一种具有抗菌功效的黑磷纳米材料及其制备方法与流程

本发明涉及改性纳米材料领域，尤其涉及一种氨基配体修饰的黑磷纳米材料及其制备方法和其在抗菌领域的应用。

背景技术：

作为一类新兴的超薄纳米材料，二维(2d)纳米材料由于其独特的结构特性以及理化性能，展现出了较高的生物相容性与广泛的生物医学应用潜能。二维纳米材料是目前已知最薄的纳米材料，低维度的纳米结构使它们具有超高的比表面积与生物反应活性，同时也具有宽广的光学响应波段。如今，二维纳米材料已被探索应用于多种生物医学领域。如药物的装载递送、体内靶标区域的造影成像、以及癌症的诊断、光热治疗等。

目前对二维纳米材料的抗菌功效研究仍处于起步阶段，许多的二维纳米材料如石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、氮化硼、二硫化钼等都展现出一定的抑菌功效，但都面临不易降解、具有潜在毒副作用等问题。市场对研发高抗菌性能的新型二维纳米材料制备技术仍有迫切的需求。

磷元素广泛存在于动植物组织中，是人体含量较多的元素之一。磷存在于人体所有的细胞中，几乎参与了所有维持生理所需的相关代谢过程，磷元素还是组成人体骨骼和牙齿的必需元素，其含量约为人体重的1％。而黑磷作为二维材料家族的一员新成员，其独特的元素特性与生物功能使其具有可降解、高生物相容性的特征。黑磷在体内的代谢产物是无毒的磷酸盐、磷酸酯和水，可被人体代谢排出，具有优异的生物安全性。因此黑磷材料用于抗菌剂的研发具有天然优势。通常，黑磷是由红磷在很高压强和较高温度下转化而成，在磷的同素异形体中反应活性最弱，在空气中不会点燃。通过超声黑磷块体剥离出的二维黑磷材料具有类似石墨烯的片层结构。由于这种超薄的低维结构在使用环境中容易和氧气与水反应而被氧化，因此对黑磷的医学应用造成了严重的影响。目前，通过对黑磷表面进行使用重氮苯衍生物化学修饰的方法[ryderc.r.etal.nat.chem.2016,8(6):597-602]以及掺杂碲[yangb.etal.adv.mater.2016,28(42):9408-9415]减缓黑磷在环境中氧化降解的方法能大幅提高黑磷的稳定性能。专利cn106366121a公开了一种经钛配体修饰的黑磷及其制备方法与应用，所述经钛配体修饰的黑磷为黑磷与钛配体的配合物，在不改变黑磷的固有属性的情况下，不易被氧化，抗氧化能力大大增强。但目前尚未有关抗菌功效的黑磷制备方法见诸发表。

黑磷的二维纳米片层边缘结构使其可能具备与二维石墨烯纳米材料相类似的“纳米刀”效应[zoux.etal.j.am.chem.soc.2016,138(7):2064-2077]，可穿刺细菌的外周壁膜，通过破坏细菌的膜结构致使细菌死亡。由于纳米二维片层黑磷在其缺陷部位和边缘部位可吸附一定量的氧气，这些吸附氧在二维材料与细菌接触时能够与细菌内部的谷胱甘肽等还原酶发生反应，诱导胞内蛋白失活。同时这些吸附氧也可诱发脂质过氧反应、线粒体功能障碍等过氧化应激损伤，从而干扰细菌的基本代谢并破坏其基本细胞功能，最终通过氧化应激损伤作用造成细菌的死亡。

抗菌黑磷材料在制备和使用过程中特别容易出现以下问题：

①修饰工艺复杂、产率低，难以实现大规模生产；

②使用的修饰剂成本高、修饰效果不理想、生物相容性差；

③修饰技术不具备提升黑磷纳米材料的抗菌功效。

磺胺是应用最早的一类化学合成抗菌药，在治疗感染性疾病中起着重要作用，目前广泛用于预防和治疗人类和其他动物的细菌感染，具有抗菌谱广、疗效确切、性质稳定、价格便宜等优点。磺胺类药物的抗菌机理为在细菌二氢叶酸的生物合成中和对氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid,paba)竞争性地与酶结合，影响核酸前体物的合成，从而抑制细菌生长和繁殖。目前对于磺胺类化合物的研究十分活跃，通常对母体结构进行化学结构修饰，主要包括磺酰胺基结构修饰和苯氨基结构修饰。磺胺类化合物的金属配合物及其抗菌活性研究相对较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种氨基配体修饰纳米材料的制备方法以提升其抗菌功效，并进一步研究其在抗菌医用领域应用的功效。

具体而言，本发明使用氨基配体修饰的方法将磺胺类基团中具有抗菌功效的氨基引入黑磷纳米材料或所述材料的量子点表面，赋予其抗菌谱广、杀菌效率高、不易产生耐药性的抗菌性能。

