞制剂组单纯的胰岛细胞制剂第五周21.5±4.0mmol/l21.5±4.0mmol/l第六周14.3±2.7mmol/l18.2±3.6mmol/l第七周8.1±1.9mmol/l15.7±2.8mmol/l第八周4.2±1.0mmol/l12.9±2.2mmol/l实验结果显示，本发明干细胞制剂组治疗的实验猴空腹血糖逐渐下降，至第八周，恢复至正常血糖，而单纯胰岛细胞组，实验猴血糖下降慢，至治疗后第八周，仍未恢复至正常血糖，说明本发明制成混合的干细胞制剂治疗糖尿病的疗效非常好。以上仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12