一种靶向纳米微球的制备方法与流程

本发明属于纳米医学技术领域，具体地说，涉及一种靶向纳米微球的制备方法。

背景技术：

肿瘤靶向给药系统是肿瘤治疗的重要组成部分，它可将有效抗癌药物专一性或选择性地输送到肿瘤组织，控制特定生理部位的药物剂量，从而降低抗癌药对非靶点部位的副作用和毒性。

我国海洋资源丰富、海洋生物是药物的宝库。从海洋中寻找低毒高效的抗肿瘤药物是目前研究的热点。我们研究发现钝顶螺旋藻富集了藻蓝蛋白、多糖、β-胡萝卜素等人体所需的多种营养成分和生物活性物质，被世界粮农组织誉为“21世纪超级保健品”。其中藻蓝蛋白(c-phycocyanin，c-pc)含量高达60-70％，是一种重要的天然光合色素，能高效捕获光能，是一种理想的光敏剂。因其安全、无毒、水溶性强、清亮且着色力强等优点，藻蓝蛋白作为天然色素被广泛应用于食品化妆品、染料等工业。藻蓝蛋白发出紫色荧光，可用作荧光标记物，在波长620nm有特异性吸收峰。藻蓝蛋白的药用价值极高，具有抗衰老、抗氧化、抗辐射、抗疲劳、降低血脂等医疗保健功能。因此，如何设计出安全、有效和稳定的转运藻蓝蛋白的新型靶向给药系统是当今面临的一个重大难题。

近几年来，随着纳米技术的飞速发展，纳米颗粒的制备技术被引入壳聚糖-蛋白质药物载体的应用领域。壳聚糖(chitosan，cts)是甲壳素脱乙酰化的产物，是一种丰富的天然高分子化合物，化学名称为聚2-氨基-2-脱氧-β-葡萄糖。壳聚糖具有无毒、生物相容性、吸附性、生物可降解性等多种优异性能，并具有直接抑制肿瘤细胞、抗菌消炎、促进伤口愈合及抗酸抗溃疡的作用。羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan，cmc)是壳聚糖的衍生物，是将-ch2cooh接到壳聚糖的-nh2或者-oh上，既含有阳离子(-nh3⁺)又含有(-coo^-)基团。羧甲基壳聚糖水溶性更好，可作为良好的药物载体材料应用于医药领域。研究发现一些天然药物如紫杉醇、喜树碱类药物都可吸附于壳聚糖微球中从而可将该药物有效地运载到实体瘤中，达到缓释和长效的作用，并可明显抑制肿瘤的生长。我们选择羧甲基壳聚糖为基质，包埋天然海洋药物藻蓝蛋白制成纳米微球，探索其对肿瘤细胞的靶向性和药效。该研究实现了藻蓝蛋白的缓释靶向给药，为肿瘤的靶向治疗提供了新思路。

为提高抗肿瘤药物的特异性和靶向性，国内外学者力求寻找与肿瘤逃逸相关的抗原，结果发现cd40，her-2和egfr等在多种肿瘤中均高表达。本课题组前期预实验发现在多种实体瘤中如结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等均有cd59基因的过表达，而在正常细胞表达量较少(①lib,gaom,chux,xuy,yangf.identificationofanovelshortpeptidesealspecifictocd59anditseffectsonhelacellgrowthandapoptosis.cellularoncology,2012,35(5):355-365；②lib,gaomh,chuxm.molecularmechanismofanovelcd59-bindingpeptidesp22inducedtumorcellsapoptosis.journalofcellularbiochemistry.113:3810-3822)。高表达cd59分子具有抑制补体膜攻击复合物(mac)形成，从而使肿瘤细胞可以逃逸免疫系统的杀伤作用。cd59分子已成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗的新靶点。因此寻找有效的可与肿瘤细胞表面cd59特异性结合的多肽势在必行，从而实现对靶向药物的定向投放。本研究通过噬菌体肽库展示技术筛选cd59特异性配体肽(cd59specificligandpeptide,cd59sp)，并将其连接到羟甲基壳聚糖分子上，通过它与肿瘤细胞表面cd59的特异性识别结合，以实现抗肿瘤药物的靶向投放。

在制备靶向纳米微球的过程中存在以下问题：1)藻蓝蛋白的纯度偏低，影响效果；2)载药率约为20％，偏低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种靶向纳米微球的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种靶向纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将藻蓝蛋白(c-pc)溶于双蒸水中，在涡旋振荡器上充分混匀，得到c-pc溶液；

