一种包含黄连素的双敏性脂质体的制备方法与流程

本发明属于药物包载技术领域，尤其涉及一种包含黄连素的双敏性脂质体的制备方法。

背景技术：

药物控释材料是一种具有控制药物释放功能的材料，可以通过膜透过控制体系、机体扩散体系等方式控制药物释放。脂质体作为众多药物控释材料中的一种，由于其制备简单、对人体无害、无免疫原性反应、易制备等优点倍受人们关注。

脂质体是由磷脂或者其他的两亲性分子分散在水中而形成，具有靶向、缓释、生物相容性等特点，是药物良好的靶向载体。由于脂质体具有生物膜的特性和功能，主要作为癌症药物载体进行研究，它可将包封的活性物质直接运输到目标细胞上，故有“生物导弹”之称。但由于天然磷脂、胆固醇制备的传统脂质体因稳定性较差、产品包封率较低和靶向性分布欠佳等原因，应用上受到限制，故开发一种具有良好性能的新型脂质体材料显得极有必要。

近年来，人们研制出了新型智能脂质体以提高脂质体的稳定性，设计开发了热敏脂质体、ph敏脂质体、免疫脂质体、磁性脂质体、光敏脂质体等新型智能脂质体。其中最受关注的是ph敏脂质体与热敏脂质体，但是他们具有各自的缺点，如ph敏脂质体在人体内稳定性较差，而热敏脂质体的毒副作用较大。因此，提供一种更加完善的脂质体制备方法显得极有必要。

本发明使用具有酸敏性聚(2-乙基丙烯酸)修饰空白脂质体，制得的ph敏脂质体敏感性良好；通过选择不同的磷脂原料与设计配比制得热敏脂质体，其敏感性良好且毒副作用较小。本发明在改善两种脂质体各自缺点的同时，运用交融法将两种脂质体融合，制得了同时具有两种脂质体优良特性的双敏性脂质体。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种包含黄连素的双敏性脂质体的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下方案：一种包含黄连素的双敏性脂质体的制备方法，，包括以下步骤：

(1)将5.5mol蛋黄卵磷脂与4.5mol胆固醇共溶于10ml氯仿中，40℃旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到10mlpbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到空白脂质体溶液。

(2)以1:6的质量比取酸敏剂聚(2-乙基丙烯酸)与十四烷基胺反应，制得100mg聚(2-乙基丙烯酸)脂肪酰胺衍生物，加入到步骤1制备的空白脂质体溶液中，40℃搅拌24h，搅拌完成后以hbs缓冲液为洗脱液通过sepharosecl-6b色谱柱洗脱未嵌入脂质体的衍生物，得到ph敏脂质体溶液。

(3)称取0.9g二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、0.06g氢化大豆磷脂(hspc)与0.04g二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)，共溶于10ml氯仿中，60℃旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到10mlpbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到热敏脂质体溶液。

(4)将1体积的ph敏脂质体溶液、1体积的热敏脂质体溶液加入到4体积的氯仿/甲醇(体积比2:1)混合溶液，旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到2体积的黄连素浓度为1mg/ml的黄连素的pbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到包载有黄连素的双敏性脂质体。

(5)将步骤(4)制得的双敏性脂质体通过0.45μm孔径的聚碳酸酯膜过滤，得到双敏性脂质体。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所选择的热敏脂质体原材料为二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、氢化大豆磷脂(hspc)、二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg2000)，与传统热敏脂质体原材料相比，去掉了辅助药物释放的溶血磷脂。原因在于：一方面，溶血磷脂会使生物体内的红细胞破裂，添加的量需要严格控制，存在安全隐患；另一方面，溶血磷脂的价格昂贵，去掉溶血磷脂后可以降低脂质体制备成本。由于去掉了溶血磷脂这一原材料的补充，本发明增加了二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)的用量，将制备热敏脂质体的原材料的重量比设计为90:6:4。是由于所添加的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)的相变温度为41℃，更接近于热敏脂质体在人体内的起作用时的敏感温度，可提升热敏脂质体在人体内的释药效果。同时也实现了与ph敏脂质体高效融合。

