一种金观音茶精华的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于医药食品技术领域，特别涉及一种金观音茶精华的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

金观音茶(c.sinensiscv.jinguanyin)，又叫茗科1号，是1978～1999年以铁观音为母本，黄金桂为父本，采用杂交育种法得到的无性系新良种，产于福建武夷山或相似自然环境的乌龙茶茶区，属乌龙茶系(oolongtea)。经科学研究证明，铁观音含有较高的氨基酸、维生素、矿物质、茶多酚和生物碱，有多种营养和药效成分，具有清心明目，杀菌消炎，减肥美容和延缓衰老，防癌症、消血脂、降低胆固醇，减少心血管疾病及糖尿病等功效。另外金观音茶中富含茶多酚，而茶多酚中的咖啡碱可通过刺激肾脏，提高肾脏滤出率，促使尿液迅速排除体外，减少有害物质在肾脏中的滞留时间，同时还可以排除尿液中的过量乳酸，有助于使人尽快消除疲劳，清心提神益思。不仅如此，茶多酚兼具有防癌抗癌、清除自由基和体内活性氧的作用，能有效阻止亚硝酸盐等致癌物质在体内合成,有杀伤癌细胞、提高机体免疫力等功效，对多种癌症的预防和辅助治疗均大有禅益。

近年来，茶提取相关领域也开展了一些以水为溶剂提取儿茶素及茶黄素后再精制的研究工作，传统提取工艺温度过低致使效率低下，专利cn104585397a、cn104920699a等尝试低温提取茶精华，但是茶提取效率仅10.5％。或者提取时间过长(cn106974947a、cn106260248a、cn105494800a、cn104623097a、cn103300184a、cn101961061a、cn106982961a、cn105076580a、cn102018083a、cn101961422a、cn106962508a、cn101138373b、cn101961375b)，不仅耗费太多人力物力，增加生产成本；长时间浸泡茶叶也会让活性成分失活、挥发，丧失利用价值。例如，中国专利申请cn106962508a，其茶提取效率仅为20％。专利申请cn102524635a通过茶提取获得茶多酚含量仅8～11％，专利cn101848647a的茶提取物中茶多酚含量最高为24.5％，这些提取工艺仍有待优化，提高茶多酚含量。不仅如此，传统提取工艺中多加入了乙醇、丙酮等有机溶剂而最后存在残留问题(cn106974947a、cn105494800a、cn105708904a、cn102047997a、cn107252454a、cn105012534a、cn106212801a、cn106726898a、cn105412221a、cn105533035a、cn101628030、cn103222520a、cn101420862、cn101420863、cn102655761a、cn103720914a、cn1981586、cn105767326a、cn104403794a、cn105707973a、cn1833521、cn103505564a、cn106728484a、cn101961061a、cn102293279a、cn107184482a、cn105076580a、cn1476767、cn104397827a、cn104171157a、cn106962508a、cn101292688b、cn106615398a、cn101427772、cn102960500b、cn106993704a、cn105285623b、cn104946388a)，以上茶提取工艺都难以避免有机溶剂残留问题，带来二次污染，不适合长期应用于茶提取生产工艺。或者提取过程中使用酸碱试剂(cn102771735b,cn106615398a、cn104663986a)，作为食品开发其安全性有待判断，或提取过程包含色谱柱提纯分化(cn104336775a、cn103451017a、cn105494800a、cn1864504、cn102984951a、cn105708904a、cn102933088a、cn102047997a、cn105028864a、cn105412221a、cn105533035a、cn106213577a、cn102655761a、cn104171157a、cn105767326a、cn101473879a、cn105707973a、cn103704423a、cn104887839a、cn10038977、cn102960500b、cn105285623b、cn106266253a、cn105213441a、cn106995427a、cn1087145)，虽然提取的成分纯度较高，但是操作太过繁琐复杂、不适合工业化扩大。近年来，有不少研究者在茶提取工艺中加入木瓜蛋白酶、纤维素酶等生物酶助效(cn103300185a、cn106260248a、cn102933088a、cn101896077a、cn106726898a、cn101420862、cn101420863、cn103300184a、cn101932252a、cn103704423a、cn102293279a、cn106982961a、cn1927015、cn102018083a、cn105494763a、cn104489150a、cn1318308、cn105494761a、cn106962508a,cn104186810a,cn104431138a,cn101455250b,cn101083911b)，此法虽然可让提取效率升高，但是成本高、工序繁杂，降低了茶提取应用的经济价值。以上所有茶提取专利均存在自身缺陷而制约了茶叶中茶多酚、儿茶素及茶黄素等活性成分的商业扩大应用，降低了中国传统茶品的经济利用价值。

