本发明涉及一种制剂技术，更加具体的说涉及一种紫草素脂质体及其制备方法。
技术背景
紫草是草本植物新疆紫草(arnebiaeuchroma(royle)johnst)或内蒙紫草(arnebiaguttatabung)的干燥根，紫草素属2、4萘醌类有机化合物，为天然紫草的主要药效成分，不仅能够促进细胞生长，加速伤口愈合，修复皮肤损伤，还具有诱导疤痕成纤维细胞凋亡，抗炎，抗病毒等作用。临床上常用于湿疹、带状泡疹和烧烫伤，增生性疤痕等疾病的治疗(参考文献：杨延龙等.紫草素促进化疗药物渗漏局部皮肤组织损伤愈合的实验研究[j].上海中医药杂志,2011(7):60-62.徐佳等.紫草素药理作用研究进展[j].药物生物技术,2015(1):87-90.)，剂型主要有膏剂、油剂等，但均有不同程度的皮肤刺激性。
将药物包封于脂质体中，不仅可以减少局部皮肤刺激性，还可使药物尽可能少的进入血液循环，集中于皮肤病灶，形成药物贮库，缓释药物，是一种理想化的皮肤局部给药载体。与普通外用制剂相比，可以增加药物的治疗指数，减少给药次数及剂量，提高患者的顺应性(参考文献：张小灵等.双丹脂质体凝胶剂的制备工艺优化及体外透皮性能研究[j].中药材,2017,40(2):402-407.彭向前等.脂质体作为经皮局部给药载体的研究进展[j].中国药事,2005,19(6):358-360.)。
技术实现要素：
为针对技术背景所述的技术问题，本发明采用单因素结合box-behnken效应面法优化紫草素脂质体的制备工艺，并对其理化性质及体外透皮特性进行考察提供了一种紫草素脂质体。具体内容如下：
一种紫草素脂质体，所述紫草素脂质体包括卵磷脂、胆固醇、紫草素和水。
所述卵磷脂与胆固醇的质量比为2-6:1，卵磷脂-紫草素的质量比1-40:1，卵磷脂在脂质体中的质量百分比为0.5％-2.5％。
所述卵磷脂与胆固醇的质量比为4:1，卵磷脂-紫草素的质量比20:1，卵磷脂在脂质体中的质量百分比为1.5％。
一种紫草素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)根据质量比称取卵磷脂、胆固醇、紫草素；
2)用无水氯仿溶解卵磷脂、胆固醇、紫草素，加热成膜，成膜后除尽有机溶剂，得到混合物；
3)将混合物加入0.9％nacl溶液振荡水合1h使薄膜脱落，冰水浴超声至形成脂质体混悬液，即得紫草素脂质体。
步骤2)所述的加热成膜为旋转蒸发至底部形成均匀的紫红色类脂膜；成膜温度为50℃。
本发明的有益技术效果是：本发明所述方法及配方所得脂质体形态呈球型，表面圆整、无黏连；平均粒径225.8nm；zeta电位-120.7mv；紫草素的平均包封率为73.94％；紫草素体外12h累计释放率分别为49.67％；脂质体中紫草素的透皮速率拟合方程分别为q＝23.791t1/2-44.257，r2＝0.9841，皮肤滞留量分别为76.0μg/cm2，相对原料药溶液提高了1.43倍。
附图说明
图1、a和b(1)、a和c(2)、b和c(3)的交互作用对y影响的三维效应面图(a)及等高线图(b)；
其中，a和b(1)交互作用对y影响的三维效应面图为a-1，等高线图为b-1；
a和c(2)的交互作用对y影响的三维效应面图a-2，等高线图为b-2；
b和c(3)的交互作用对y影响的三维效应面图为a-3，及等高线图b-3；
图2紫草素脂质体的电镜图(a)、粒径分布(b)和zeta电位(c)；
图3紫草素q-t曲线；
图4紫草素qn-t曲线；
图5紫草素皮肤滞留量。
具体实施方式
实施例1紫草素脂质体的考察
1、紫草素脂质体的制备
精密称取处方量卵磷脂、胆固醇、紫草素于茄形瓶中，氯仿溶解，旋转蒸发至底部形成均匀的紫红色类脂膜，继续抽真空20min除尽有机溶剂，加入0.9％nacl溶液振荡水合1h使薄膜脱落，冰水浴超声至形成脂质体混悬液，即得。
2、紫草素脂质体包封率的测定
取紫草素脂质体，加入甲醇破乳，0.22μm滤膜过滤，取续滤液测定脂质体的总药物含量w总。采用超滤离心管分离脂质体和游离药物，另取紫草素脂质体于超滤离心管内，4000r/min离心20min取外管溶液，测定游离药物的含量w游。按下式计算包封率：
y包封率＝(1－w游/w总)×100％
3、卵磷脂-胆固醇的质量比考察
固定卵磷脂-紫草素的质量比为20﹕1，磷脂的质量分数1.5％，选取卵磷脂-胆固醇的质量比分别为2﹕1、3﹕1、4﹕1、5﹕1、6﹕1制备脂质体，紫草素包封率分别为51.72％、61.01％、67.80％、64.35％、59.23％结果表明：随着卵磷脂的增加，紫草素包封率均呈先增大后减小的趋势；当卵磷脂-胆固醇的质量比4:1时包封率最大。