步骤2、制备藻蓝蛋白-羧甲基壳聚糖纳米微球(c-pc/cmc-nps)，将羧甲基壳聚糖(cmc)溶于双蒸水中，在磁力搅拌器搅拌溶解，再将步骤1制备得到的c-pc溶液逐滴滴入烧杯中，逐滴加入cacl2溶液，选取合适时间的搅拌后，制得c-pc/cmc-nps混悬液；

步骤3、靶向纳米微球的制备：取c-pc/cmc纳米微球重悬于pbs中，充分混匀，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，调ph＝5.6，室温搅拌，离心，除去未反应的edc，重悬在pbs，加入1mg/ml的fitc标记的cd59配体肽(cd59specificligandpeptide，cd59sp)，搅拌过夜，离心除去未结合的cd59sp，重悬于pbs中，4℃保存，制备得到纳米微球。

进一步地，所述步骤1中的c-pc溶液的浓度为1-100μg/ml。

进一步地，所述步骤2中的cmc的浓度为1-3mg/ml；cmc溶液与c-pc溶液的质量比为1:1-5:1；cacl2溶液的浓度为1-3mg/ml。

进一步地，所述步骤3中的c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量比为1:12；c-pc/cmc纳米微球与edc的质量比为5:1-5:3。

进一步地，所述步骤3中的搅拌时间为45min-75min；离心时间为5-15min，离心转速为7500-9500rpm。

进一步地，所述步骤3中的c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明首次采用天然海洋药物藻蓝蛋白为核心、羟甲基壳聚糖为载体、cd59配体肽为导向、肿瘤细胞为靶标构建新型fitc-cd59sp-cmc/c-pc复合纳米微球。

2)本发明率先采用可视动态免疫学方法利用激光共聚焦显微镜跟踪追击新型fitc-配体肽-羟甲基壳聚糖/藻蓝蛋白复合纳米微球的路径，确定它的特异靶标作用。

3)本发明利用cd59配体肽的靶向性，壳聚糖的可降解性，藻蓝蛋白低毒高效性、纳米微球的穿透性，构建四维一体的新型靶向药物，进行肿瘤的综合靶向治疗。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明c-pc/cmc纳米微球透射电镜图；

图2是本发明cmc纳米微球粒径分布；

图3是本发明c-pc/cmc纳米微球粒径分布；

图4是本发明c-pc、cmc-nps和c-pc/cmc-nps红外光谱图；

图5是本发明c-pc/cmc纳米微球在不同ph条件下c-pc的释放曲线；

图6是本发明不同浓度的c-pc、c-pc/cmc-nps和c-pc/cmc-cd59sp-nps与红细胞共同孵育后的图像；

图7是本发明不同药物浓度下的溶血率；

图8是本发明mtt实验(a)正常l929细胞活性；(b)hela细胞活性；(c)l929细胞和hela细胞在c-pc/cmc-cd59sp–nps作用下的死亡率；

图9是本发明靶向纳米微球作用于l929和hela细胞的共聚焦显微镜的荧光图片，其中，a，b，c分别是作用于l929细胞1、2、4h；(d)作用于hela细胞1h；

图10是本发明靶向纳米微球作用于hela细胞的共聚焦显微镜的荧光图片，其中，a、b、c分别是作用于hela细胞1、2、4h；

图11是hela细胞bcl-2蛋白的表达水平，其中，(a)免疫荧光结果，(b)各组iod值，*p<0.05，**p<0.01与对照组相比；

图12是本发明westernblot检测hela细胞中cleavedcaspase-3/parp蛋白的表达量(a)westernblot的电泳图片；(b)目的蛋白灰度比值*p<0.05，**p<0.01与对照组相比；

图13是本发明hela细胞凋亡图片，其中，a:藻蓝蛋白，b:fitc，c:合成，d:白光)。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种靶向纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将藻蓝蛋白(c-pc)溶于双蒸水中，在涡旋振荡器上充分混匀，得到1-100μg/ml的c-pc溶液；

步骤2、制备藻蓝蛋白-羧甲基壳聚糖纳米微球(c-pc/cmc-nps)，将羧甲基壳聚糖(cmc)溶于双蒸水中，其中，cmc的浓度为1-3mg/ml；在磁力搅拌器搅拌溶解，再将步骤1制备得到的c-pc溶液逐滴滴入烧杯中，其中，cmc溶液与c-pc溶液的质量比为1:1-5:1，逐滴加入浓度为1-3mg/ml的cacl2溶液，选取合适时间的搅拌后，制得c-pc/cmc-nps混悬液；

