针对CD44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系及应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及基因载体，具体涉及采用改性透明质酸修饰壳聚糖纳米粒得到的靶向基因载体。

背景技术：

现代分子生物学研究表明，肿瘤的发生发展是多基因、多阶段、多步骤的复杂演进过程。其根本原因可能在细胞内部基因结构及表达的异常改变，涉及到多种原癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、细胞粘附因子及dna修复基因等的异常和积累。如bcl2为一原癌基因，也是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因之一。研究表明，bcl2基因的易位和高表达与肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关，降低或消除bcl2基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除bcl2对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。所以，基于分子水平的基因治疗是肿瘤治疗的一项重要策略。而这其中，选择肿瘤细胞特异的分子靶点进行有效治疗，不但可以取得明显疗效，而且避免伤害正常的细胞，因此该方法越来越被医学界所认同。

rna干扰(rnai)技术是常用的有效基因技术，许多研究结果证实，运用sirna分子可以阻断癌症细胞中重要蛋白的表达，阻止恶性表型的出现。因此，rnai技术作为一种癌症治疗手段，具有巨大的应用潜力。然而，sirna的治疗效果很大程度决定于其是否能通过机体内的种种屏障，以有效浓度到达靶点组织，所以选择一种既安全又高效的体内递送sirna的缓释基因载体成为一种迫切的需要。

基于壳聚糖(cs)阳离子多聚物的纳米粒有望成为新一代安全高效的基因载体。由于壳聚糖纳米粒不具有定向的靶向性，对其进行修饰和改造以提高其靶向性成为亟待解决的问题。研究表明，透明质酸(ha)能与细胞表面的cd44受体结合而发挥信号传递与调节细胞生理功能的作用。多种肿瘤细胞表面的cd44受体过度表达，同时相应的正常细胞中表达量并不高。所以，将ha偶联到cs纳米粒上，利用ha与细胞表面cd44具有较强亲和力的特性，可向肿瘤组织输送包裹sirna的纳米粒，大大提高给药的靶向性。传统方法是通过正负电荷的作用将ha偶联到cs纳米粒上。然而，正负电荷的作用在体内常常由于酸碱度的改变而不稳定，导致偶联上的ha丢失。

发明专利申请201410572404.8公开了“一种改性透明质酸及其制备方法”。该申请通过氧化透明质酸主链糖苷环中的还原性羟基，使糖苷环从相邻的羟基处断链开环，形成具有活性较高的多醛基结构，在不影响材料本身的亲水性以及生物相容性的同时，引入了高活性反应基团。然而，该申请所述的方法存在以下问题：(1)反应温度高，为40-70℃，易导致壳聚糖分子量的降低；(2)透明质酸在水溶液中的质量浓度范围小，仅为1-5％，从而限制了反应的量；(3)反应完毕后需要反复透析洗涤处理才可以得到改性透明质酸，操作复杂；(4)搅拌反应时间长达3-24h，从而导致整个操作过程的时间较长，易导致反应后的醛基活性降低。

此外，还没有氧化透明质酸与壳聚糖纳米粒结合作为cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系的相关报道。

技术实现要素：

基于目前采用壳聚糖(cs)纳米粒的基因靶向输送技术的现状，本发明将sirna包载于cs纳米粒中，并通过氧化改性后的透明质酸(ha)对cs纳米粒进行修饰，从而得到肿瘤靶向纳米粒。本发明还选取cd44高表达膀胱癌及肾癌细胞系，评价该纳米缓释基因载体在肿瘤靶向治疗中的作用，探讨其作为基因靶向输送载体的可行性，为临床开发应用和探索cd44高表达型肿瘤基因治疗的新途径提供依据。

本发明的技术方案：

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸had共价交联到壳聚糖纳米粒csnps上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒csnps为包裹sirna的壳聚糖纳米粒，即csnps-sirna。所述had的结构式如下所示：

