本发明属于医药技术领域，涉及一种生物粘附性复方肺吸纳米复合微粒及其制备方法，还涉及该复合微粒在制备治疗哮喘和慢性阻塞性肺病中的应用。
背景技术
肺部吸入给药是治疗肺部疾病最理想的途径。药物经吸入后可直接沉积于病灶部位，能迅速起效，易达到较高的肺局部药物浓度。与静脉注射、口服等系统性给药方式相比，肺部吸入还能减少甚至避免对其它非药物作用部位的毒副作用。哮喘和慢性阻塞性肺病的临床治疗也优选肺吸途径给药，多联合使用糖皮质激素和β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂来协同作用(两联或三联复方制剂)，在扩张支气管的同时消除气道内炎症。
目前，临床使用的肺部吸入制剂包括气雾剂、粉雾剂(干粉吸入剂)和水雾剂三种。其中，干粉吸入剂是一种较新型的呼吸道给药剂型。其优点在于：1.可借助使用者的吸气来递送药物，有利于提高正确使用吸入产品的概率；2.固体干粉状态的粉雾剂具有药物稳定性高、对环境无污染，不含刺激黏膜的防腐剂等优点。干粉吸入剂的常规工艺流程包括原料药的粉碎、混合、灌装等。由于给药剂量微小，组成复方的各个活性药物在剂量、理化性质方面差异又非常巨大，采用常规工艺来制备肺吸的干粉粉雾剂时会面临混合不均匀的难题，因而增加了工艺的难度、复杂性和生产的成本。另外，常规的经粉碎得到的微粉流动性差，需要借助乳糖这样的大颗粒载体才能在吸入过程中很好地分散，药物的肺部沉积率较低。此外，由于肺部粘液的量非常有限，难溶性的糖皮质激素类药物在肺部溶解非常缓慢，与水溶性较强的β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂类药物组成复方后很难达到同步释放，阻碍他们更好地发挥协同作用。再加上肺部存在很多固有的清除机制，如粘液纤毛清除，巨噬细胞吞噬、代谢、吸收入血等，这些清除机制将经肺吸入并沉积在肺部的药物颗粒从肺部清除，缩短了药物在肺部的滞留时间，降低局部药物浓度。
目前与粉雾剂相关的研究工作主要集中在通过改善干粉颗粒的粉体学性质如颗粒的尺寸、形态、粗糙度、药物颗粒与载体之间的相互作用力等来提高颗粒在肺部的沉积率，而基于生物粘附性高分子材料的肺吸缓控释制剂的研究却非常少。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种能够有效解决剂量、理化性质差异较大的药物组成的复方肺吸粉雾制剂药物溶出速度不一致、混合工艺难度大以及制剂在肺部沉积率低，滞留时间短、药物消除快等问题的生物粘附性复方肺吸纳米复合微粒粉雾剂。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明所述的生物粘附性肺吸纳米复合微粒包括活性药物和生物粘附性材料。
所述活性药物由水溶性药物和难溶性药物纳米晶组成；包含2-3种抗哮喘和慢肺阻的药物，其中至少含有一种难溶性的糖皮质激素类药以及一种或两种水溶性β-受体激动剂和/或m-受体拮抗剂。
具体地，所述的活性药物由水溶性β-受体激动剂和/或m-受体拮抗剂和难溶性糖皮质激素类药物纳米晶组成。
所述的β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂为支气管扩张剂，包括沙丁胺醇、丙酸倍氯米松、硫酸特布他林、茚达特罗、福莫特罗、异丙托溴胺、沙美特罗、塞托溴铵、维兰特罗、丙卡特罗、班布特罗、克仑特罗、菲诺特罗、左布特罗中的一种或多种的组合。
所述的糖皮质激素类药物选自：布地奈德、丙酸氟替卡松、糠酸氟替卡松，丙酸倍氯米松、去氢可的松、氢化可的松、泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼松龙中的一种或多种混合。
所述的水溶性β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂占药物总量的1％-50％，而难溶性糖皮质激素纳米晶占药物总量的50-99％，二者的总和占复合微粒总重量的10～83％(g/g)；
优选地，水溶性β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂占药物总量的2.7％-50％，难溶性糖皮质激素纳米晶体占药物总重量的50-97.3％，二者的总和占复合微粒总重的16.8-60.7％。