经文献检索发现，市售含茶的食品、保健品或者已发表相关茶提取物的应用，主要是开发关于抗辐射(cn102552549a)、降血脂(cn106039111a,cn106912789a)、降低血糖(cn102960500b,cn101961426b)等营养保健品、饮料(cn101848647b,cn102138598b)、香精(cn100553469c)、化妆品及提高免疫力(cn106266253a)的食品药品等领域；但是有关金观音茶提取物对抗肿瘤的活性评价及应用仍然少见，其具体抗肿瘤作用机制仍然有待探索。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种金观音茶精华的制备方法。该方法绿色环保、高效、适合工业化扩大应用。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的金观音茶精华。

本发明的又一目的在于提供所述金观音茶精华在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种金观音茶精华的制备方法，包括如下步骤：

(1)将金观音茶叶用80～100℃热水提取两次，第一次加水5～30倍体积，第二次加水5～20倍体积，然后将两次提取所得溶液过筛并合并两次滤液，得到金观音茶提取液；

(2)将步骤(1)中得到的金观音茶提取液进行浓缩，干燥，得到金观音茶提取物；

(3)向步骤(2)中得到的金观音茶提取物中加入辅料(食品添加剂)，其中辅料和金观音茶提取物的质量比为0.5～2：1，得到金观音茶精华。

步骤(1)中所述的金观音茶叶为金观音干茶叶；优选为产自福建武夷山区的金观音干茶叶，包括不同季节采摘的茶叶：春茶，夏茶，秋茶，冬茶。

步骤(1)中所述的提取的温度优选为100℃。

步骤(1)中所述的水优选为去离子水。

步骤(1)中所述的第一次加水提取的时间优选为0.5～2h；优选为1.5h。

步骤(1)中所述的第一次加水提取时水的用量为按金观音茶叶与水的质量体积比为1:25计算；第二次加水提取时水的用量为按金观音茶叶与水的质量体积比为1:15计算。

步骤(1)中所述的第二次加水提取的时间优选为0.5～1h；优选为1h。

步骤(1)中所述的过筛为过100目筛。

步骤(2)中所述的浓缩为真空浓缩，真空浓缩的温度为60～80℃，真空度为-0.04mpa～-0.07mpa，浓缩至糖度为10～30；优选为在双效低温真空浓缩罐进行浓缩，真空浓缩的温度为75℃，真空度为0.05mpa，糖度为25。

步骤(2)中所述的干燥为在离心喷雾干燥机中进行，离心喷雾干燥机的进风温度150～180℃，出风温度65～95℃；优选为在离心喷雾干燥机中进行，进风温度170℃，出风温度90℃，干燥至金观音茶提取物中的水分含量≤6％。

步骤(3)中所述的辅料为针叶樱桃粉、山梨糖醇、d-甘露糖醇、硬脂酸镁、淀粉和预胶化淀粉的一种或几种；优选为针叶樱桃粉、山梨糖醇、d-甘露糖醇和硬脂酸镁；更优选为针叶樱桃粉、山梨糖醇、d-甘露糖醇和硬脂酸镁按质量比19.83：54：25.3：0.87配比得到的辅料。

步骤(3)中所述的辅料和金观音茶提取物的质量比优选为1：1。

一种金观音茶精华，通过上述任一项所述的方法制备得到。

所述的金观音茶精华在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物，包含上述金观音茶精华。

所述的抗肿瘤药物还包含一种或至少两种药学上可以接受的载体。

所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。

所述的抗肿瘤药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂等。

所述的肿瘤包括人乳腺癌、人结肠癌、人肝癌和人宫颈癌；优选为人乳腺癌或人结肠癌。

所述的金观音茶精华的有效剂量为1.5～3g/kg。

所述的金观音茶精华在制备提高机体免疫力，清除abts自由基，清除dpph自由基，抗氧化的食品、饮品、保健食品、药物或化妆品中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明针对传统茶叶提取工艺温度过低致使效率低下或者提取时间过长，不仅耗费太多人力物力，增加生产成本；长时间浸泡茶叶也会让活性成分失活、挥发，丧失利用价值，另外，难以避免有机溶剂残留问题，带来二次污染，不适合长期应用于茶提取生产工艺；或者提取过程中使用酸碱试剂，作为食品开发其安全性有待判断等问题，开发了一种绿色环保、快速简便、性质稳定的金观音茶精华，完全以水作为提取溶剂，不含有机溶剂，避免溶剂残留带来的潜在危险，更加绿色环保、安全可靠。