其中，所述氧化透明质酸had中醛基的数目为2个。所述氧化透明质酸had采用醇相反应制备得到。所述醇相反应制备had具体包括以下步骤：(a)将适量透明质酸溶解在乙醇中得到透明质酸的乙醇溶液；(b)将适量氧化剂溶解在水中得到氧化剂溶液，并在20-25℃的温度条件下将其加入到步骤(a)制备的透明质酸的乙醇溶液中，搅拌至氧化反应完毕；(c)采用浓度不小于95％的乙醇沉淀并洗涤后得到改性透明质酸。所述透明质酸的糖苷环单元与氧化剂的摩尔比为2:1-10:1。所述溶解透明质酸采用的乙醇为体积分数为60-95％的乙醇，所述透明质酸在乙醇溶液中的质量体积比为5-10％，所述氧化剂溶液的浓度为0.1-1m。本申请采用的醇相反应在室温下室温即可进行，不需要加热；而且透明质酸ha在乙醇溶液中处于溶胀状态，而非溶解态，所以浓度可以在5-10％(w/v)，一次性反应量大大增加。

基因靶向输送体系的应用，将其应用于cd44高表达型肿瘤中sirna的转运体系。所述cd44高表达型肿瘤为膀胱肿瘤、肺癌肾癌。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用壳聚糖纳米粒作为缓释载体的优势，联合sirna技术，以及透明质酸(ha)能与膀胱癌组织中高表达的cd44受体特异性结合而介导的靶向性，将sirna包载于cs纳米粒中，并通过氧化改性后的ha对其进行修饰，制备肿瘤靶向纳米粒，解决了现有技术中ha丢失导致的问题。

(2)本发明提供的csnps-sirna-had靶向纳米粒作为cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，为临床上cd44高表达型肿瘤基因治疗的新途径提供了依据。

(3)采用本发明所述的基因靶向输送体系，可以在不伤害正常细胞的前提下取得良好的治疗效果，具备积极的社会效应和丰厚的经济效益，市场应用前景巨大。

说明书附图

附图1是csnps、csnps-had与csnps-ha纳米粒粒度分布图(微米)；

附图2是扫描电镜下csnps、csnps-had与csnps-ha纳米粒的形态；

附图3是琼脂糖凝胶电泳检测壳聚糖纳米粒对sirna的包载量的测定；

附图4是cd44在膀胱癌、肾癌及正常膀胱和肾细胞中的表达；

附图5是采用荧光显微镜观察csnps纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒对o786细胞的转染效果(100×)；

附图6是采用westernblot检测csnps纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒携带bcl2-sirna对o786细胞靶蛋白的的干扰效果(100×)；

附图7是采用荧光显微镜观察csnps纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒对t24细胞的转染效果(100×)；

附图8是采用westernblot检测csnps纳米粒及其不同修饰方式的靶向纳米粒携带bcl2-sirna对t24细胞靶蛋白的的干扰效果(100×)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，所述基因靶向输送体系为将双醛基的改性透明质酸had共价交联到壳聚糖纳米粒csnps上所得到的偶联壳聚糖靶向纳米粒。其中，所述壳聚糖纳米粒csnps为包裹sirna的壳聚糖纳米粒，即csnps-sirna。所述had的结构式如下所示：

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：

(1)将氧化透明质酸ha通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸had：

(a)称取2g透明质酸(ha)，搅拌下加入95％(v/v)的乙醇中，得到浓度为9％(w/v)的透明质酸的乙醇溶液；(b)避光称取0.5310gnaio4(mha：mnaio4＝4:1)，将其完全溶解在水中得到0.5m的naio4水溶液；在25℃的温度条件下将溶解的naio4溶液逐滴慢慢加入ha溶液中，避光匀速搅拌反应6h至氧化反应完毕；(c)反应后的溶液加入到三倍体积的95％(v/v)乙醇中沉淀，洗涤后干燥得到氧化透明质酸had。

(2)制备包裹sirna的壳聚糖纳米粒csnps-sirna：

(a)称取适量cs粉末(160kda)，室温下溶于0.5％的乙酸溶液，制备浓度为1mg/ml的cs乙酸溶液，过滤。(b)称取适量三聚磷酸钠(tpp)粉末，制备得到浓度为1mg/ml的tpp水溶液，过滤；(c)取浓度为20um的sirna160ul与上述浓度为1mg/ml的tpp水溶液混合得到共混液，然后在搅拌条件下将共混液滴加到1mg/ml的cs乙酸溶液中，反应完毕即得到csnps-sirna。所述cs和tpp的质量比为5:1；所述搅拌的时间为40min，所述搅拌温度为室温。