因为藻蓝蛋白易发生降解，以上操作尽量避光低温下进行。

步骤3、靶向纳米微球的制备：取c-pc/cmc纳米微球按照质量比为1:12重悬于pbs中，充分混匀，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，其中，c-pc/cmc纳米微球与edc的质量比为5:1-5:3，调ph＝5.6，室温搅拌45min-75min，7500-9500rpm离心5-15min，除去未反应的edc，重悬在pbs，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，加入1mg/ml的fitc标记的cd59配体肽(cd59specificligandpeptide，cd59sp)，搅拌过夜，离心除去未结合的cd59sp，重悬于pbs中，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，4℃保存，制备得到纳米微球。

实施例1

步骤1、将藻蓝蛋白(c-pc)溶于双蒸水中，在涡旋振荡器上充分混匀，得到1-100μg/ml的c-pc溶液；

步骤2、制备c-pc/cmc-nps，将羧甲基壳聚糖(cmc)溶于双蒸水中，其中，cmc的浓度为2mg/ml；在磁力搅拌器搅拌溶解，再将步骤1制备得到的c-pc溶液逐滴滴入烧杯中，其中，cmc溶液与c-pc溶液的质量比为3:1，逐滴加入浓度为1.0mg/ml的cacl2溶液，选取合适时间的搅拌后，制得c-pc/cmc-nps混悬液；

步骤3、靶向纳米微球的制备：取c-pc/cmc纳米微球5mg重悬于pbs中，充分混匀，加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，调ph＝5.6，室温搅拌1h，8500rpm离心10min，除去未反应的edc，重悬在1mlpbs，加入1mg/ml的fitc标记的cd59sp，搅拌过夜，离心除去未结合的cd59sp，重悬于1ml的pbs中，4℃保存，制备得到纳米微球。

其包封率约为65％，载药率约为20％。

本实施例1制备出c-pc/cmc-nps，由于cd59在多种实体瘤表面高表达，以此为靶点，选择cd59sp作为靶向分子。通过edc的活化，将其偶联在c-pc/cmc-nps上，制备成靶向纳米微球。edc可以活化o-cmc的羧基，形成酰胺键，直接与氨基反应。

实施例2

一种靶向纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将藻蓝蛋白(c-pc)溶于双蒸水中，在涡旋振荡器上充分混匀，得到1μg/ml的c-pc溶液；

步骤2、制备藻蓝蛋白-羧甲基壳聚糖纳米微球(c-pc/cmc-nps)，将羧甲基壳聚糖(cmc)溶于双蒸水中，其中，cmc的浓度为3mg/ml；在磁力搅拌器搅拌溶解，再将步骤1制备得到的c-pc溶液逐滴滴入烧杯中，其中，cmc溶液与c-pc溶液的质量比为1:1，逐滴加入浓度为3mg/ml的cacl2溶液，选取合适时间的搅拌后，制得c-pc/cmc-nps混悬液；

因为藻蓝蛋白易发生降解，以上操作尽量避光低温下进行。

步骤3、靶向纳米微球的制备：取c-pc/cmc纳米微球按照质量比为1:12重悬于pbs中，充分混匀，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，其中，c-pc/cmc纳米微球与edc的质量比为5:1，调ph＝5.6，室温搅拌75min，7500rpm离心15min，除去未反应的edc，重悬在pbs，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，加入1mg/ml的fitc标记的cd59配体肽(cd59specificligandpeptide，cd59sp)，搅拌过夜，离心除去未结合的cd59sp，重悬于pbs中，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，4℃保存，制备得到纳米微球。

实施例3

一种靶向纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将藻蓝蛋白(c-pc)溶于双蒸水中，在涡旋振荡器上充分混匀，得到100μg/ml的c-pc溶液；

步骤2、制备藻蓝蛋白-羧甲基壳聚糖纳米微球(c-pc/cmc-nps)，将羧甲基壳聚糖(cmc)溶于双蒸水中，其中，cmc的浓度为1mg/ml；在磁力搅拌器搅拌溶解，再将步骤1制备得到的c-pc溶液逐滴滴入烧杯中，其中，cmc溶液与c-pc溶液的质量比为5:1，逐滴加入浓度为1mg/ml的cacl2溶液，选取合适时间的搅拌后，制得c-pc/cmc-nps混悬液；