所述难溶性糖皮质激素类药物纳米晶的粒径在50-1000nm范围内，更优选地，粒径为100～400nm。
所述的生物粘附性材料选自：透明质酸、纤维素、树胶、羟丙基纤维素、壳聚糖、葡聚糖及其衍生物中的一种或多种混合物；
生物粘附性材料占微粒总重量的17～90％(g/g)。
进一步地，生物粘附性材料占微粒总重量的39.3-83.2％。
所述的生物粘附性材料优选为：透明质酸、壳聚糖或二者的混合物。
当生物粘附性材料为透明质酸与壳聚糖的混合物时，透明质酸与壳聚糖的比例为6:1～1:2。在此条件下，制备的复合微粒具有较强的肺部粘膜粘附性、能很好地阻滞水溶性药物的快速释放，且具有较优的空气动力学性质，可获得较高的肺部药物沉积率。
水溶性药物与难溶性药物纳米晶的重量比为1:2～1:36。
水溶性药物与生物粘附性材料的重量比为：1:0.6～1:329。
进一步地，水溶性药物与生物粘附性材料的重量比为1:2～1:181。
难溶性药物纳米晶与生物粘附性材料的重量比为：1:0.3～1:9。
进一步地，难溶性药物纳米晶与生物粘附性材料的重量比为1:1～1:5。
当水溶性药物为短效β-受体激动剂时，则与生物粘附性材料的重量比为1:2～1:15；
当水溶性药物为长效β-受体激动剂福莫特罗时，则与生物粘附性材料的重量比为1:146～1:181；
当水溶性药物为其它长效β-受体激动剂，如沙美特罗，维兰特罗时，其与生物粘附性材料的重量比为1:20～1:54；
当水溶性药物为m受体拮抗剂时，其与生物粘附性材料的比例为1:18-1:49。
所述的短效β-受体激动剂选自：硫酸沙丁胺醇或硫酸特布他林；
所述的长效β-受体激动剂选自：福莫特罗；
所述的其它长效β-受体激动剂选自：沙美特罗、维兰特罗、茚达特罗、沙美特罗、维兰特罗、丙卡特罗、班布特罗、克仑特罗、菲诺特罗、左布特罗中的一种；
所述的m受体拮抗剂选自：异丙托溴铵、塞托溴铵。
本发明的生物粘附性复方肺吸纳米复合微粒为通过喷雾干燥技术形成同时包裹药物分子和药物纳米晶体的可吸入生物粘附微球干粉。通过如下方法制备：
首先，将生物粘附剂均匀分散于适宜溶媒中，搅拌使其溶解，然后加入水溶性的β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂成分，使其充分溶解，再将难溶性糖皮质激素类药物的纳米晶均匀分散于生物粘附剂的溶液中，最后通过喷雾干燥技术制得具有枣糕镶嵌模型结构特征、适合于肺吸的生物粘附复合微粒。
具体地，
1)将一定量的生物粘附剂干粉加入适量溶媒中，室温下搅拌至充分溶解或溶胀，配制成浓度为0.1-3.0％(g/v)的溶液；
2)将水溶性的活性药物，即β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂成分加至上述生物粘附剂溶液中，充分搅拌，使其充分溶解。其中，水溶性活性药物总量与生物粘附性材料的重量比为1:2～1:181范围。具体地，根据所选的水溶性药物的种类不同而不同。
3)将事先制备好的难溶性糖皮质激素类药物纳米晶(即糖皮质激素类药物的纳米混悬液)定量，加至上述生物粘附剂溶液中，充分搅拌，使其均匀分散。其中难溶性糖皮质激素纳米晶体与生物粘附性材料的重量比为1:1～1:5。
4)将水溶性β-受体激动剂和/或m受体拮抗剂，难溶性糖皮质激素类药物的纳米晶体与生物粘附剂的混合体系通过喷雾干燥制得纳米复合微粒。
步骤1)中所述的溶媒选自：水、醋酸水溶液、乙醇、丙酮及它们的混合物。
步骤3)中所述的难溶性糖皮质激素类药物纳米晶通过现有技术中常用的方法，如：介质研磨法、高压均质法、纳米沉淀法、乳化法、超临界流体技术等获得。其中优选介质研磨法，通过如下方法制备：将难溶性药物粉末分散于0.1-0.4％的f68水溶液中，加入球磨罐中，再加入100g直径为0.5mm的球磨珠，盖好球磨罐，固定于球磨机中，开始研磨，研磨时间5-10min，间歇时间2-3min，总共研磨时间在30-240min，得难溶性糖皮质激素类药物的纳米混悬液。