(3)制备csnps-sirna-had靶向纳米粒：

ha通过化学改性后引入活性醛基基团得到had，在此过程中ha的分子量也会随之降低，更易与cs的氨基反应。在搅拌条件下，将0.05％(w/v)had溶液100ul逐滴加入到步骤(1)制备的had溶液加入到步骤(2)制备的csnps-sirna溶液中，所述had与cs的质量比为1:200。搅拌反应40min，超声分散均匀，透析即得到csnps-sirna-had靶向纳米粒，即针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系。

对比试验：

(1)壳聚糖纳米粒(csnps)的制备：

(a)称取适量cs粉末(160kda)，室温下溶于0.5％的乙酸溶液，制备浓度为1mg/ml的cs乙酸溶液，用0.45μm滤器过滤。称取适量tpp粉末，制备浓度为1mg/ml的tpp溶液，用0.45μm滤器过滤。在搅拌下将所述tpp溶液缓慢滴加到所述cs乙酸溶液中，使cs和tpp的质量比与步骤(2)一致，持续搅拌20-60min后，超声处理2min，静置后得到csnps溶液。

(2)制备csnps-had靶向纳米粒

搅拌条件下，将0.1-0.01％(w/v)had溶液100ul逐滴缓慢加入到csnps溶液中，搅拌反应30-60min，超声分散均匀，透析即得到csnps-had靶向纳米粒。

(3)制备csnps-ha靶向纳米粒

搅拌条件下，将0.1-0.01％(w/v)ha溶液100ul逐滴缓慢加入到csnps溶液中，通过ha与csnps表面的正负电荷作用，得到传统ha标记的靶向纳米粒csnps-ha。

(4)制备csnps-sirna-ha靶向纳米粒

搅拌条件下，将0.1-0.01％(w/v)ha溶液100ul逐滴缓慢加入到csnps-sirna溶液中，通过ha与csnps表面的正负电荷作用，得到传统ha标记的靶向纳米粒csnps-sirna-ha。

基因靶向输送体系的应用，将其应用于cd44高表达型肿瘤中sirna的转运体系。

表征试验：

(一)纳米粒参数的测定及形态观察

用粒度仪上机测试csnps、csnps-ha和csnps-had粒径分析、pdi指数及zeta电势；通过扫描电镜进行形态学观察。

1.检测纳米粒对sirna包载率

分别取上述制备的csnps-ha和csnps-had靶向纳米粒以及csnps-sirna-had靶向纳米粒和csnps-sirna-ha靶向纳米粒于1.5mlep管中，13000rpm离心30min后取部分上清，分别以0.5和1ul的sirna为对照，检测理论上含等量sirna的靶向纳米粒，以及等体积的空纳米粒，通过琼脂糖凝胶电泳法检测上清中的游离sirna；并测定上清液在波长260nm和280nm下吸光度，重复3次，取平均值，计算包载率。

2.csnps-ha和csnps-had分别包载sirna对肿瘤细胞的转染率的比较

2.1选择高表达cd44细胞系

通过实时定量pcr法和westenblotting法检测多种肿瘤细胞与正常细胞中cd44的mrna和蛋白水平，筛选高表达cd44的肿瘤细胞。

2.2对肿瘤细胞的转染率的比较

用1640细胞培养基(含10％胎牛血清，100u/ml的青链霉素)培养肾癌细胞o786、膀胱肿瘤细胞t24细胞，将细胞接种于24孔细胞培养板，培养24h后去除培养液，以csnps为对照组分别加入含csnps-sirna-had、csnps-sirna-ha，并设正常对照组和hiperfect转染等量sirna的阳性对照组，定期通过荧光显微镜观察细胞荧光，通过westenblotting法检测膀胱癌细胞中bcl2的水平，比较共价结合的had标记纳米粒与传统ha通过电荷作用得到的纳米粒对肿瘤细胞的转染效率以及携带sirna的转染效率。

