一种甘氨酸与卡那霉素联用的制剂的制作方法

本发明涉及小分子物质甘氨酸，尤其是涉及可提高细菌对抗生素敏感性的一种甘氨酸与卡那霉素联用的制剂。

背景技术：

虽然抗生素的使用对人类健康和生命的保护以及动物集约化养殖起到必不可少的作用，但由于抗生素的滥用和其误用，又成为威胁人类健康、畜禽养殖和水产养殖以及生态环境的关键因素。因此，控制细菌抗生素耐药十分重要。

目前，抗生素在畜牧养殖业方面大量使用。一方面，一些抗生素作为兽药控制细菌性感染必不可少；另一方面，一些抗生素作为饲料药物添加剂可以促进动物生长。抗生素的大量使用使敏感菌大量死亡，耐药菌得以大量繁殖，促进和增强了细菌的耐药性。不同种类抗生素的使用，促进了多重耐药菌的产生，即产生可以耐药3种以上抗生素的菌株。控制这些多重耐药菌的感染往往需要更换新抗生素和增加抗生素剂量。然而，这样的防治方法往往使残存的多重耐药菌的耐药谱更宽，耐药能力更强。因此，发明新的方法具有重要意义。

已有研究发现，利用植物提取物、中药、免洗消毒剂等在体外对多重耐药菌具有较好的抑制作用。但这些都是复合成分，无法知道具体哪种物质起关键作用。新近有研究发现，利用小分子物质如葡萄糖、果糖、丙氨酸，能提高氨基糖苷类抗生素对革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)持久性耐药菌(persistence)以及耐药菌的敏感性。这些研究表明了以代谢物为基础的小分子来清除耐药菌的可行性。迄今为止，无甘氨酸促进卡那霉素抗生素抑制耐药菌生长以及甘氨酸增加葡萄糖促进卡那霉素抗生素作用的报道。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供甘氨酸与卡那霉素联用在提高细菌对卡那霉素敏感性的应用。

本发明的第二目的在于提供甘氨酸和/或葡萄糖与卡那霉素联用在提高细菌对卡那霉素敏感性的应用。

本发明的第三目的在于提供一种甘氨酸和/或葡萄糖与卡那霉素联用的制剂。

所述甘氨酸和/或葡萄糖与卡那霉素联用的制剂由甘氨酸和/或葡萄糖与卡那霉素组成。

所述细菌可采用耐药菌；所述耐药菌可选自迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)、大肠杆菌临床耐药菌(y15)、溶藻弧菌等中的一种。

所述甘氨酸、葡萄糖和卡那霉素的剂量按质量比可为1︰(0.01～100)︰(0.01～10)。

所述甘氨酸的使用量可为0.5mg～2g/次/kg体重给药。

所述抗生素可选自氨基糖甙类抗生素。

本发明通过添加甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明可以提高对卡那霉素的敏感性。

本发明通过添加葡萄糖和甘氨酸后，迟缓爱德华氏耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明这两种物质具有协同性，并且具有甘氨酸浓度梯度效应。

本发明测定了添加甘氨酸和/或葡萄糖后进入细菌体内抗生素含量，发现这两种小分子物质可促进抗生素进入细菌体内的含量，协同使用时，抗生素含量增加更显著。

本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，迟缓爱德华氏菌用其他抗生素处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和/或葡萄糖可以提高细菌对其他抗生素的敏感性。

本发明通过添加甘氨酸和/或葡萄糖后，其他细菌包括金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，大肠杆菌临床耐药菌和溶藻弧菌用卡那霉素处理时生存率显著下降，说明甘氨酸和/或葡萄糖可以提高其他细菌对卡那霉素的敏感性。

结果表明，可以通过在抗生素中添加甘氨酸和/或葡萄糖而提高其对抗生素敏感性的方法来达到治疗细菌包括耐药菌的目的。

综上所述，在卡那霉素抗生素中添加甘氨酸或/和葡萄糖能够明显提高耐药菌对抗生素的敏感性，为养殖动物的疾病治疗提供了一种崭新的技术方法。

附图说明

图1为添加甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性的结果。

图2为葡萄糖协同甘氨酸提高细菌敏感性结果。

图3为在添加葡萄糖前提下不同浓度甘氨酸提高敏感性结果。

图4为添加甘氨酸和葡萄糖可促进进入细菌体内抗生素含量的研究结果。

图5为甘氨酸和/或葡萄糖对提高金黄色葡萄球菌对卡那霉素敏感性的研究结果。

图6为甘氨酸和/或葡萄糖对提高铜绿假单胞菌对卡那霉素敏感性的研究结果。

图7为甘氨酸和/或葡萄糖对提高大肠杆菌临床耐药菌对卡那霉素敏感性的研究结果。

图8为甘氨酸和/或葡萄糖对提高溶藻弧菌对卡那霉素敏感性的研究结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