因此，本发明的目的之一在于提供一种氨基配体表面修饰的黑磷纳米材料，提高其稳定性，并将具有抗菌功效的磺胺类基团引入到纳米材料表面。

在此，所述方法包括：设计一种新型的氨基配体并运用此氨基配体修饰黑磷纳米材料，形成氨基配体与黑磷纳米材料的配合物。

本发明中，所述氨基配体具有式(i)所示结构

其中，r选自苯基，所述苯基任选进一步被0-4个羟基、硝基、氨基、醛基、酰基、烷氧基、烷基、卤素原子取代；

m表示金属离子；

x表示配位数；优选表示1-6的自然数；更优选表示1、2、4或6。

所述黑磷纳米材料选自二维黑磷或黑磷的量子点。

优选地，所述氨基配体中的r选自被1-2个羟基、硝基、氨基、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素取代的苯基。

优选地，所述m选自ti(iv)、cu(ii)、ni(ii)、zn(ii)、co(ii)和ag(i)中的一种或多种。

作为另一种方案，所述二维纳米材料的表面被多种式(i)所示的氨基配体修饰。

根据本发明的配合物，其中，所述“烷基”是指含1-30个碳原子的烷基；优选低级烷基，即c1-6烷基，包括甲基、乙基、丙级、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、己基、异己基，叔己基，季己基。

所述“烷氧基”是指ro-基团，其中r表示烷基，且具有如上所述的定义。

所述“酰基”是指基团，其中r表示烷基，且具有如上所述的定义。

在本发明所述经氨基配体修饰的黑磷纳米材料中，所述黑磷包括厚度为10～50nm多层黑磷纳米片和黑磷量子点中的一种或多种。

本发明的另一目的在于提供一种氨基配体表面修饰的纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

1)将对氨基苯磺酸及其相应衍生物与含金属离子的溶液进行配位来制备得到氨基配体；

2)将纳米材料分散于有机溶剂中；

3)将所述氨基配体溶解于有机溶剂中，加热反应，得到所述经氨基配体修饰的黑磷。

优选地，所述加热反应在惰性气体保护下避光进行。

优选地，所述反应温度为40-70℃，反应时间为12-24h。

优选地，氨基配体的浓度为50-100μg/ml。

优选地，氨基配体与黑磷的投料摩尔比为1：1～20：1；更优选4：1～15：1。

优选地，所述有机溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、正丁醇、乙腈、乙醚、甲苯中的一种或多种。

本发明的另一目的涉及如上所述的氨基配体表面修饰的黑磷纳米材料在抗菌领域的应用。

细菌实验结果表明，本发明所制备的二维黑磷纳米制剂抗菌效果明显，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长都具有明显的抑制作用。

综上所述，本发明提供了一种具有抗菌功效的氨基配体修饰的黑磷及其制备方法和应用。其制备方法具有生产工艺操作简易、产率高、重现性好，易实现规模化生产。本发明所使用的制备方法修饰后的黑磷纳米材料，对革兰式阴性菌、革兰式阳性菌具有优异的抗菌功效，极大提升了黑磷纳米材料在医用抗菌领域的应用潜能。

并且，本发明的表面修饰的纳米材料及其制备方法具备以下优点：

①本发明所使用的修饰方法能提升黑磷纳米材料的抗菌功效。

②与大部分黑磷二维纳米材料表面修饰技术相比，本发明方法生产工艺操作简易、产率高、重现性好，易实现规模化生产。

③本发明所使用的制备方法能有效地将氨基配体修饰到纳米材料表面，实验结果表明，所制备的纳米材料样品表面检测到大量的氨基配体。

④本发明可将氨基配体具有抗菌功效的氨基引入纳米材料表面，赋予纳米材料其他制备方法所不具有的抗菌谱广、杀菌效率高、不易产生耐药性的抗菌性能。

另一方面，根据本发明的方法还可根据不同的材料表面特性进行修饰处理，同时，磺酸酯上所连接功能基团也可进行更换，以及还可进一步通过修饰其它功能基团达到赋予材料不同的理化性质与应用潜能的目的。

本发明使用氨基配体修饰纳米材料的制备技术具有生产工艺操作简易、产率高、重现性好，可实现低成本大规模生产，并对环境不产生二次污染的特点。并且本发明技术使用的氨基配体也可自行合成，合成的成本仅为100-150元/g。修饰后黑磷材料能明显地抑制大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)的生长，具有优异的抗菌功效。因此，在抗菌领域应用潜力巨大。

附图说明

图1氨基配体表面修饰黑磷材料核磁检测谱图。

图2黑磷及氨基配体修饰黑磷的透射电镜图。

图3氨基配体修饰黑磷材料抗菌功效检测图：(a)细菌菌落计数拍照图，(b)抑菌效率图。

具体实施方式

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

黑磷(bp)纳米片的制备

取25mg黑磷晶体，边研磨边加入nmp溶液至25ml，探头超声10h，400w低温水浴超声10h后将样品2000rpm离心10min后取上清分散液，制得二维黑磷纳米片。