因为藻蓝蛋白易发生降解，以上操作尽量避光低温下进行。

步骤3、靶向纳米微球的制备：取c-pc/cmc纳米微球按照质量比为1:12重悬于pbs中，充分混匀，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，其中，c-pc/cmc纳米微球与edc的质量比为5:3，调ph＝5.6，室温搅拌45min，9500rpm离心5min，除去未反应的edc，重悬在pbs，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，加入1mg/ml的fitc标记的cd59配体肽(cd59specificligandpeptide，cd59sp)，搅拌过夜，离心除去未结合的cd59sp，重悬于pbs中，c-pc/cmc纳米微球与pbs的质量体积比(g/ml)为5:1，4℃保存，制备得到纳米微球。

下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：

将载有藻蓝蛋白的羧甲基壳聚糖纳米微球混悬液于冷冻离心机上，在4℃条件下，12000rpm离心20min。纳米微球经洗涤后，置于冷冻干燥机中过夜，干燥后称重。上清液加双蒸水至一定体积，其中藻蓝蛋白含量以标准曲线法用荧光分光光度计，于激发光590nm/发射光44nm处测定荧光强度(在此波长下除藻蓝蛋白其他物质无荧光激光)，所有荧光强度实值以相同条件下制备的空白羧甲基壳聚糖纳米微球离心后的上清液为参比，实验重复5次取平均值。

纳米微球中藻蓝蛋白的包封率(ee)与载药量(dl)按以下公式计算：

包封率(ee)指纳米微粒中药物量与投药量之比。

包封率＝(w总-w上清)/w总×100％1-(1)

载药量(dl)指纳米微球中药物的质量分数。

载药量＝(w总-w上清)/w纳米球×100％1-(2)

其中w总代表初始加入的c-pc量，w上清代表游离的c-pc量，w纳米球代表c-pc/cmc纳米微球的量。

一、透射电镜检测：

取c-pc/cmc-nps悬液，于超声波清洗仪中超声分散10min，然后用微量滴管将分散均匀的样品滴在铜网上，让其沉降10min，滤纸吸去多余的液体，使其充分干燥后，在电镜下观察纳米微球形态。

图1为载药c-pc/cmc纳米微球的透射电镜图，纳米微球呈现出规则的球形，分散均匀，其粒径约为120nm。

二、激光粒度仪检测

纳米粒径用马尔文仪器公司mastersizer2000激光粒度分析仪测定。取c-pc/cmc-nps混悬液适量，用双蒸水稀释至合适浓度，激光粒度分析仪测定粒径大小。

图2和图3为空载cmc和载药c-pc/cmc纳米微球在激光粒度仪测量下的粒径分布，其分别约为220nm和200nm，分散系数小于0.3。电镜和激光粒度仪，两种粒径测量结果的不同，可能是由于测量介质的不同，电镜的样品需要干燥，导致纳米微球的脱水，使其粒径变小，而激光粒度仪是在溶液中测量的。同时，载药纳米微球粒径相对空载纳米微球的粒径较小，其原因可能是由于c-pc的加入，改变了cmc内部的电荷，使其内部结合的更为紧密，从而减小了粒径的大小。

三、红外光谱仪检测

取适量kbr粉末和已干燥好的待测纳米粒子混合后，研磨至粉末状，然后将其进行压片至透明，于红外光谱仪中检测，扫描范围500-4000cm^-1。

经分析测定c-pc、cmc-nps、c-pc/cmc-nps的红外光谱，结果(图4)所示，相比cmc-nps和c-pc，c-pc/cmc-nps表面的化学键在1364cm^-1处发生了变化，可能形成了氢键，说明cmc与c-pc发生交联反应，导致了化学键的变化。

四、药物体外释放实验

采用透析扩散法研究药物体外缓释的动力学，由于人体正常ph在7.4，而肿瘤细胞一般ph偏酸性，因此对ph＝7.4和5.4条件下进行研究。将含2mg的纳米微球的重悬液放置在透析袋中，并放入含有10mlpbs的离心管中，37℃水平恒温振荡器上，以恒定速度进行释放。分别在1，4，8，12，24，48，120h时，取出袋中的10mlpbs，于激发光590nm/发射光44nm处测定荧光强度，补全离心管中pbs体积。根据标准曲线法用荧光强度计算出释放的c-pc量，得出累计释放率，绘制释放曲线。