实施例2：

与实施例1不同的是，

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：

(1)将氧化透明质酸ha通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸had：

(a)称取1g透明质酸(ha)，搅拌下加入60％乙醇中，得到浓度为5％(w/v)的透明质酸的乙醇溶液；(b)避光称取0.5310gnaio4(mha：mnaio4＝2:1)，将其完全溶解在水中得到0.1m的naio4水溶液；在25℃的温度条件下将溶解的naio4溶液逐滴慢慢加入ha溶液中，避光匀速搅拌反应至氧化反应完毕。(c)反应后的溶液加入到三倍体积的无水乙醇中沉淀，洗涤及干燥后得到氧化透明质酸had。

(2)制备包裹sirna的壳聚糖纳米粒csnps-sirna：

所述cs和tpp的质量比为4:1；所述搅拌的时间为30min。

(3)制备csnps-sirna-had靶向纳米粒：

在搅拌条件下，将0.01％(w/v)had溶液100ul逐滴加入到步骤(1)制备的had溶液加入到步骤(2)制备的csnps-sirna溶液中，所述had与cs的质量比为1:400；搅拌反应60min，超声，透析，即得到csnps-sirna-had靶向纳米粒。

实施例3：

与实施例1不同的是，

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：

(1)将氧化透明质酸ha通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸had：

(a)称取3g透明质酸(ha)，搅拌下加入85％乙醇中，得到浓度为6％(w/v)的透明质酸的乙醇溶液；(b)避光称取0.5310gnaio4，将其完全溶解在水中得到1m的naio4水溶液；在22℃的温度条件下将溶解的naio4溶液逐滴慢慢加入ha溶液中，避光匀速搅拌反应至氧化反应完毕。

(2)制备包裹sirna的壳聚糖纳米粒csnps-sirna：

所述cs和tpp的质量比为6:1；所述搅拌的时间为40min。

(3)制备csnps-sirna-had靶向纳米粒：

在搅拌条件下，将0.02％(w/v)had溶液100ul逐滴加入到步骤(1)制备的had溶液加入到步骤(2)制备的csnps-sirna溶液中，所述had与cs的质量比为1:500；搅拌反应30min，超声，透析，即得到csnps-sirna-had靶向纳米粒。

实施例4：

与实施例1不同的是，

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：

(1)将氧化透明质酸ha通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸had：

(a)称取4g透明质酸(ha)，搅拌下加入75％乙醇中，得到浓度为8％(w/v)的透明质酸的乙醇溶液；(b)避光称取0.5310gnaio4，将其完全溶解在水中得到0.3m的naio4水溶液；在20℃的温度条件下将溶解的naio4溶液逐滴慢慢加入ha溶液中，避光匀速搅拌反应至氧化反应完毕。

(2)制备包裹sirna的壳聚糖纳米粒csnps-sirna：

所述cs和tpp的质量比为8:1；所述搅拌的时间为50min。

(3)制备csnps-sirna-had靶向纳米粒：

在搅拌条件下，将0.1％(w/v)had溶液100ul逐滴加入到步骤(1)制备的had溶液加入到步骤(2)制备的csnps-sirna溶液中，所述had与cs的质量比为1:50；搅拌反应50min，超声，透析，即得到csnps-sirna-had靶向纳米粒。

实施例5：

与实施例1不同的是，

针对cd44高表达型肿瘤的基因靶向输送体系，采用以下方法制备得到：

(1)将氧化透明质酸ha通过醇相反应得到带两个醛基的透明质酸had：

(a)称取5g透明质酸(ha)，搅拌下加入95％乙醇中，得到浓度为10％(w/v)的透明质酸的乙醇溶液；(b)避光称取0.5310gnaio4，将其完全溶解在水中得到0.8m的naio4水溶液；在25℃的温度条件下将溶解的naio4溶液逐滴慢慢加入ha溶液中，避光匀速搅拌反应至氧化反应完毕。