迟缓爱德华菌eib202的耐药性测定

迟钝爱德华氏菌为革兰氏阴性短杆菌。它是由hoshina(1962a)首次报道,与日本鳗鲡红病(reddisease)有关。从第一次报道到现在该菌已经在二十多种鱼类中引起了病害，如鳗鲡，牙鲆，罗非鱼，中华鳖，鲤鱼等，给水产养殖造成了巨大损失。迟钝爱德华氏菌也是一种人、鱼共患病原菌，直接对人类健康造成了威胁。

首先测定迟缓爱德华菌对多种抗生素的最低抑菌浓度。结果表明迟钝爱德华氏菌eib202对卡那霉素的最低抑菌浓度为12.5μg/ml，对四环素的最低抑菌浓度为125μg/ml，对氯霉素的最低抑菌浓度为50μg/ml，表明迟钝爱德华氏菌eib202是一个多重耐药菌。

实施例2

甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性

1.试验样本的准备：从lb平板上挑取迟缓爱德华菌eib202单菌落接种于5mllb培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×m9(含10mm乙酸盐)悬浮菌体，调菌液od值至0.2，然后分别分装5ml于试管中备用。

2.甘氨酸可提高迟缓爱德华氏菌eib202对卡那霉素的敏感性

为了解甘氨酸是否有助于细菌的杀菌作用，进行了在加入卡那霉素前提下，添加甘氨酸实验。在上述制备好的细菌样本中，先添加40μg/ml卡那霉素，再分别添加0，1.25，2.5，5，10和20mm甘氨酸，30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μl菌液进行tsb琼脂平板菌落计数。结果(图1)发现，添加甘氨酸后，可以提高eib202对卡那霉素的敏感性，且在卡那霉素存在的前提下，随着加入甘氨酸浓度的升高，其对细菌的杀菌效率也逐渐增加，当加入20mm甘氨酸时，可提高近150倍的杀菌率。具体情况是：在40μg/ml卡那霉素情况下，1.25mm甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率75倍(生存率由未添加的108％下降到添加后的0.99％)，2.5mm甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率86倍(生存率由未添加的113％下降到添加后的0.88％)，5mm甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率110倍(生存率由未添加的119％下降到添加后的0.68％)，10mm甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率122倍(生存率由未添加的117％下降到添加后的0.61％)，20mm甘氨酸可提高对细菌的杀菌效率145倍(生存率由未添加的118％下降到添加后的0.61％)。

实施例3

葡萄糖协同甘氨酸提高迟缓爱德华氏菌的敏感性

已有文献报道，葡萄糖能提高氨基糖苷类对革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)持久性耐药菌(persistence)的敏感性，并证明这种现象是氨基糖甙类抗生素所特有的。因此我们也对葡萄糖，以及甘氨酸和葡萄糖对细菌对卡那霉素敏感性进行了研究。

1.葡萄糖和甘氨酸可协同提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性

为研究葡萄糖以及葡萄糖是否可协同甘氨酸提高细菌对卡那霉素的敏感性，将实验分为三组：一组在制备好的样品中仅仅加入40μg/ml卡那霉素作为对照，另两组在加入40μg/ml卡那霉素的基础上，分别添加10mm葡萄糖，10mm葡萄糖和20mm甘氨酸作为实验组。30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μl菌液进行菌落计数。结果(图2)发现，当加入葡萄糖后，细菌的敏感性得到了提高，细菌敏感性提高了42倍。而在加入葡萄糖基础上，再加入甘氨酸，细菌的敏感性得到了大幅度的提高，其敏感性达到671倍。