(2)本发明通过高分子修饰法来制备ph敏脂质体，即使用聚(2-乙基丙烯酸)与十四烷基胺制得的聚(2-乙基丙烯酸)脂肪酰胺衍生物这一高分子化合物修饰空白脂质体。使用这一具有酸敏性的高分子修饰脂质体，不仅能使脂质体具有ph敏感性，同时，在碱性或中性的非ph敏工作范围内，该高分子在脂质体膜的表面呈现为伸展状态，“掩盖”ph敏脂质体的类细胞结构，避免了ph敏脂质体过早的被人体内的免疫系统清除，延长了ph敏脂质体在生物体内的循环时间。

附图说明

图1双敏性脂质体ph敏感范围测试图；

图2双敏性脂质体的差示扫描量热(dsc)图；

图3双敏性脂质体的粒径分布图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1一种包含黄连素的双敏性脂质体的制备

(1)将5.5mol蛋黄卵磷脂与4.5mol胆固醇共溶于10ml氯仿中，40℃旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到10mlpbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到空白脂质体溶液。

(2)以1:6的质量比取酸敏剂聚(2-乙基丙烯酸)与十四烷基胺反应，制得100mg聚(2-乙基丙烯酸)脂肪酰胺衍生物，加入到步骤1制备的空白脂质体溶液中，40℃搅拌24h，搅拌完成后以hbs缓冲液为洗脱液通过sepharosecl-6b色谱柱洗脱未嵌入脂质体的衍生物，得到ph敏脂质体溶液。

(3)称取0.9g二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、0.06g氢化大豆磷脂(hspc)与0.04g二硬脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)，共溶于10ml氯仿中，60℃旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到10mlpbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到热敏脂质体溶液。

(4)将1体积的ph敏脂质体溶液、1体积的热敏脂质体溶液加入到4体积的氯仿/甲醇(体积比2:1)混合溶液，旋转蒸发成膜，真空干燥24h，加入到2体积的黄连素浓度为1mg/ml的黄连素的pbs缓冲液中，使用超声仪每隔2s～3s间歇超声2min，得到包载有黄连素的双敏性脂质体。

(5)将步骤(4)制得的双敏性脂质体通过0.45μm孔径的聚碳酸酯膜过滤，得到脂质体。

实施例2双敏性脂质体的ph敏感范围测定

采用紫外分光光度法测定本发明实施例1中制备的双敏性脂质体的ph敏感范围。将各组双敏性脂质体置于3.5～7.5的ph环境中，一段时间后测定不同组溶液的吸光度值，测得双敏性脂质体的ph敏范围在5.2～7.0，如图1所示。

实施例3双敏性脂质体的热敏温度范围测定

采用差示扫描量热法(dsc)测定本发明实施例1中制备的双敏性脂质体的相变温度。将双敏性脂质体稀释到20mg/ml，吸取10μl于铝盘中，20℃～60℃范围扫描，升温速率2℃/min，测得相变温度39℃～48℃，如图2所示。

实施例4双敏性脂质体的粒径测定

采用激光粒度分布仪测定本发明实施例1中制备的双敏性脂质体的粒径分布。将双敏性脂质体稀释到20mg/ml，吸取20μl于比色皿中，蒸馏水稀释后用激光散射粒径仪测定粒径分布，测得双敏性脂质体平均粒径为435nm，如图3所示。

实施例5双敏性脂质体的释药效果

上述实施例1中制备的双敏性脂质体经ph敏范围与热敏温度范围测定表明，在ph条件在5.2～7.0以及温度在39℃～48℃范围内能够加快药物的释放，说明该脂质体在生物体内具有良好的控释效果，提高药物的生物利用率。

以上所述实施例仅仅是为了说明本发明的原理所采用较佳的具体实施方式，但并不能视为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的情况下，还可以在一些细节上做出若干变形与改变，都应视为本发明所涵盖的保护范围。