2、本发明对传统茶叶提取工艺进行优化，克服其提取过程中无法避免的低温低效或者长时间低效，克服其提取过程中无法避免的使用有机溶剂或者酸碱的缺点，探索出一种高温短时间高效且环保安全的金观音茶精华的提取方法。提取程序简化，高温使提取效率增强，茶叶中的活性成分被最大程度保留；提取和浓缩步骤可操作性强，所得的金观音茶提取物的收得率≥30.0％，其生产成本低，经济利用价值高，可扩大生产规模，实现金观音茶精华的工业化扩大和商业应用。

3、本发明所制备的金观音茶精华，优选添加了针叶樱桃粉、d-甘露糖醇、山梨醇和硬脂酸镁，所选辅料均廉价易得，适合工业生产，使茶精华性质更加稳定、水溶性好。

4、本发明所制备的金观音茶精华，首次应用于抗肿瘤的医药领域，对于人乳腺癌和人结肠癌的治疗效果显著、无明显毒副作用。所提取得到的金观音茶精华对abts和dpph两种自由基具有明显的清除效果；对几种人体常见的肿瘤细胞的生长具有明显的抑制效果，特别是对于乳腺癌细胞具有很明显的抑制作用。对肿瘤组织的增殖具有明显的抑制效果，且对正常组织毒副性低。可应用于制备清除abts及dpph自由基、提高机体免疫力、预防乳腺癌和结肠癌及其辅助治疗中的一种或多种功能的食品、饮品、保健食品、药物或化妆品。

5、本发明所制备的金观音茶精华首次应用于抗肿瘤的医药领域，更针对于人乳腺癌和人结肠癌，研究金观音茶精华抑制肿瘤细胞生长的机制。总提取率高达30％，后期制备的茶精华中的茶多酚含量最高达23.6％(原茶精华中茶多酚含量最高达47.2％)；且操作简便，适合工业化扩大制备金观音茶精华，更有效增加其经济价值。有望促进金观音茶及其同源茶饮品在抗氧化、提高机体免疫力、预防肿瘤(乳腺癌及结肠癌)及其辅助治疗中的一种或多种功能的食品、饮品、保健食品、药物或化妆品的应用。

6、本发明的金观音茶精华中添加适量辅料，使金观音茶精华性质稳定、水溶性好。该方法工艺简单，易操作，制样量大且茶叶中活性成分能被最大程度保留。另外，所制备的金观音茶精华对多种肿瘤细胞(包括人乳腺癌、人结肠癌、人肝癌和人宫颈癌)都有抑制作用，对于人乳腺癌有特别显著的抑制功效。

附图说明

图1为本发明所涉及的金观音精华对于不同细胞(包括人类肿瘤细胞和人类正常细胞)的生长抑制情况图。

图2为本发明所涉及的金观音精华对mda-mb-231乳腺癌细胞周期分布的影响图；其中，图a为金观音夏茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞周期分布的影响；图b为金观音秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞周期分布的影响。

图3为本发明所涉及的金观音茶精华对sw480结肠癌细胞周期分布的影响图；其中，图a为金观音夏茶精华对sw480结肠癌细胞周期分布的影响；图b为金观音秋茶精华对sw480结肠癌乳腺癌细胞周期分布的影响。

图4为本发明所涉及的金观音茶精华对细胞内ros活性氧水平的影响图；其中，图a和b为金观音夏茶和秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞内ros活性氧水平的抑制作用；图c为金观音夏茶和秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞ros活性氧生成的荧光照片(照片放大倍数：10×)。

图5为本发明所涉及的金观音夏茶和秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞内caspase活性的影响图。

图6为金观音夏茶和秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞内线粒体形貌的破坏作用图；其中，图a为金观音夏茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞内线粒体形貌的破坏作用；图b为金观音秋茶精华对mda-mb-231乳腺癌细胞内线粒体形貌的破坏作用(放大倍数：100×)。