2.甘氨酸提高迟缓爱德华氏菌对卡那霉素的敏感性具有甘氨酸浓度梯度效应

为了解在甘氨酸和葡萄糖协同提高细菌敏感性是否具有浓度梯度依赖性，在加入10mm葡萄糖前提下，分别加入1.25，2.5，5，10，20mm的甘氨酸，孵育6h后分别进行活菌计数，结果(图3)发现，在加入葡萄糖前提下，随着加入甘氨酸浓度的升高，其对耐药菌杀菌效率的提高越显著，当加入20mm甘氨酸时，可提高近700倍的杀菌率。具体情况是：添加葡萄糖后，在1.25mm甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了106倍(生存率由仅添加葡萄糖的2.57％下降到再添加甘氨酸后的0.97％)，在2.5mm甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了170倍(生存率下降到添加后的0.6％)，在5mm甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了216倍(生存率下降到添加后的0.47％)，在10mm甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了400倍(生存率下降到添加后的0.259％)，在20mm甘氨酸情况下，耐药菌的杀菌效率提高了659倍(生存率下降到添加后的0.157％)。

实施例4

甘氨酸和葡萄糖可增加抗生素进入细菌体内的数量

细菌死亡与进入细菌内部的抗生素数量有关。为研究甘氨酸和葡萄糖对促进抗生素进入细菌内部的作用，从lb平板上挑取迟缓爱德华菌eib202单菌落接种于5mllb培养基中，30℃200rpm振荡培养24h达饱和状态。离心收集菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×m9(含10mm乙酸盐)悬浮菌体，调菌液od值至0.2，然后分别分装5ml于试管中作为试验样本备用。将实验分为5组，其中2组为对照组，分别为不添加任何物质和添加抗生素；另3组为实验组，在添加抗生素情况下，分别添加甘氨酸、葡萄糖、甘氨酸和葡萄糖。30℃200rpm摇床中孵育6h后。离心清洗菌体，超声波破碎，用卡那霉素elisa检测试剂盒(北京中检维康技术有限公司，clovertechnologygroupinc)测定卡那霉素含量。结果见图4。添加甘氨酸后，相比仅加入抗生素时进入细菌体内抗生素增加了6.57倍，添加葡萄糖后，体内抗生素含量增加了4.74倍，而添加了葡萄糖和甘氨酸后，进入抗生素含量大幅度提高，增加了13.21倍。说明甘氨酸和葡萄糖可以显著提高进入细菌体内的抗生素含量。

实施例5

甘氨酸和葡萄糖可提高多种细菌对卡那霉素抗生素的敏感性

挑取多种细菌：金黄色葡萄球菌(s.aureus)，绿脓杆菌(铜绿假单胞菌，p.aeruginosa)，大肠杆菌临床耐药菌(y15)，溶藻弧菌(v.alginolyticus)单克隆到100mllb液体培养基中，37℃或30℃200rpm培养16h达饱和状态。收集20ml菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以等体积0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×m9(含10mm乙酸盐)悬浮菌体，调菌液od至0.2，然后分别分装5ml于试管中，以添加卡那霉素为对照组，再分别添加20mm甘氨酸、10mm葡萄糖、20mm甘氨酸和10mm葡萄糖为实验组，37℃或30℃200rpm摇床中孵育6h后，取100μl菌液进行菌落计数，结果见图5～8。由这些结果可以看出，对于金黄色葡萄球菌(图5)，分别添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率分别提高了16.38倍和32.75倍，而同时添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率提高了327.5倍；对于铜绿假单胞菌(图6)，分别添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.97倍和1.71倍，而同时添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率提高了20.99倍；对于大肠杆菌临床耐药菌(图7)，分别添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.05倍和34.86倍，而同时添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率提高了305倍；对于溶藻弧菌(图8)，分别添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率分别提高了1.3倍和72.75倍，而同时添加20mm甘氨酸和10mm葡萄糖后，杀菌效率提高了646.67倍。这些结果表明分别添加了甘氨酸和葡萄糖后，细菌包括耐药菌的杀菌效率都有提高，而同时添加了甘氨酸和葡萄糖后，杀菌效率得到了显著提高。

本发明涉及小分子物质甘氨酸和葡萄糖。甘氨酸单用以及与葡萄糖合用能够提高细菌包括耐药菌对抗生素的敏感度，从而克服细菌耐药性问题。本发明所提供的小分子物质甘氨酸，与卡那霉素联用，在养殖动物疾病治疗中使用，比现有的只用卡那霉素在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更高的安全性。