药物纳米晶的粒径范围在50～1000nm范围内，纳米晶的粒径大小直接影响难溶性药物的溶出速率，从而影响其体内吸收速率。根据所选难溶性糖皮质激素的溶解度，纳米晶粒径优选为100～400nm。当纳米晶的粒度范围在优选的100～400nm范围内，且纳米晶与生物粘附剂的重量比为1:0.31～1:9.25时，粘附在肺粘膜上的微粒经缓冲液冲洗1小时后仍有近30％的微粒粘附于粘膜表面，而当纳米晶与生物粘附剂的重量比为1:0.97～1:5.09时，粘附在肺粘膜上的微粒经缓冲液冲洗1小时后有超过40％的微粒粘附于粘膜表面，可有效提高药物肺局部滞留时间，且能有效提高难溶性药物的释放和阻止水溶性成分的释放，进而达到同步释放。
本发明结合纳米技术、生物粘附微粒技术和颗粒工程技术，首先将难溶性药物通过制纳米技术速释化，然后与水溶性药物一起在溶媒中混合均匀，通过颗粒工程技术将几种性质各异、剂量相差巨大的药物镶嵌在粘附材料，形成具有生物粘附性的可吸入纳米复合微粒。通过优化喷雾干燥工艺参数，获得较高的药物肺部沉积率，简化工艺，降低成本，提高制剂质量；通过调整纳米晶的粒度，粘附材料的种类，各个处方成分之间的配比，在提高难溶性药物溶出速率的基础上，实现同步吸收、更好发挥协同作用，同时延长药物在肺部的滞留时间，提高药物局部药物浓度和持续时间，从而提高药物治疗指数。
本发明可以1.调控药物的释放速度，从而实现不同理化性质的药物的同步释放，更好发挥协同作用；2.有效对抗肺部粘液纤毛清除作用，延长肺部滞留时间，提高治疗指数；3.微粒具有较好的流动性，易分散，空气动力学粒径适中，无需载体，可获得较高的肺部沉积率。即一个复合微粒解决多种问题，最终实现提高药物局部药效，减少全身药物暴露量，降低毒副作用，提高治疗效力的目的。
本发明的纳米复合微粒的空气动力学粒径为0.5～10μm,优选为1～5μm，具有良好的流动性、分散性，适合肺部吸入途径给药，其中细粒子分数(fineparticlefraction)达30％以上，远高于药典中粉雾剂质量标准项下对fpf的要求(即10％)。且本发明制备工艺步骤少，且有效地解决了组分比例悬殊较大的复方制剂中低剂量组分均匀度差的难题，提高了药品质量、简化了工艺过程。另外，本发明中的纳米复合微粒在将难溶性药物糖皮质激素类药物速释化的基础上，通过粘附材料的控制使两类理化性质差异较大的药物以相当的速度释放，吸收，延长药物局部滞留时间，保证它们更好地发挥协同作用。
附图说明
图1是试验例1中肺黏膜粘附性评价装置示意图(a)以及评价过程中样品状态的照片(b)；
图2是实施例1中肺粘膜粘附性曲线；
图3是实施例1中复合微粒经大鼠支气管给药后两种药物的体内药物动力学曲线；
图4是实施例2中制备得到的复合微粒的扫描电镜照片；
图5是实施例2中肺粘膜粘附性曲线；
图6是实施例3中肺粘膜粘附性曲线；
图7是实施例4中肺粘膜粘附性曲线；
图8是实施例4中两种药物在体外的释放曲线；
图9是实施例5中肺粘膜粘附性曲线；
图10是实施例5中复合微粒经大鼠支气管给药后两种药物的体内药物动力学曲线；
图11是实施例6中肺粘膜粘附性曲线；
图12是试验例3，4中大鼠气管给药操作图。
具体实施方式
实施例1：包含硫酸沙丁胺醇(salbutamolsulfate，sas)和布地奈德(budesodine，bud)纳米晶体的生物粘附性复方肺吸纳米复合微粒(sas-bud-ha/ms)的制备
称取透明质酸0.5g，加入100ml重蒸馏水，磁力搅拌至充分溶胀、溶解，依次加入沙丁胺醇250mg以及含100mg粒径为200±2nm的布地奈德纳米晶的混悬液2ml，继续搅拌使药物分散均匀，进行喷雾干燥。作为对照，将硫酸沙丁胺醇和布地奈德的原料药按比例加入重蒸水中(8％，w/v)，分散均匀，进行喷雾干燥。喷雾干燥的条件为：进口温度160℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力414l/h，进液速度4.5ml/min，制备得到包含沙丁胺醇和布地奈德纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为4.9±2.3μm和33.7±0.6％。
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有近50％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图1，2)。