图7为本发明所涉及的金观音茶精华处理后荷瘤裸鼠体重和体积随时间变化图；其中图a为用金观音夏茶精华处理后荷瘤裸鼠体重随时间变化图；图b为不同方式处理后荷瘤裸鼠肿瘤体积随时间变化图。

图8为本发明所涉及的金观音茶精华对荷瘤裸鼠血液生化指标的影响图。

图9为本发明所涉及的不同金观音茶精华中的活性成分百分含量测定(以干基计)结果图；其中，图a为利用hplc高效液相色谱法测定两种金观音茶叶水提取物中的活性成分得到的色谱分析图；图b为不同金观音茶精华中的茶多酚含量比较。

图10为本发明所涉及的两种金观音茶精华在体外清除自由基能力的能力评价图；其中，图a为金观音夏茶和秋茶精华对abts自由基的清除能力变化及其量效线性关系；图b为金观音夏茶和秋茶精华对dpph自由基的清除能力变化及其线量效性关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中涉及的两种金观音茶精华的具体获得步骤为：用水提的方法从金观音茶叶(夏茶和秋茶，产自福建武夷山区及中国境内其他各产地)中提取得到金观音水溶性提取物，经浓缩干燥后，加入一定配比的食品添加剂，获得性质稳定、水溶性良好的金观音干茶提取精华，其中夏茶和秋茶分别含有1/2(w/w)和1/1(w/w)的茶叶添加剂，而金观音茶精华的添加剂具体的配方为：以重量百分比计，19.83％针叶樱桃粉、54％山梨糖醇、25.3％d-甘露糖醇和0.87％硬脂酸镁。

实施例1金观音茶精华的提取

各称取500克金观音夏茶和秋茶茶叶于中药罐中，第一次加去离子水15倍体积，第二次加去离子水10倍体积，100℃提取两次，第一次提取时间1.5h，第二次提取时间1h，滤液过筛100目，合并两次滤液；然后将两次的提取液移入双效浓缩罐，浓缩罐的真空浓缩温度为75℃，真空度-0.04mpa～-0.07mpa，浓缩至金观音茶叶提取物的糖度为25；最后将浓缩液移入离心喷雾干燥机中，控制进风温度为170℃，出风温度为90℃，干燥后金观音茶叶提取物水分含量≤6％即可。该实施例所得夏茶提取物计算得总提取效率为30.8％，秋茶提取效率为31％；其中夏茶茶多酚含量为15.3％，秋茶的茶多酚含量为14.6％。

实施例2金观音茶精华的提取

各称取500克金观音夏茶和秋茶茶叶于中药罐中，第一次加去离子水30倍体积，第二次加去离子水25倍体积，100℃提取两次，第一次提取时间1.5h，第二次提取时间1h，滤液过筛100目，合并两次滤液；然后将两次的提取液移入双效浓缩罐，浓缩罐的真空浓缩温度为75℃，真空度-0.04mpa～-0.07mpa，浓缩至金观音茶叶提取物的糖度为25；最后将浓缩液移入离心喷雾干燥机中，控制进风温度为170℃，出风温度为90℃，干燥后金观音茶叶提取物水分含量≤6％即可。该实施例所得夏茶茶提取物计算得总提取效率为31.4％，秋茶提取效率为30.1％；其中夏茶茶多酚含量为21.3％，秋茶茶多酚含量为18.9％。

实施例3金观音茶精华的提取

称取500克金观音茶叶于中药罐中，第一次加去离子水25倍体积，第二次加去离子水15倍体积，100℃提取两次，第一次提取时间1.5h，第二次提取时间1h，滤液过筛100目，合并两次滤液；然后将两次的提取液移入双效浓缩罐，浓缩罐的真空浓缩温度为75℃，真空度-0.04mpa～-0.07mpa，浓缩至金观音茶叶提取物的糖度为25；最后将浓缩液移入离心喷雾干燥机中，控制进风温度为170℃，出风温度为90℃，干燥后金观音茶叶提取物水分含量≤6％即可。该实施例所得夏茶茶提取物计算得总提取效率为39.6％，秋茶茶提取效率为38.7％；其中夏茶中茶多酚含量为47.2％，秋茶茶多酚含量为32.8％。

