本发明属于生物医药领域，具体涉及一种主动靶向肿瘤的长循环纳米载药体系的制备方法。
背景技术：
顺铂是临床上最常用的抗肿瘤药之一，具有抗癌作用强、抗癌活性高、可与多种抗肿瘤药物配伍产生协同作用且无交叉耐药等特点，是化疗中不可缺少的药物。顺铂在临床上多以注射剂使用，但其在体内很快与蛋白质结合而失效，且容易被体内所有快代谢细胞同等摄取、经肾排泄，产生了剂量限制性毒性。因此，寻求一种方法来增加顺铂的体内循环时间、降低药物对正常细胞的毒性成为关键。为此，纳米载体应运而生。纳米载体不仅具有能穿过组织间隙、进入细胞、通过人体最小的毛细血管，甚至具有能通过血脑屏障的特性，还具有靶向、缓释、高效、低毒，可以实现口服、静脉注射及敷贴等多种给药途径等诸多优点。其中，靶向性纳米载体是一类由天然高分子物质或合成高分子材料制成的粒径为纳米级的载体，其表面经过生物修饰或理化修饰后具有靶向作用。靶向性纳米载体又分为被动靶向和主动靶向。被动靶向性纳米载体主要指通过利用载体的亲/疏水性、静电作用、载体的大小、质量、ph值等理化因素增加载药载体与靶器官接触，减少与非靶器官接触，从而增加靶部位与非靶向部位药物的比率。常用的被动靶向载体有聚乙二醇、多糖等修饰的纳米颗粒。主动靶向性纳米载体是指由单克隆抗体、磁趋向、受体介导的靶向制剂，由于它对靶器官具有高度的选择性和特异性而具有很好的发展前景。如磁性纳米载体、叶酸介导纳米载体、透明质酸纳米颗粒等。
透明质酸（ha）是存在于细胞外基质和滑液中的天然多糖。由于其良好的生物相容性和生物降解性，ha已被广泛用于生物医学，如组织工程，药物递送和分子成像。研究发现，ha可以特异性地与表面过表达cd44的各种癌细胞结合，因此，ha被作抗肿瘤药物的靶向载体而广泛研究。但是，ha纳米颗粒在全身给药后存在一个缺点，那就是，纳米颗粒进入血液循环后，浓度被大大稀释，极易被运输至肝脏、肾脏处代谢，只有极少量的纳米颗粒保留在血液中。为解决此问题，可在纳米颗粒表面修饰聚乙二醇及其衍生物，因为聚乙二醇能防止与血液接触时血小板在材料表面的沉积，有效延长纳米颗粒在体内的半衰期，从而达到血液长循环的效果。因此，将聚乙二醇衍生物接枝到透明质酸衍生物上，用作顺铂的药物载体，不仅可大大延长顺铂在体内的血液循环时间，还可主动靶向cd44等受体富集的肿瘤部位，增强顺铂的治疗效果，降低药物对正常组织的毒副作用。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种主动靶向肿瘤的长循环纳米载药体系的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
mpeg-g-a-ha的制备：室温下将醛基化透明质酸（a-ha）溶于双蒸水，向该溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），避光反应4h后，加入单甲氧基聚乙二醇胺（mpeg-nh2）继续反应8h后将溶液转移至透析袋（mwco3500），在室温条件下透析3d，每隔8h换一次水，随后在-80℃冷冻干燥3d，得到醛基化透明质酸（mpeg-g-a-ha）。其中，a-ha与edc、nhs的摩尔比为1:1.2:1.2，a-ha与mpeg-nh2的质量比为1:1.25。
mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系的制备：将顺铂cddp和mpeg-g-a-ha分别配成2mg/ml的10mg/ml水溶液。在37℃超声作用下，将上述cddp溶液逐滴滴加到mpeg-g-a-ha溶液中，然后室温搅拌2d。然后，将所得溶液置于透析袋（mwco2000）中透析6h除去未反应的cddp，冷冻干燥3d，即得干燥的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系，其中，mpeg-g-a-ha和cddp的质量比为：1:0.05-0.30。通过调控投料比，可控制纳米粒子粒径范围在183.2-218.7nm之间。
本发明的显著优点在于：本发明所制备的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系，cddp与聚合物是通过亚胺键和配位键连接负载至纳米体系中，负载方式稳定，且纳米粒对cddp的释放具有缓释性和ph敏感性，可在微酸肿瘤部位加快药物释放。此外，纳米体系表面修饰有peg可以大大提高纳米粒在血液中的循环时间，血液长循环有利于cddp纳米微粒通过渗透增强和滞留效应提高肿瘤部位的药物聚积，实现被动靶向性运输，同时，纳米体系含有a-ha，能进一步主动靶向cd44过表达的肿瘤部位，实现主动靶向性聚集。因此，mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系可有效减少药物在正常组织的聚集，大大延长药物在血液中的循环时间，使药物大多数聚集于肿瘤部位，达到药物在肿瘤治疗中高效减毒的目的。
附图说明
图1是mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系的扫描电镜图（mpeg-g-a-ha与cddp的质量比为1:0.2）。
图2是mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系在不同ph下的药物释放图（mpeg-g-a-ha与cddp的质量比为1:0.2）。