大鼠体内药物动力学实验结果(图3)表明透明质酸的骨架能有效调节水溶性的沙丁胺醇和水难溶性的布地奈德二者的释放，使其体内的药动学参数同步，具有相似的达峰时间(tmax)和相近的体内滞留时间。
实施例2：包含沙美特罗(salmeterol，st)和丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate，fp)纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒(st-fp-ha/ms)的制备
称取透明质酸1.5g，加入150ml重蒸水，磁力搅拌，使其充分溶胀、溶解，依次准确加入沙美特罗120mg以及含600mg平均粒径为200±10nm的丙酸氟替卡松的纳米晶混悬液50ml，继续搅拌，使两种药物在溶液中分散均匀，进行喷雾干燥。作为对照，将沙美特罗和丙酸氟替卡松的原料药按比例加入重蒸水中(10％，w/v)，分散均匀，进行喷雾干燥。喷干条件均为：喷干条件均为，进口温度120℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力414l/h，进液速度6.0ml/min，得包含沙美特罗和丙酸氟替卡松的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
复合微粒的外观经扫描电镜观察如附图4所示。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为。4.5±3.3μm和43.1±0.8％
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有近60％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图5)。
实施例3：包含维兰特罗(vilanterol，vt)和糠酸氟替卡松(fluticasonefuroate,ff)纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒(vt-ff-cs/ms)的制备
称取药用辅料壳聚糖1.0g，加入0.5％醋酸水溶液150ml搅拌至溶解，依次准确加入维兰特罗67mg和含533mg糠酸氟替卡松纳米晶混悬液50ml，搅拌均匀，进行喷雾干燥。作为对照，将维兰特罗和糠酸氟替卡松的原料药按1:8的比例分散于重蒸水中(5％，w/v)进行喷雾干燥。喷干条件均为：进口温度120℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力357l/h，进液速度4.5ml/min，得包含伊曲康唑纳米晶的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为4.3±2.3μm和39.4±0.8％。
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有近55％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图6)。
实施例4：包含塞托溴铵(tiotriopiumbromide,tb)和糠酸氟替卡松(fluticasonefuroate,ff)纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒(tb-ff-cs-ha/ms)的制备
称取药用辅料壳聚糖0.5g及透明质酸0.2g，加入0.5％醋酸水溶液100ml搅拌至溶解、溶胀，依次加入0.023g塞托溴铵和含0.257g糠酸氟替卡松纳米晶体的混悬液20ml，搅拌，混合均匀，进行喷雾干燥。作为对照，将塞托溴铵和糠酸氟替卡松原料药按9:100的比例加入重蒸水中(5％，w/v)，分散均匀，进行喷雾干燥，喷干条件为：进口温度120℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力357l/h，进液速度4.5ml/min，得包含塞托溴铵和糠酸氟替卡松纳米晶的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为5.6±1.7μm和38.1±0.8％。