实施例4金观音茶精华的提取

各称取500克金观音夏茶和秋茶茶叶于中药罐中，第一次加去离子水25倍体积，第二次加去离子水15倍体积，80℃提取两次，第一次提取时间1.5h，第二次提取时间1h，滤液过筛100目，合并两次滤液；然后将两次的提取液移入双效浓缩罐，浓缩罐的真空浓缩温度为75℃，真空度-0.04mpa～-0.07mpa，浓缩至金观音茶叶提取物的糖度为25；最后将浓缩液移入离心喷雾干燥机中，控制进风温度为170℃，出风温度为90℃，干燥后金观音茶叶提取物水分含量≤6％即可。该实施例所得夏茶茶提取物计算得总提取效率为34.6％，秋茶的茶提取效率为32.4％；其中夏茶中茶多酚含量为25.3％，秋茶中茶多酚含量为23.1％。

实施例5两种金观音茶精华体外抗肿瘤活性研究

采用mtt法测量两种金观音茶精华(根据实施例3得到的两种金观音茶提取物分别添加食品添加剂得到金观音夏茶和秋茶精华)对四种人恶性肿瘤细胞(mda-mb-231人乳腺癌细胞、sw480人结肠癌细胞、hela人宫颈癌细胞、hepg2人肝癌细胞)以及正常细胞(l02人肝细胞和wi38人肺细胞)的生长抑制的方法(所用肿瘤细胞和正常细胞购于美国模式培养物集存库)，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华分别溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪上超声1～2min，制备5mg/ml储备溶液备用；

(2)取对数生长期的不同肿瘤细胞和正常细胞以密度为2×10⁴cells/ml接种于96孔板中(100μl/孔)，使其贴壁生长24小时。再分别加入步骤(1)中的不同终浓度药物100μl，继续培养72h。细胞出现一定损伤程度后，每孔加入25μl的mtt溶液(5mg/ml，pbs溶液)，孵育4小时。接着，抽走96孔板中的上层培养液(dmem高糖培养基，gibco)，加入150μldmso(二甲基亚砜)，于摇床上轻轻摇动15分钟，使96孔板中的紫色结晶物充分溶解。接着用多功能酶标仪测量570nm下各孔的吸光值，并计算细胞存活率，同时作图以求得半数抑制浓度(ic50)。细胞存活率(％)＝(od570实验组/od570对照组)×100％。然后加入mtt(5mg/ml)20μl/孔，5h后弃上清液，加入二甲基亚砜(dmso)150μl/孔，振荡10min左右，置于酶标仪测定od值，波长为570nm。计算细胞存活率，并求得半数抑制浓度(ic50)。

(3)实验结果：如图1所示，两种金观音茶精华呈现良好的抗肿瘤活性。其中，mda-mb-231乳腺癌细胞对两种金观音茶精华最为敏感，ic50分别为61.89μg/ml(夏茶)，76.33μg/ml(秋茶)。值得一提的是，sw480人结肠癌细胞对秋茶也相当敏感，其ic50低至48.66μg/ml。而对正常细胞(l02)而言，金观音茶精华则没有明显的毒性作用。金观音茶精华对l02半数抑制浓度高达163.55μg/ml(夏茶)和186.39μg/ml(秋茶)。以上结果表明，金观音茶精华在体外能发挥优良的抗肿瘤活性，且对正常细胞无明显的毒性作用。

实施例6两种金观音茶精华对肿瘤细胞周期分布的影响

采用流式细胞分析术分析两种金观音茶精华对人乳腺癌mda-mb-231和人结肠癌sw480细胞的周期分布影响，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪上超声1～2min，制备5mg/ml储备溶液备用；

(2)将mda-mb-231和sw480接种于6ml培养皿中(细胞密度为2×10⁴/ml)，待细胞完全贴壁后，分别加入不同终浓度(0、15、30、60μg/ml)的两种金观音茶精华，孵育72h，收集细胞，用预冷的70％乙醇置于～20℃固定过夜。去掉上清离心，倒立扣干，加入500μlpi避光染色30min，用beckman流式细胞仪检测细胞周期，确保细胞数目不少于10000个。用multicycle软件分析细胞周期分布。