图3是cddp、mpeg-g-a-ha-cddp在不同ph下的bsa吸附图（mpeg-g-a-ha与cddp的质量比为1:0.2）。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
1）称取1.000ga-ha，溶于100ml双蒸水中，磁力搅拌至完全溶解；
2）称取0.605gedc和0.363gnhs分别加入步骤1）所得溶液中避光反应4h；
3）称取1.250gmpeg-nh2加入步骤2）所得溶液中反应8h；
4）将步骤3）得到的溶液置于透析袋（mwco3500）中透析3d，期间每隔8h换一次水；
5）将步骤4）透析后得到的溶液真空冷冻干燥3d得到mpeg-g-a-ha；
6）称取1.000gmpeg-g-a-ha，于37℃溶于双蒸水中，配成10mg/ml的溶液；
7）称取50mgcddp，于37℃溶于双蒸水中，配成2mg/ml的溶液；
8）超声作用下将步骤7）得到的cddp溶液逐滴滴加至步骤6）得到的mpeg-g-a-ha溶液，然后转移至磁力搅拌器，室温搅拌2d；
9）将步骤8）所得溶液于透析袋（mwco2000）中避光透析6h后,于-80℃冷冻干燥3d，得到干燥的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系。
实施例2
1）称取1.000ga-ha，溶于100ml双蒸水中，磁力搅拌至完全溶解；
2）称取0.605gedc和0.363gnhs分别加入步骤1）所得溶液中避光反应4h；
3）称取1.250gmpeg-nh2加入步骤2）所得溶液中反应8h；
4）将步骤3）得到的溶液置于透析袋（mwco3500）中透析3d，期间每隔8h换一次水；
5）将步骤4）透析后得到的溶液真空冷冻干燥3d得到mpeg-g-a-ha；
6）称取1.000gmpeg-g-a-ha，于37℃溶于双蒸水中，配成10mg/ml的溶液；
7）称取100mgcddp，于37℃溶于双蒸水中，配成2mg/ml的溶液；
8）超声作用下将步骤7）得到的cddp溶液逐滴滴加至步骤6）得到的mpeg-g-a-ha溶液，然后转移至磁力搅拌器，室温搅拌2d；
9）将步骤8）所得溶液于透析袋（mwco2000）中避光透析6h后,于-80℃冷冻干燥3d，得到干燥的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系。
实施例3
1）称取1.000ga-ha，溶于100ml双蒸水中，磁力搅拌至完全溶解；
2）称取0.605gedc和0.363gnhs分别加入步骤1）所得溶液中避光反应4h；
3）称取1.250gmpeg-nh2加入步骤2）所得溶液中反应8h；
4）将步骤3）得到的溶液置于透析袋（mwco3500）中透析3d，期间每隔8h换一次水；
5）将步骤4）透析后得到的溶液真空冷冻干燥3d得到mpeg-g-a-ha；
6）称取1.000gmpeg-g-a-ha，于37℃溶于双蒸水中，配成10mg/ml的溶液；
7）称取200mgcddp，于37℃溶于双蒸水中，配成2mg/ml的溶液；
8）超声作用下将步骤7）得到的cddp溶液逐滴滴加至步骤6）得到的mpeg-g-a-ha溶液，然后转移至磁力搅拌器，室温搅拌2d；
9）将步骤8）所得溶液于透析袋（mwco2000）中避光透析6h后,于-80℃冷冻干燥3d，得到干燥的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系。
实施例4
1）称取1.000ga-ha，溶于100ml双蒸水中，磁力搅拌至完全溶解；
2）称取0.605gedc和0.363gnhs分别加入步骤1）所得溶液中避光反应4h；
3）称取1.250gmpeg-nh2加入步骤2）所得溶液中反应8h；
4）将步骤3）得到的溶液置于透析袋（mwco3500）中透析3d，期间每隔8h换一次水；
5）将步骤4）透析后得到的溶液真空冷冻干燥3d得到mpeg-g-a-ha；
6）称取1.000gmpeg-g-a-ha，于37℃溶于双蒸水中，配成10mg/ml的溶液；
7）称取300mgcddp，于37℃溶于双蒸水中，配成2mg/ml的溶液；
8）超声作用下将步骤7）得到的cddp溶液逐滴滴加至步骤6）得到的mpeg-g-a-ha溶液，然后转移至磁力搅拌器，室温搅拌2d；
9）将步骤8）所得溶液于透析袋（mwco2000）中避光透析6h后,于-80℃冷冻干燥3d，得到干燥的mpeg-g-a-ha-cddp纳米载药体系。
图1为实施例3所制备的纳米粒的扫描电镜图，由图1可知，所得纳米粒粒径较为均匀，且粒径大小200nm左右，其不仅有利于药物包载，还有利于纳米粒进入肿瘤细胞。
图2为实施例3所制备的纳米粒在不同ph下的释放曲线，由图2可见，所得纳米粒具有很好的缓释性能，其药物释放效果可达7d左右，不仅提高药物利用率还可以降低药物毒副作用，同时在ph=6.5时的释放速率远大于在中性环境，这更好地表明所制得纳米粒对cddp的释放具有缓释性和ph敏感性，可在微酸肿瘤部位加快药物释放。
图3为实施例3所制备的纳米粒在不同ph下的蛋白吸附量，来模拟纳米粒在血液循环中的吸附情况。由图3可见纳米粒在中性环境中吸附蛋白量较少而在酸性条件下吸附蛋白较多，这更好地说明纳米粒在血液中的循环时间比顺铂长，说明表面接有mpeg可在一定程度上延长其在血液中的循环时间，从而使到达肿瘤部位的纳米粒增多，达到更好地治疗效果。
以上所述仅为本发明的制备方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。