4、卵磷脂-紫草素的质量比
固定卵磷脂-胆固醇的质量比为4﹕1，磷脂的质量分数1.5％，选取卵磷脂-紫草素的质量比分别为1﹕1、5﹕1、10﹕1、20﹕1、40﹕1制备脂质体，紫草素包封率分别为36.93％、55.71％、61.42％、69.55％、40.11％，结果表明：卵磷脂-紫草素的质量比是影响脂质体包封率的显著因素，过大或过小包封率均较低，其中卵磷脂-紫草素的质量比为20﹕1时，脂质体包封率高。
5、磷脂的质量分数
固定卵磷脂-胆固醇的质量比为4﹕1，卵磷脂-紫草素的质量比为20：1，选取磷脂的质量分数0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％制备脂质体，紫草素包封率分别为，65.39％、67.26％、72.11％、70.79％、68.90％。结果表明：当磷脂在脂质体中的质量分数为1.5％，形成的脂质体较均一，无分层现象，且包封率高。
6、紫草素脂质体的处方优化
为进一步优化紫草素脂质体处方，在单因素考察的基础上，选取卵磷脂-胆固醇的质量比(a)、卵磷脂-紫草素的质量比(b)、磷脂在脂质体中的质量分数(c)3个显著变量，以紫草素的包封率y为响应值，采用box-behnken效应面法进行优化设计，通过dseign-expert软件对实验结果进行响应面分析，试验安排及结果见表1，方差分析见表2。
表1：响应面分析方案和实验结果
表5：方差分析
7、模型拟合
采用design-expert软件对数据进行分析处理，以评价指标y1、y2对自变量进行模型拟合处理，以相关系数(r2)和置信度(p)为拟合模型评价。得二次多项回归方程:y＝-41.29+25.31a－2.17b+37.89c－0.05ab－1.48ac+0.39bc-1.85a2－0.06b2－19.32c2拟合方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对相应值的影响程度，系数的正负反映了其影响的方向。由方程可知制备工艺的影响顺序为：磷脂的质量分数＞卵磷脂-胆固醇的质量比＞卵磷脂-紫草素的质量比。
由拟合结果可知模型相关性系数r2大于0.95，说明实测值与预测值间有高度相关性，能够准确地预测实际情况；校正决定系数r2adj为0.9562，说明该实验误差较小，操作可信；模型p值,小于0.01，该模型拟合度较高，极具统计学意义。失拟项p值大于0.05，模型失拟不显著，该回归方程能较好的拟合真实的效应面，可用来反映卵磷脂-胆固醇的质量比、卵磷脂-紫草素的质量比、磷脂在脂质体中的质量分数对脂质体包封率的影响，模型可用于优化紫草素脂质体的制备工艺。
8、参数预测和工艺优化
通过多元回归方程作等高线及三维效应曲面图，预测紫草素脂质体的最佳处方配比，结果见图1。
从回归系数显著性检验结果可知：对y影响显著的是a(p＝0.0181)、b(p＜0.0001)、c(p＝0.0071)、bc(p＝0.0450)、a2(p＜0.0001)、b2(p＜0.0001)、c2(p＝0.0006)，说明各因素与响应值之间并不是简单的线性关系；b对y影响极为显著(p＜0.01)，a、c对y影响显著(p＜0.05)，影响y的因素主次顺序为b＞c＞a，bc对y的影响显著(p＜0.05)，由此可知，各因素对响应值的影响并非简单的线性关系，所选因素间存在交互作用。
效应面的等高线图和三维效应曲面图可以直观地反应因素间交互作用的强弱及最优条件下各因素的取值。等高线呈椭圆形且较越密集，则表明影响因素对响应值的影响大，交互作用强；响应面3d图越弯曲、陡峭，表明交互作用越明显。由结果可知，ab、ac、bc效应面等高线图均呈椭圆形交互作用强，但ab效应面3d图曲面弯曲程度稍大，ab为影响紫草素包封率的主要交互因素。design-expert软件优选出最佳脂质体制备处方：卵磷脂-胆固醇的质量比4.25﹕1，卵磷脂-紫草素的质量比18.04﹕1，磷脂在脂质体中的质量分数1.4％。
9、验证试验
按最优制备工艺制备3批紫草素脂质体，测定两种成分的包封率，紫草素实测平均包封率为73.94％，rsd为1.51％，该成分预测值为74.42％。指标的实测值与预测值接近，相对偏差低于3％，表明该模型具有良好的预测性，且工艺稳定可行。