(3)实验结果如图2和图3，金观音夏茶和秋茶精华通过诱导细胞凋亡来抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的生长，而通过诱导其g2/m周期阻滞来抑制sw480结肠癌细胞的生长，这说明金观音夏茶和秋茶精华可通过不同的作用机制来打乱肿瘤细胞的生长周期分布，使其处于一种功能紊乱的非正常生理状态，以此达到抗肿瘤的目的。

实施例7dhe探针检测细胞内活性氧(ros)水平

ros主要包括超氧阴离子(o2·^-)、过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(ho·)，采用dhe探针检测两种金观音茶精华分对人乳腺癌mda-mb-231细胞内活性氧(ros)水平影响的方法，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪上超声1～2min，制备30μg/ml溶液备用。

(2)取对数生长期的mda-mb-231细胞接种于96孔板(密度为2×10⁴/ml，100μl/孔)，待细胞24h贴壁后，分别加入浓度为30μg/ml的两种金观音茶精华孵育2h，抽掉每孔中的培养基，加入dhe探针，继续培养30min。于多功能荧光酶标仪上检测吸光度(激发和射波长分别为300nm和610nm)。同时用荧光显微镜实时监测细胞中dhe荧光强度，并拍取荧光照片。

(3)实验结果如图4，金观音夏茶和秋茶精华处理后mda-mb-231乳腺癌细胞内ros水平的降低程度与药物浓度呈正比，且在加入金观音夏茶和秋茶精华15min内下降至最低为48.56％(60μg/ml夏茶)，25.19％(60μg/ml秋茶)。随后缓慢回升，然而，同浓度的金观音夏茶引起细胞内ros下降的程度要低于金观音秋茶，当两种茶精华的浓度均为60μg/ml时，夏茶对ros产生水平稳定在58.63％，而秋茶对ros产生水平稳定在35.96％。浓度同为30μg/ml的金观音夏茶和秋茶处理不同后的mda-mb-231乳腺癌细胞细胞荧光成像(图4c)也证明了这一结果，金观音夏茶处理的mda-mb-231乳腺癌细胞细胞内产生更强的荧光强度，即金观音秋茶能够更有效地抑制mda-mb-231乳腺癌细胞细胞内ros活性氧水平。

实施例8两种金观音茶精华对肿瘤细胞内caspase活性影响

一种采用三种caspase底物测量经过两种金观音茶精华对人乳腺癌细胞mda-mb-231的caspase-3/8/9蛋白表达的水平影响的方法，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪上超声1～2min，制备30μg/ml溶液备用；

(2)取对数生长期的mda-mb-231细胞接种于10cm培养皿(密度为10×10⁴/ml，10ml/皿)，待培养24h到贴壁。然后加入浓度为30μg/ml的两种金观音茶精华，继续培养72h，然后收集所有蛋白，通过bca法测定蛋白浓度。100μg细胞蛋白和三种caspase底物在37℃避光孵育2h。于多功能荧光酶标仪检测荧光吸收值(激发和射波长分别为380nm和460nm)，计算caspase-3，caspase-8和caspase-9底物的被激活的程度(％)。

(3)实验结果如图5，经金观音夏茶和秋茶(30μg/ml)处理后，mda-mb-231乳腺癌细胞内caspase-3，caspase-8和caspase-9水平有明显升高，这说明无论是死亡受体介导还是线粒体介导均有参与诱导细胞凋亡。其中，夏茶和秋茶精华对caspase-9的激活程度达到146.89％和201.36％，明显要比其对caspase-8的活性程度影响大。因此，线粒体在caspase家族介导的细胞凋亡中具有重要的的作用。

实施例9两种金观音茶精华对肿瘤细胞内线粒体损伤破坏作用

一种采用荧光染色以及拍照的技术对经过两种金观音茶精华处理过后人体乳腺癌细胞mda-mb-231线粒体形貌的影响的方法，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华溶于pbs缓冲溶液中，于超声仪上超声1～2min，制备30μg/ml溶液备用；

(2)取对数生长期的mda-mb-231细胞接种于2cm玻璃皿(密度为4×10⁴/ml，2ml/孔)，培养24h后，加入浓度为30μg/ml的两种金观音茶精华孵育3h，100nmmito-tracker(红色)标记线粒体2h，1μg/mlh33342标记细胞核染色15min，然后利用荧光显微采集加药处理6h和12h的荧光图片(放大倍数：100×)。