图5展示了c-pc/cmc纳米微球在不同ph条件的pbs缓冲液中的释药情况，药物总体实现了缓释的效果。由于人体微环境的ph接近中性，而肿瘤细胞微环境偏向酸性，因此选择ph7.4和ph5.4。两种缓释曲线均显示出三个阶段：在最初的6h内，快速释放，称为突释阶段，主要为吸附在微球表面的药物的释放；接着到80h，缓慢释放过程，由于载体材料的降解，释放出包埋在内部的药物；最后呈现出平稳的释放过程。最终在120h内，在ph5.4和ph7.4条件下，释放率分别达到80％和60％。与此同时，药物的释放也表现出ph敏感性，在偏酸性环境下释放的更多，也有利于药物在肿瘤细胞中的释放，实现对肿瘤的治疗。

五、药物安全性评价

溶血实验分组：阳性对照组(triton-x-100处理)、阴性对照组(pbs处理)、c-pc组(c-pc溶液)、c-pc/cmc-nps组(非靶向纳米药物)、c-pc/cmc-cd59sp-nps(靶向纳米药物)。

将新鲜人体全血用0.9％氯化钠溶液稀释10倍，轻轻混匀，避免红细胞破裂，1500rpm离心5min，去上清。沉淀物用0.9％氯化钠溶液洗涤3次，制成5％细胞悬液。每组1ml的细胞悬液中加入0.4ml不同浓度的药物(1.00，0.05，0.10，0.05，0.02，0.01mg/ml)，37℃水浴摇床孵育2h，然后3000rpm离心10min，取上清。在540nm下检测吸光值，计算溶血率。计算公式为：

溶血率(％)＝(od样品-od阴性对照)/(od阳性对照-od阴性对照)

1-(3)

其中od样品、od阳性对照、od阴性对照分别代表药物处理组、triton-x组、pbs组吸光值。

药物通过血液到达肿瘤细胞，因此评估药物在血液中的安全性极为重要。溶血测定以溶血值来表示，值越低表明越安全。如图6清楚地显示出各个药物组没有明显的溶血现象。溶血值通过测定540nm下的od值来表示，如图7显示：在高浓度下，溶血值依旧低于5％，表明纳米微球是安全的。

六、纳米微球抑制细胞的增殖：

一)四组：

(1)对照组：无药物处理；

(2)c-pc组：仅以c-pc处理；

(3)非靶向纳米药物组：c-pc/cmc-nps处理；

(4)靶向纳米药物组：c-pc/cmc-cd59sp处理。实验中药物浓度为该药物1/2ic50值，药物和培养液加入体积比为1:1。

本发明将c-pc，c-pc/cmc-nps，c-pc/cmc-cd59sp-nps在不同浓度作用下对l929和hela细胞的抑制情况。如图8(a，b)均表明可以抑制细胞的生长，并与浓度呈正相关，靶向性纳米微球的抑制效果高于其余组，抑制作用更为明显。与正常细胞相比(图8c)，各个浓度下的药物均展示出更高的毒性，尤其是靶向纳米微球。同时计算出c-pc、c-pc/cmc-nps、c-pc/cmc-cd59sp-nps作用于hela细胞时的最佳抑制浓度ic50值分别是155.20、58.08、21.46μg/ml。因此，研究表明c-pc的抗癌效果在纳米微球被保留并通过靶向纳米微球得到进一步的增强。

二)共聚焦显微镜检测纳米微球的摄入

藻蓝蛋白自带红色荧光，通过共聚焦显微镜观察纳米微粒在细胞内摄入情况。

(1)取生长旺盛细胞，消化，制成细胞悬液，调整细胞密度；

(2)在24孔板里进行细胞爬片；

(3)第二天，倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况及细胞生长状态，加靶向性c-pc/cmc-cd59sp纳米微球与细胞共同孵育，每孔200μl药物；