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有59％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图7)。
体外的药物释放度考察结果显示(图8)塞托溴铵和氟替卡松的纳米晶能以几乎同步的速度从ha骨架中释放，实现两药的同步释放。
大鼠体内药物动力学实验结果(图9)表明透明质酸的骨架能有效调节水溶性的塞托溴铵和水难溶性的糠酸氟替卡松二者的释放，使其体内的药动学参数同步，具有相似的达峰时间(tmax)和相近的体内滞留时间。
实施例5：包含异丙托溴铵(ipratropiumbromide,ib)、福莫特罗(formoterol，ft)和糠酸氟替卡松(fluticasonefuroate,ff)纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒(ib-ft-ff-ha/ms)的制备
称取透明质酸1.0g，加入100ml重蒸水，磁力搅拌至充分溶胀、溶解，依次加入异丙托溴铵17.8mg、福莫特罗4mg以及含178.2mg的糠酸氟替卡松纳米晶体混悬液50ml，继续搅拌使分散均匀,进行喷雾干燥。作为对照，将异丙托溴铵、福莫特罗和糠酸氟替卡松原料药分散于重蒸水中(8％，w/v)进行喷雾干燥。喷干条件均为，进口温度150℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力414l/h，进液速度4.5ml/min，得包含异丙托溴铵、福莫特罗和糠酸氟替卡松纳米晶体三种剂量相差较大的药物的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为4.7±2.1μm和43.8±0.8％。
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有近68％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图10)。
实施例6:包含富马酸福莫特罗(ff)和布地奈德(bud)纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒(ff-bud-hpc/ms)的制备
称取羟丙基纤维素0.7g，加入150ml重蒸水，磁力搅拌，使其充分溶胀、溶解，依次加入富马酸福莫特罗10mg以及含355.5mg粒径为350±3nm的布地奈德的纳米晶混悬液50ml，继续搅拌，使两种药物在溶液中分散均匀，进行喷雾干燥。作为对照，将富马酸福莫特罗和布地奈德的原料药按比例加入重蒸水中(8％，w/v)，分散均匀，进行喷雾干燥。喷干条件均为：进口温度150℃，干燥空气流量35m3/h，雾化压力536l/h，进液速度6.0ml/min，得包富马酸福莫特罗和布地奈德纳米晶体的生物粘附性肺吸纳米复合微粒。
采用新一代撞击器(ngi)测定了复合微粒的空气动力学粒径和微粒中粒径小于5的细粒子的分数(fpf值)，分别为6.3±3.3μm和29.7±0.4％。
微粒粘附在肺粘膜上并经缓冲液冲洗1小时后仍有近40％的微粒滞留在粘膜表面，表明该复合微粒在离体猪肺黏膜上具有较长的滞留时间(图11)。但与透明质酸或壳聚糖的微球相比，滞留量能力差，而且粒径大，细粒子分数低。
试验例1.：复合微球空气动力学粒径测定
按“新一代装置器具有/不具有预分离器用于定量型吸入气雾剂和粉雾剂”(《欧洲药典》第7版装置e(ngi))项下操作。测定开始前，按表1中所示体积，分别将涂层液(10％(v/v)吐温-20乙醇溶液)均匀涂布于各级收集盘，收集盘置于洁净通风橱中，放置约30min挥干乙醇，形成薄而均匀的涂层。取3#hpmc胶囊1粒，内部填装约10mg(实施例1-4)复合微粒干粉，精密称定胶囊中干粉质量。将各收集盘依次放入装置，连接好仪器，并通过调节tpk2000使ngi的气流量达到100±5l/min。胶囊装入吸入装置中，振摇10s使干粉充分分散，通过适配器连接吸入装置和仪器，按压装置两侧按钮，将胶囊刺破。调节tpk2000进入程序设定，每次抽气持续2.4s，每个胶囊抽气3-5次。进入测试程序，在压力4kpa，抽气气流100±5l/min条件下，进行测试，每次测定一个胶囊，每个处方平行测定三次。每次测定结束后，关闭真空泵，拆除装置，用乙腈水溶液(30:70,v/v)分别清洗各收集盘，清洗溶液收集至容量瓶中，用乙腈水溶液(30:70,v/v)定容至刻度，摇匀。并对容量瓶中溶液进行高效液相分析，测定各收集盘中布地奈德含量。将各级收集盘截留粒径与收集到的微粒累积百分率进行回归分析，利用回归方程计算出小于5μm粒径的微