(2)制备包裹sirna的壳聚糖纳米粒csnps-sirna：

所述cs和tpp的质量比为10:1；所述搅拌的时间为60min。

(3)制备csnps-sirna-had靶向纳米粒：

在搅拌条件下，将0.08％(w/v)had溶液100ul逐滴加入到步骤(1)制备的had溶液加入到步骤(2)制备的csnps-sirna溶液中，所述had与cs的质量比为1:100；搅拌反应40min，超声，透析，即得到csnps-sirna-had靶向纳米粒。

实验结果：

以实施例1及其对照试验的结果为例进行详细说明。

1.纳米粒参数的测定及形态观察

表1空白及靶向纳米粒csnps及其携带基因产物后的平均粒径及参数

通过粒度仪测cs所制备的纳米粒平均粒径、pdi和zeta电位(表1)，结果表明：1mg/ml的cs(160kda)与tpp质量比10：1所制备的csnps平均粒径均在200nm左右，且粒径分布的均一性较好(pdi<1)，zeta电位更稳定。

将ha或had修饰csnps后，以空白纳米粒为对照，用粒度仪测csnps-had、csnps-ha的平均粒径、pdi和zeta电位，见表1，得到纳米粒粒径分布图(图1)。与空白csnps相比修饰后的粒径稍大，而zeta电位变化不大，但csnps-ha组的pdi明显变大，说明分散性不佳。且扫描电镜得到一致的结果。图2所示，经扫描电镜观察csnps及其两组修饰后的纳米粒的形态为球形，csnps-had与csnps的大小相近且分散均匀，而csnps-ha大小稍大，分布也不均匀，且有聚集现象。

2.纳米粒对sirna包载率

为测定修饰后的靶向纳米粒对sirna的包载量，通过琼脂糖凝胶电泳检测上清中的游离sirna，如图3所示：当sirna的检测量为0.5ul时，csnps-sirna-had和csnps-sirna-ha上清中并未发现sirna的电泳条带；当sirna的检测量升至1ul时，csnps-sirna-had组上清中仍未发现sirna的电泳条带，csnps-sirna-ha上清中发现极少量的sirna电泳条带，说明壳聚糖纳米粒基本可以包装所有的sirna，但相比而言had修饰的纳米粒的稳定性和包载量都要优于ha修饰的纳米粒。

3.csnps-ha和csnps-had分别包载sirna对肿瘤细胞的转染率的比较

3.1筛选高表达cd44的细胞系

通过筛选我们发现膀胱肿瘤t24和肾癌细胞系o786与其对应的正常细胞系husv1和hk2相比，cd44的蛋白水平有极其显著的表达差异性。可以作为靶向材料的实验对象(图4)。

3.2csnps-ha和csnps-had分别包载sirna对肿瘤细胞的转染率的比较

csnps及不同方式靶向修饰后的纳米粒分别包载带红色荧光的bcl2-sirna-cy3，转染o786及t24细胞后，分别于7h、24h和48h用荧光显微镜观察(图5，7)，以csnps空载体为对照，发现两种修饰方式的载sirna纳米粒对两种肿瘤细胞均有明显的差异性。空白对照组未观察到红色荧光，说明材料自身没有自发荧光，csnps-had和csnps-ha转染组均观察到红色荧光，但荧光强度有明显的差异性，csnps-had组的荧光强度更强，说明had修饰的纳米粒对细胞有很强的靶向性，且westernblot方法检测干扰靶基因bcl2蛋白水平与正常对照组相比明显降低，而通过电荷作用方法制备的csnps-sirna-ha转染两种肿瘤细胞后荧光量均比had组弱，且作用后的bcl2的蛋白水平并没有得到很好的干扰，甚至有增高的趋势(图6，8)，推测可能是ha通过电荷作用的修饰方式不稳定，加入培养体系后很容易从纳米粒上分离，抑或是csnps-ha纳米粒容易聚集，所以不容易进入细胞内，加之肿瘤微环境中酸碱性改变会使纳米粒表面电荷作用结合的ha发生游离，而ha作为细胞外基质的成分之一，可能反而会对细胞的活性有一定的促进作用。

综上所述，本申请制备的csnps-had纳米粒具有粒径小、分散均匀、对sirna具有很高的包载量，且转染肿瘤细胞后携带的sirna能够对靶蛋白有具有高干扰率，可以作为一种具有应用前景的基因产物输送体系。