(4)加药后1、2、4h，pbs轻轻冲洗爬片3min×2次，观察细胞的荧光强度。

运用共聚焦显微镜研究了细胞对纳米微球的靶向摄取情况，如图9所示，c-pc/cmc-cd59sp靶向纳米微球，在细胞质和细胞核中都有分布，说明细胞吸收的药物并不是粘附在细胞表面而是摄入到细胞内部。这可能是在cd59配体肽的引导下，通过其与细胞表面cd59特异性结合，使得靶向纳米微球大量聚集在细胞表面，然后内吞作用摄入细胞内。同时，我们还可以发现，l929细胞的摄取效率低于hela细胞。图9(a，b，c)所示分别是l929细胞在1、2、4h时所摄取药物的荧光图片，由图可看出，在4h时纳米微球依旧在细胞质中，只有少数到达了细胞核，而图9(d)显示出hela细胞在1h时，药物就已经大量聚集在细胞核，细胞核是维持生命和种属延续的核酸及其核蛋白系统的存在部位，对各种因子及药物反应最为敏感，因此靶向纳米微球对正常细胞l929的毒性会更小，对hela细胞的作用会更为明显。

同时，也对hela细胞在不同时间内摄入的药物进行观察(如图10所示)，细胞核用dapi染色，显示蓝色荧光，c-pc显示出自带的红色荧光，从图中可以看出随着药物作用时间增加，所显示荧光强度也不断增加。如图2.8a作用了1h的细胞，荧光强度明显低于4h，我们也发现在4h的细胞中，红色荧光并非均匀的分布在细胞中，而是在有部分聚集，这表明药物是有选择性的，并非被动的摄入，所以c-pc/cmc-cd59sp纳米微球实现了对hela细胞的靶向递送药物，并且是时间依赖性的。

三)免疫荧光法检测bcl-2蛋白的表达

(1)细胞爬片及固定；

(2)用3％h2o2溶液室温处理10min，pbs冲洗3min×3次；

(3)细胞用5％bsa封闭液，室温封闭30min，甩掉片子上的液体，不洗；

(4)滴加稀释得到兔抗bcl-2的一抗，将盖玻片放于湿盒中，4℃冰箱中孵育过夜；

(5)湿盒于室温静置20min，pbs缓冲液洗5min×3次；

(6)滴加fitc标记的羊抗兔二抗于盖玻片上，37℃避光反应30min，pbs缓冲液洗5min×3次；

(7)用抗荧光淬灭封片液封片，观察绿色荧光强度；

(8)ipp软件分析细胞中蛋白的表达量，以iod值作为量化指标。

bcl-2被称为存活蛋白，通过阻止细胞色素c从线粒体中的释放来抑制细胞的凋亡。如图11所示，与对照组相比，其余各组的表达量均有明显的下降，而靶向纳米微球组更为明显，表明c-pc和c-pc/cmc-nps组都可以抑制bcl-2的表达，c-pc/cmc-cd59sp-nps组的抑制作用更为明显，从而阻止线粒体中细胞色素c的释放，因而胞浆中的细胞色素c含量增加，进而促进细胞凋亡的发生。

七、westernblot检测cleavedcaspase-3/parp蛋白的表达

药物作用后，westernblot检测各组cleavedcaspase-3/parp蛋白表达水平，如图12所示。与对照组相比，c-pc和c-pc/cmc-nps组cleavedcaspase-3/parp的表达量均有明显升高，而c-pc/cmc-cd59sp-nps组的表达量又明显高于其余两组。结果表明，给药组均能促进cleavedcaspase-3/parp蛋白的表达从而诱导细胞的凋亡，靶向纳米微球促进作用更为显著。

八、共聚焦显微镜观察细胞的形态变化

对cd59sp进行fitc标记，制备出fitc标记的靶向纳米微球。在共聚焦显微镜下观察，如图13所示，c-pc/cmc-cd59sp-fitc靶向纳米微球处理hela细胞48h后，部分细胞呈现出不规则，多边形，大多数依旧贴壁，但也有个别细胞已经开始变圆，细胞周围开始出泡，形成凋亡小体。有的已经脱离细胞，有的与细胞相连，并且小泡越多的细胞，细胞轮廓也不再清晰，边缘也不规则。由此可见，随着细胞在药物的作用下，细胞的形态开始变化，出现凋亡形态。

九、流式细胞术检测细胞周期的变化

从表1可知：药物影响hela细胞由g1期向合成期(s)和分裂期(m)的转变，而该期是dna合成静止期，这种转变在靶向纳米药物中更为明显。所以说明c-pc可以使hela细胞停滞在g1期，阻止dna复制和细胞分裂，靶向药物对其效果更为明显。

表1样品中细胞周期各时期所占百分比

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。