实施例2

本实施例中使用式ii结构的氨基配体

将12mg氨基配体溶于1ml的二氯甲烷中，在氩气保护和避光条件下，将其加入到1ml具有50μg黑磷纳米片的二氯甲烷分散液中，在50℃氮气保护下避光加热回流反应15h，随后以7000～10000转的转速离心10～20分钟，除去上清液，固体重新分散于超纯水中，得氨基配体修饰黑磷的材料，其¹h-nmr(d2o)检测如图1所示。后续实施例均用此氨基配体修饰黑磷材料。

实施例3

从图1可以看出，氨基配体的核磁信号在黑磷材料上均有，说明氨基磺酸酯成功配位到黑磷表面。

实施例4

以透射电镜对黑磷纳米片和氨基配体修饰的黑磷纳米片的形貌进行了研究，该晶体结构研究是将20μl样品的乙醇溶液滴在碳支持膜膜上，待其自然风干后以透射电子显微镜对样品形貌进行观察，发现氨基配体修饰前后，黑磷的片状结构仍然保留。其透射电镜图如图2所示。

实施例5

本发明的氨基配体修饰黑磷材料技术能赋予黑磷材料优异的抗菌性能具体的抗菌功效检验实施过程为：

(1)mueller-hinton(mh)肉汤配制：称取牛肉膏10g，蛋白胨10g，琼脂15g，nacl5g，双蒸水1000ml，ph：7.4，121℃灭菌20min。

(2)菌种活化：无菌条件下，以移液器吸取10μl菌种于10mlmh肉汤培养基中，密封并轻轻摇匀，置于37℃摇床200r/min培养12-16h。

(3)菌悬液的稀释：吸取活化后菌悬液10μl加于5ml无菌生理盐水中，每10倍稀释一次，取(10^-1、10-²、10^-3、10^-4)浓度稀释液100μl做涂布实验，调整菌悬液浓度：含菌体数为10⁵-10⁶cfu/ml。

(4)牛肉膏蛋白胨固体培养基(lb培养基)的配制方法：称取牛肉膏10g，蛋白胨10g，琼脂15g，nacl5g，双蒸水1000ml，ph：7.2-7.5，121℃灭菌20min。

(5)将灭菌后的牛肉膏蛋白胨固体培养基冷却至50℃后，每20ml培养基倒入无菌培养皿中。待培养冷却凝固后，将100μl黑磷制剂、氨基配体修饰黑磷分别与100μl活化的菌悬液共混后均匀涂布于培养皿表面，每个样品平行重复5次。并对应设立空白对照组、阳性对照组、阴性对照组。

(6)黑磷制剂与菌液均匀涂布于培养皿后，将培养皿置于细菌培养箱中37℃恒温恒湿培养24h，统计菌落个数，并按照如下计算公式统计抑菌效率：

抑菌率＝(对照组菌落数-处理组菌落数)/对照组菌落数×100％

优选地，抑菌实验中选用大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)等。

本发明所制备的二维黑磷纳米制剂抗菌效果明显，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长都具有明显的抑制作用(见图3)。在生理盐水的作用体系中，氨基配体修饰的黑磷材料的抗菌效果明显优于修饰前黑磷的抗菌效果，其对大肠杆菌的抗菌率高达99.10％，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为95.20％，未经氨基配体修饰的黑磷材料的抗菌效率则分别为15.93％与41.09％。。

根据本发明的抗菌实验中，优选的菌悬液含菌体数为10⁵-10⁶cfu/ml。过低的菌体浓度无法观察到抑菌效果，过高的菌体浓度不利于菌落计数。

相比普通的抑菌制剂。由于二维黑磷纳米抗菌制剂可代谢、生物安全性高。因此更适合应用于日常生活所需的抗菌生活用品的生产。同时也可应用于卫生医疗所需的抑菌器材、抗耐药菌制剂的研发。

本发明已经实验证实，氨基配体的核磁信号能在本发明方法制备的二维黑磷纳米材料上表面上检测到，说明磺酸酯已成功配位到黑磷表面；抗菌性能检测结果表明本发明所制备的二维黑磷纳米制剂抗菌效果明显，对革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的生长都具有明显的抑制作用。在生理盐水的作用体系中，50μg/ml氨基配体修饰的黑磷材料的抗菌效果明显优于修饰前黑磷的抗菌效果，其对大肠杆菌的抗菌率高达99.10％。这些实验数据表明氨基配体修饰黑磷纳米材料的制备技术成功有效，并且这种新型的制备技术能有效提升黑磷纳米材料的抗菌应用性能，具有广泛的应用潜力。