表1100±5l/min气流量下ngi装置各级截留粒径及所需涂层液的体积
粒含量，记为fpf值。空气动力学粒径小于5μm粒子，可沉积于肺部，发挥治疗作用，因此用fpf值表示微粒的肺部沉积率。
试验例2：肺吸纳米复合微粒(实施例2)的形态观察
用扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,sem)来观察微粒的表面形态。操作过程如下：取适量待测样品，分散于样品台，脱水处理，喷涂金微粒，喷金厚度控制在10nm左右，进行样品形态的测定，加速电压为15kv。
试验例3:肺吸纳米复合微粒(实施例1-4)对肺黏膜的粘附性评价
取10cm左右长，离体1h内的新鲜的肺黏膜，用生理盐水洗净表面血渍。将已知量的含药肺吸纳米复合微粒(约5mg)和相应的纯药物的喷干微粒(约5mg)分别分散于此黏膜上，分散面积约为2.25cm2，然后将该黏膜在90％恒湿环境中培育30min，再分别将其固定于聚乙烯弧形片上，并与水平面呈45°放置，装置图如图1所示。用预热的37±0.5℃的pbs冲洗1h，流速通过蠕动泵控制在5ml/min，收集冲洗液，高效液相法测定冲洗液中药物的浓度，得到肺粘膜粘附性曲线。
实施例中制备的肺吸纳米复合微粒均具有较好的生物粘附性，较纯药物微球在肺粘膜上滞留时间更久。
试验例4：复方硫酸沙丁胺醇布地奈德肺(实施例1)吸纳米复合微粒在大鼠体内药动学研究
取雄性sd大鼠8只，禁食12h后，对每只大鼠进行称量、标号。按0.2mg布地奈德、0.5mg硫酸沙丁胺醇/100g大鼠的剂量将药物称至modeldp-4-rtm干粉给药装置，插入含空气柱的注射器，待用；将大鼠麻醉，固定，借助喉镜固定大鼠口腔并找到大鼠声门裂，将给药装置插入声门裂，插入深度为装置前段导管弯折处位于大鼠门齿处，快速推注注射器活塞，完成大鼠气管给药。气管给药操作如图12所示。
大鼠于给药后0.083h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h和48h分别于眼眶后静脉取血0.5ml，迅速于4℃、14800rpm转速下离心5min，取上层血浆样品，高效液相法测血浆样品中药物浓度，其随时间变化如图3所示。
试验例4：复方塞托溴铵和糠酸氟替卡松生物粘附复方肺吸纳米复合微粒(实施例4)的体外药物释放度测定
称取10mg微球，加至5ml含0.2％的pbs(ph7.4)缓冲液中，在保证漏槽条件下，置于水平-恒温振荡仪中进行体外释放度的测定，振荡速度为200r·min-1，释药温度为37℃。在预设设定的时间点，4000r·min-1离心1min后，取出1ml，再补充同样体积的已预热的新鲜pbs，取出的溶液用hplc分析，得到微球的体外释放曲线，如图8所示。
试验例5:复方塞托溴铵和糠酸氟替卡松生物粘附复方肺吸纳米复合微粒(实施例4)在大鼠体内药动学研究
取雄性sd大鼠8只，禁食12h后，对每只大鼠进行称量、标号。按0.03mg/100g塞托溴铵和0.30mg/100g糠酸氟替卡松的剂量将药物称至modeldp-4-rtm干粉给药装置，插入含空气柱的注射器，待用；将大鼠麻醉，固定，借助喉镜固定大鼠口腔并找到大鼠声门裂，将给药装置插入声门裂，插入深度为装置前段导管弯折处位于大鼠门齿处，快速推注注射器活塞，完成大鼠气管给药。气管给药操作如图11所示。
大鼠于给药后0.083h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h、24h和48h分别于眼眶后静脉取血0.5ml，迅速于4℃、14800rpm转速下离心5min，取上层血浆样品，高效液相法测血浆样品中药物浓度，其随时间变化如图9所示。