(3)实验结果见图6，红色探针mito-tracker用于标记线粒体，0h时，线粒体处于正常生理状态，呈丝状，自然伸展贯穿于整个细胞质；经金观音夏茶和秋茶精华处理6h后，线粒体出现断裂的迹象；而当金观音夏茶和秋茶精华处理12h后，线粒体进一步裂解成碎片，呈现点状分布，形貌发生巨大变化。综上，金观音夏茶和秋茶精华都对mda-mb-231乳腺癌细胞内线粒体具有明显的破坏作用，造成了线粒体功能的紊乱，激活线粒体介导的内源性凋亡通路，继而引起了细胞凋亡。

实施例10金观音夏茶精华的体内抗肿瘤活性评价

进一步检测金观音茶精华抑制体内肿瘤形成以及生长的方法，主要包括如下步骤：

(1)将金观音夏茶精华和对照品环磷酰胺溶于生理盐水中，配成溶液备用；

(2)将检疫合格的60只小鼠(所用小鼠为balb/c-nu裸鼠，4周龄，体重为20±1g。所购动物来自北京华阜康生物科技股份有限公司scxk(京)2014-0004)随机分为4组：阴性对照组，环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg)，金观音夏茶精华提前干预高浓度组(3g/kg)组，金观音夏茶精华提前干预低浓度组(1.5g/kg)，各15只。

(3)给药方法：阴性对照组：剂量0mg/kg。即每只小鼠用生理盐水灌胃0.2ml/d，处理24天。环磷酰胺阳性对照组：剂量40mg/kg，每只小鼠在肿瘤接种后5天开始腹腔注射0.4ml/d，隔5天注一次药，处理到种瘤后24天。金观音夏茶精华提前干预高剂量组：第一个剂量3g/kg，每只小鼠在肿瘤接种前5天开始灌胃0.2ml/d，处理到种瘤后24天。第二个剂量1.5g/kg，每只小鼠在肿瘤接种前5天，灌胃0.2ml/d，处理到种瘤后24天。

(4)对于体内抗肿瘤活性评价，实验结果见图7a，从小鼠的体重变化图可以看出，各组裸鼠经给药处理后，体重无明显下降。表示药物在发挥抗肿瘤作用时对小鼠正常的生活状态无明显影响，小鼠仍然健康生长。另外，从肿瘤形成的前14天看(图7b)，金观音夏茶精华提前干预组的肿瘤生长相对于其他组较慢，例如在肿瘤后5天，提前干预高浓度组的瘤体积是115mm³，低浓度的为128mm³，而其他处理组均在180mm³左右。以上结果表明，金观音夏茶精华能够在肿瘤快速增长之前有效抑制肿瘤的形成，达到良好的预防功效。

(5)通过检测荷瘤移植裸鼠以及各处理组相关的血液生化指标，分析各指标与正常裸鼠差异的变化，评估这两种金观音茶叶水提取物能否减小肿瘤移植对小鼠各正常组织如心、肝、脾、肺和肾等的损伤，提高免疫力，改善肿瘤病人的生存状况。通过分析各项血液指标数据，我们发现荷瘤小鼠中的阴性和阳性对照组的小鼠肝、肾均出现了损伤，而金观音夏茶精华提前干预组的小鼠趋于正常，并且能够大大提高小鼠的免疫能力，改善其生存状况。如图8所示，经金观音夏茶精华处理的裸鼠肝、肾、血脂的功能指标都有一定程度的恢复，基本与健康裸鼠相近。例如，从裸鼠血脂的相关指标看(图8d)，荷瘤裸鼠的高密度脂蛋白(hdl-c)值都明显低于健康裸鼠的指标，其中经环磷酰胺组低至0.942mmol/l，远低于健康组指标(1.4mmol/l)。然而经夏茶精华提前干预处理，其指标可保持在1.4mmol/l，说明金观音夏茶精华对裸鼠血脂具有一定改善作用。另外，从肝的相关指标看(图8b、c)，经夏茶精华提前干预的裸鼠的总蛋白(tp)和白蛋白(alb)值均与正常健康裸鼠的指标水平一致；而单独荷瘤裸鼠以及环磷酰胺处理的裸鼠，其肝功能指标都出现了明显下降，说明裸鼠的肝脏受到了严重创伤。以上结果表明，金观音夏茶精华在发挥优良抗肿瘤作用时并不会对裸鼠的正常生理状态产生明显影响，无明显毒副作用伴随，甚至能改善荷瘤裸鼠的生活状态，提高其生活质量。