在单因素筛选的基础上对影响较大的卵磷脂-紫草素的质量比、胆固醇-卵磷脂的质量比、磷脂的质量浓度采用box-behnken效应面法进行优化试验，得到最佳工艺参数，并对最优处方进行验证，相对偏差较小，表明该回归模型可较好地预测紫草素脂质体的包封率，结果预测准确，真实可靠。与目前普遍采用的正交和均匀设计优化工艺相比，box-behnken效应面法可连续对试验各水平进行分析，在反映各因素不同程度对制备工艺影响的同时，还直观体现了因素间的交互作用，具有实验精度高、预测性好的优势。
在分离游离药物与脂质体的过程中试采用透析法，发现所需时间较长；凝胶柱色谱法，重现性差，洗脱过程中会因为洗脱剂的稀释而出现药物泄露的现象；超滤离心法效果较好，且分离迅速，故采用超滤离心法测定紫草素脂质体的包封率。
实施例2紫草素脂质体形态、粒径和zeta电位测定
采用扫描电镜观察紫草素脂质体的形态，取脂质体适量，稀释至适当浓度，滴少量于载玻片上，在室温下自然风干，然后真空镀金后，观察其形态。采用激光粒度仪测脂质体平均粒径分布及zeta电位。见图2，结果表明脂质体呈类球型，表面圆整，无黏连，其粒径为225.8nm，zeta电位为-120.7mv。
实施例3紫草素脂质体体外释放度测定
采用《中国药典》2015年版四部溶出度与释放度测定法中第三法(小杯法)进行测定，相关参数：温度37.5℃、转速120r/min、释放介质为脱气的生理盐水100ml。精密移取紫草素脂质体混悬液及原料药溶液各6ml分别置于处理好的透析袋内，扎紧并绑于溶出仪搅拌桨上，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、10、12h定位吸取溶液2ml(同时补充同温介质2ml)过微孔滤膜后，hplc法进样检测，计算样品各时间点的累计释放量q，并对时间t作图，见图3。结果表明：脂质体中紫草素体外12h累计释放率分别为49.67％；有明显的缓释效果，与之相比，游离药物8h内几乎释放完全。
实施例4紫草素脂质体体外透皮特性的测定
1离体皮肤的制备
用8％na2s溶液脱去小鼠腹部的毛发，24h后将小鼠处死，剥离腹部皮肤，用生理盐水洗净，置生理盐水中，于4℃保存。
2体外透皮试验
采用franz扩散池法，进行体外透皮试验。将上述皮肤固定于扩散池供给室与接受室之间，分别精密移取紫草素脂质体混悬液、原料药溶液2ml于皮肤表面，接受池加入20％乙醇-生理盐水，排净气泡使真皮一侧与接收液完全接触。水浴温度为32℃，磁力搅拌速度200r/min。分别于4、8、12、16、20、24h，取出接收介质2ml，同时向接受池中补加等量的新鲜接收介质。取出的接收介质经0.22μm微孔滤膜过滤后，测定含量。以qn＝(v总cn+σcn－1v取)/a(qn为累积透皮量，v总为接受池体积，cn为该次取样测定浓度，v取为每次取样体积，a为渗透面积)计算单位面积累积渗透量，以qn-t作图，见图4，并对qn-t透皮吸收速率曲线进行模型拟合，结果紫草素在水溶液中符合零级释药模型，透皮速率拟合方程分别为q＝5.3929t-19.133，r2＝0.9989；紫草素脂质体符合higuchi释药模型，透皮速率拟合方程分别为q＝23.791t1/2-44.257，r2＝0.9841。结果表明，紫草素脂质体2种成分透皮速率较小于原料药溶液，脂质体组表现出明显的缓释性。
3皮肤滞留量试验
取紫草素脂质体混悬液、原料药溶液，按上述方法进行透皮实验，分别在4、8、12、16、20、24h取透皮试验给药后的皮肤，轻轻试净表面残留，用打孔器打下半径8mm的圆皮肤片，剪碎，加入生理盐水0.5ml匀浆，加入1.0ml水饱和正丁醇，涡旋5min，13000r/min离心30min，分离有机层，氮气吹干。残渣用0.1ml甲醇溶解，涡旋5min混匀，10000r/min离心15min，取上清液用hplc法检测，计算不同时间单位面积皮肤滞留量qs(qs＝cs×0.1/a；cs为第n个时间点测得的皮肤样品液中药物质量浓度，a为渗透面积)，见图5。结果表明：经24h透皮后，脂质体组紫草素的皮肤滞留量分别为39.0μg/cm2；水溶液组为27.2μg/cm2。经24h透皮之后，脂质体组有效成分的皮肤滞留量均高于水溶液对照组，提示药物主要集中于皮肤病灶，以贮库的形式产生缓释作用。
由体外透皮考察结果可知：紫草素的qn-t曲线具有相似性，其原因可能是：两者的化学结构、性质和分子量具有相似性。由图5可知，经皮给药前期，紫草素脂质的透皮速率较原料药溶液无明显差异，随时间的增加，脂质体透皮速率逐渐降低；脂质体组紫草素的皮肤滞留量分别为39.0μg/cm2；水溶液组为27.2μg/cm2。相对提高了1.43倍。