本发明涉及中医药制品加工技术领域，具体涉及一种斑鸠菊抗肿瘤活性提取物制备方法及应用。
背景技术：
癌症是一种基于自身细胞失控增殖和扩散（转移）的多病因复杂疾病，虽然在过去几十年间，化学治疗、手术治疗、放射治疗等癌症的诊断和治疗方面取得了长足的进步，目前癌症仍然是威胁人类生命健康的主要疾病之一，是仅次于心血管疾病的第二杀手。中草药抗肿瘤研究发现，清热解毒药物往往具有抗肿瘤活性，具有良好的应用前景，其中三尖杉、冬凌草、大青叶、半枝莲等中草药都已用于肿瘤的治疗。
斑鸠菊（vernoniaesculentahemsl.）灌木或小乔木，俗称豆腐渣树、聋耳朵树、鸡菊花、火炭树、火炭叶等。产于广西、四川、贵州、云南等地，属常用民间草药。斑鸠菊味甘；涩；性凉，有清热解毒；生肌敛疮。主阑尾炎；疮疖；烫火伤等功效。菊科斑鸠菊属植物中分离出的化学成分种类较多，生物活性多样，包括甾体、萜类、黄酮类、苯丙素类、脂肪酸等。斑鸠菊果实提取物具有降糖作用，从中鉴定出斑鸠菊酸、斑鸠菊大苦素、熊果酸、斑鸠菊醇、木犀草素、紫铆素、β-谷甾醇、原儿茶酸等多种化合物。
目前，对于斑鸠菊全株植物提取物的研究中，还未见抗癌功效的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题为提供一种斑鸠菊抗肿瘤活性提取物及其制备方法。
本发明所要解决的第二个技术问题为提供所述有效活性提取物在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。
本发明所要解决的第三个技术问题为提供以所述活性提取物为有效成分的药物组合物。
为解决上述第一个技术问题，本发明提供的技术方案如下：
一种斑鸠菊抗肿瘤活性提取物，它是以烘干的斑鸠菊全株为原料，干燥粉碎后，加入7-10倍的60-95%的乙醇搅拌加热50-60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，药渣中进一步加入8倍量60-95%的乙醇；搅拌加热50-60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液；合并滤液，减压浓缩除去乙醇，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩得浸膏；乙酸乙酯部位经mcigel树脂柱分离，分别以40%、80%、95%乙醇7-9bv洗脱，分别收集洗脱液、浓缩干燥，分别获得组分a、组分b、组分c，经实验证实，其中组分b具有明显的抗肿瘤作用，所述的抗肿瘤是抗肿瘤细胞a549和p388；
一种斑鸠菊抗肿瘤活性有效部位提取物的制备方法，它包括以下步骤：
（1）烘干的斑鸠菊全株为原料，干燥粉碎后，加入7-10倍的60-95%的乙醇搅拌加热50-60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，药渣中进一步加入8倍量60-95%的乙醇；搅拌加热50-60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，得提取液；
（2）合并滤液，减压浓缩除去乙醇，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位，进一步经mcigel树脂柱分离，分别以40%、80%、95%乙醇7-9bv洗脱，分别收集洗脱液、浓缩干燥，分别获得组分a、组分b、组分c，经实验证实，其中组分b为斑鸠菊抗肿瘤有效部位提取物。
为解决上述第二个技术问题，本发明进一步提供了以斑鸠菊抗肿瘤活性有效部位提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制肿瘤细胞a549和p388增殖能力为指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞活性评价结果表明，可以明显抑制a549和p388增殖，具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物治疗药物。
为解决上述第三个技术问题，本发明提供了以所述方法制备的斑鸠菊活性提取物为有效成分的药物组合物。所述药物组合物是以本发明的有效活性部位为有效成分，与药学可接受的载体组成。采用常用制剂技术将其制成临床常用的制剂，其中所述的制剂包括：冻干粉针剂、纳米制剂、微球制剂、微囊制剂、滴丸制剂、颗粒制剂或缓控释制剂。
有益效果