实施例11两种金观音茶精华中儿茶素类和茶黄素类物质的含量测定

通过高效液相色谱法检测两种金观音茶精华中儿茶素类和茶黄素类物质的含量，包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华按照gb/t8313-2008国标中的茶叶中儿茶素含量的检测方法提取茶中儿茶素类和茶黄素类物质，提取液备用；

(2)将步骤(1)中的提取液和15种儿茶素和茶黄素类标准样品(溶于20％(v/v)乙腈溶液)注入到250mm的硅胶色谱柱内，其中流动相由溶剂a(乙腈)和溶剂b(0.4％(v/v)的水磷酸)组成。流动相a的比例变化按照以下顺序:0～13min(7～15％)，13～35min(15～20％)，35～70min(20～50％)，70～90min(50～80％)，90～115min(80～7％)。流动相流速为1.0ml/min，色谱柱流出物的紫外检测波长为278nm。

(3)实验结果：见表1和图9，如表1所示，两种金观音干茶水提取物经色谱分析鉴定，其中主要成分儿茶素类物质被最大程度保留下来，而茶黄素类物质含量相较于儿茶素类物质的含量而言较少，其中，茶多酚在夏茶中的含量为23.60g/100g，在秋茶中为16.8g/100g(以干基计)。表中，a：腺嘌呤；ga：没食子酸；gc：没食子儿茶素；tl(theophylline)：茶碱；egc：表没食子儿茶素；c：(+)儿茶素；ca(caffeine)：咖啡因；ec：(-)表儿茶素；egcg：表没食子儿茶素没食子酸酯；ecg：表儿茶素没食子酸酯；cg：儿茶素没食子酸酯；tf1：茶黄素-3-没食子酸酯；tf2：茶黄素-3'-没食子酸酯；tf3：茶黄素-3,3'-双没食子酸酯；tf4：茶黄素。

此外，从表1可以比较出，c，cg，ec，ecg，egc，egcg等6种儿茶素类物质含量，总体来说其在夏茶中的含量高于在秋茶中。其中，egc在夏茶中含量为2.977％，在秋茶中为0.594％，相差5倍左右。而茶黄素类物质在金观音水提取物中含量偏少，其中tf4在夏茶中含量为0.150％，而在秋茶中含量低于检测线。

表1两种金观音茶精华中活性物质的定量分析

实施例12两种金观音茶精华的体外清除自由基的能力评价

采用两种自由基测试剂(abts·⁺和dpph·)评价两种金观音茶精华在体外清除自由基能力的方法，主要包括如下步骤：

(1)将两种金观音茶精华分别溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪超声1～2min，制备100μg/ml溶液备用；

(2)取步骤(1)中的溶液0.1ml，与0.1ml的abts试剂混合，另外将标准抗氧化剂trolox进行同样的处理。用紫外-可见分光光度仪测量了混合溶液在734nm处的紫外吸光度，并计算了半抑制浓度(ic50)，以评估两种金观音茶精华在体外的清除自由基能力。

(3)将两种金观音茶精华分别溶于pbs缓冲溶液中，置于超声仪超声1～2min，制备200μg/ml储液备用；

(4)取步骤(3)中的溶液0.1ml，与0.1ml的dpph试剂混合，将标准抗氧化剂trolox进行同样的处理。于紫外-可见分光光度仪测量了混合溶液在515nm处的紫外吸光度，并计算了半抑制浓度(ic50)，以评估两种金观音茶精华在体外的清除自由基能力。

(5)实验结果见图10，采用紫外分光光度计测定两种不同金观音茶精华清除abts和dpph自由基的功效(体外抗氧化能力)，并与标准抗氧化剂trolox进行功效对比，在这两种金观音茶精华中，秋茶的抗氧化活性相对较强，其对两种自由基半清除浓度仅为21.93μg/ml和44.59μg/ml，表明其能够有效清除自由基，具有相对良好的体外抗氧化活性，夏茶也有良好的抗氧化活性，能在一定程度上有效地抑制abts和dpph自由基产生。值得一提的是，两种金观音茶精华对于水溶性自由基(abts·⁺)的抑制率明显高于脂溶性自由基(dpph·)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。