斑鸠菊为民间常用的清热解毒草药，广泛分布于广西、四川、贵州、云南等地，资源丰富。斑鸠菊化学成分及活性研究少见文献和专利报道。本发明首次提供一种斑鸠菊抗肿瘤活性提取物制备方法及应用，扩大了斑鸠菊的用途，为抗肿瘤药物提供了新原料，可显著提升斑鸠菊的附加值。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明，但本发明不受限于具体实施例。
实施例1
（1）烘干的斑鸠菊全株为原料，干燥粉碎后，加入7倍的60-95%的乙醇搅拌加热60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，药渣中进一步加入8倍量60-95%的乙醇；搅拌加热60℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，得提取液；
（2）合并滤液，减压浓缩除去乙醇，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位，进一步经mcigel树脂柱分离，分别以40%、80%、95%乙醇7bv洗脱，分别收集洗脱液、浓缩干燥，分别获得组分a、组分b、组分c，经实验证实，其中组分b为斑鸠菊抗肿瘤有效部位提取物。
实施例2
（1）烘干的斑鸠菊全株为原料，干燥粉碎后，加入9倍的80%的乙醇搅拌加热55℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，药渣中进一步加入8倍量80%的乙醇；搅拌加热55℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，得提取液；
（2）合并滤液，减压浓缩除去乙醇，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位，进一步经mcigel树脂柱分离，分别以40%、80%、95%乙醇8bv洗脱，分别收集洗脱液、浓缩干燥，分别获得组分a、组分b、组分c，经实验证实，其中组分b为斑鸠菊抗肿瘤有效部位提取物。
实施例3
（1）烘干的斑鸠菊全株为原料，干燥粉碎后，加入10倍的95%的乙醇搅拌加热50℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，药渣中进一步加入8倍量95%的乙醇；搅拌加热50℃回流提取1.5小时，固液分离，收集滤液，得提取液；
（2）合并滤液，减压浓缩除去乙醇，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位，进一步经mcigel树脂柱分离，分别以40%、80%、95%乙醇9bv洗脱，分别收集洗脱液、浓缩干燥，分别获得组分a、组分b、组分c，经实验证实，其中组分b为斑鸠菊抗肿瘤有效部位提取物。
实施例4
抗肿瘤活性评价
将含有a549和p388肿瘤细胞的培养液置于5%co2的37℃恒温培养箱中培养，每隔三天传代1次，用显微镜观察细胞生长情况，待细胞进入对数分裂期；
收集对数分裂期的细胞（肺癌细胞a549和白血病细胞p388），先用0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心后吸弃上清液，再加入小牛血清培养基，将细胞悬液接种于96孔培养板,每孔100μl（每孔大约含10000个细胞），放在37℃、5%co2恒温培养箱中继续培养24h，取出观察细胞完全贴壁后，倾出各孔培养液；
将组分a、组分b、组分c，溶解于dmso，然后用培养液稀释，使其终浓度为150μg/ml得测试样品溶液，分别向每孔加入100μl各部位试药溶液，分别记为odi，同时添加只加等体积培养液的对照组，记为od0，每组平行设置4复孔，继续培养36h；
向每孔加入5mg/mlmtt液10μl，继续培养4h，弃去培养液后，每孔再加入110mldmso，震荡15min后，用酶标仪于570nm处测各孔吸光度，每组实验重复3次，结果取平均值，将数值带入抑制率计算公式。
细胞生长抑制率y(%)计算公式为：
实验设三次重复，结果取平均数。斑鸠菊组分a、组分b、组分c对不同肿瘤细胞a549和p388的抑制作用结果如表1所示；
表1.斑鸠菊不同组分(150μg/ml)对不同肿瘤细胞的抑制作用
斑鸠菊不同组分对两种肿瘤细胞的抑制增殖实验表明，斑鸠菊组分b在150μg/ml时对肺癌细胞a549和白血病细胞p388均有较强的抑制作用，对肺癌细胞a549达87.9%，白血病细胞p388达到95.3%。因此，斑鸠菊活性部位可以用于制备肺癌、白血病等肿瘤疾病的治疗药物。
实施例5
斑鸠菊抗肿瘤活性部位提取物为有效成分，与药学可接受的载体组合，采用常用制剂技术将其制成临床常用的制剂，其中所述的制剂包括：冻干粉针剂、纳米制剂、微球制剂、微囊制剂、滴丸制剂、颗粒制剂或缓控释制剂。制备工艺为本领域常规操作，在此不再赘述。