山茱萸总苷在制备防治心室重构的药物中的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及山茱萸总苷的新用途，具体涉及山茱萸总苷在制备防治心室重构的药物中的应用。

(二)

背景技术：

山茱萸系山茱英科山茱英属，多年生小乔木或灌木。作为中药材的山茱萸为山茱英科植物山茱英的干燥成熟果肉，别名山英肉、山茱英肉、蜀枣、蜀酸枣、寇思、思益、英肉、枣皮等。山茱萸资源分布广，产区主要集中在长江、黄河流域的伏牛山、天目山和秦岭山区。浙江天目山也是山茱英的一个重要产区，主要包括临安、淳安、桐庐等县市。山茱萸果肉味酸、涩，微温，归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴,，是中医临床常用的名贵传统抗衰老药物之一。明代李时珍的《本草纲目》集历代医家应用山茱萸的经验，把山茱萸列为补血固精、补益肝肾、调气、补虚、明目、强身之药。

研究发现，山茱萸肉的乙醇提取浓缩液毒性试验表明山茱萸肉属无毒级。卫生部己将其列入药食两用的食品资源。目前，国内外对山茱萸提取物及其药理作用的研究已经取得了一定进展，但是对山茱萸皂苷的研究尚有欠缺。在心血管研究领域，有报道，山茱萸总苷及山茱萸多糖具有改善急性心肌梗死大鼠心功能、缩小心肌梗死面积、促进心肌线粒体生物合成的作用；山茱萸总苷及多糖对急性心肌梗死大鼠心肌细胞线粒体保护作用可能是通过gsk-3β信号通路实现(陈丹，李建军，张丽婷，匡薇，陈克芳，侯祥平，麦华超，陈河.山茱萸总苷及山茱萸多糖对急性心肌梗死大鼠心肌保护作用的影响。中国中西医结合杂志2015,35(9):1090-1098)；研究报道，缺氧可以引起心肌细胞凋亡，并且随着缺氧时间的延长凋亡率上升，山茱萸总苷可以抑制心肌细胞的凋亡(陈克芳，李建军，潘爱珍，黄启辉，侯祥平.山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的研究.中西医结合心脑血管病杂志,2012,10(12):1488-1489)；山茱萸总苷中、高剂量预处理可以抑制缺氧/复氧损伤心肌细胞的钙超载，可能是其抗心肌细胞凋亡，保护心肌的作用机制之一(侯祥平，李建军，潘爱珍，林玉洁，陈克芳.山茱萸总苷对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞钙超载的影响。中国中医药科技，2014，21(6)：644-646)。而肾素血管紧张素醛固酮系统激活、氧化应激、钙超载、心肌细胞凋亡、细胞因子触发炎症反应、nf-κb过度表达等可能与心室重构的发展和转归密切相关。据此，我们推测山茱萸总苷可能有抗心室重构的作用，但将山茱萸总苷应用于治疗以心室重构为基础的相关疾病国内外未见研究报道。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供山茱萸总苷在制备防治心室重构或以心室重构为基础的相关疾病的药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了山茱萸总苷在制备防治心室重构或以心室重构为基础的疾病的药物中的应用。

具体的，所述以心室重构为基础的疾病例如：高血压、风湿性心脏病、肺心病、糖尿病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、冠心病、心肌梗塞或贫血等。

所述山茱萸总苷的常规用量推荐为50～200mg/kg/d，优选80～200mg/kg/d，更加优选100～200mg/kg/d，最优选100mg/kg/d。用药途径推荐为口服或注射给药。

所述山茱萸总苷可制成如下形式的药物制剂：山茱萸总苷片、山茱萸总苷缓释片或山茱萸总苷胶囊等。推荐所述山茱萸总苷的药物制剂以山茱萸总苷计为100～200mg/单位计量。

例如：山茱萸总苷片以山茱萸总苷计为100～200mg/片；山茱萸总苷缓释片以山茱萸总苷计为100～200mg/片；山茱萸总苷胶囊以山茱萸总苷计为100～200mg/胶囊。

本发明所述山茱萸总苷以山茱萸药材为原料，经乙醇回流提取、大孔吸附树脂除去水溶性杂质制得。所述山茱萸药材可通过常规途径商购获得，作为中药材的山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(学名cornusofficinalissieb.etzucc)的干燥成熟果肉。

具体的，所述山茱萸总苷的制备方法为：

将山茱萸药材按料液质量比1：30与95％(体积分数)乙醇混合，回流提取1h，收集提取液，滤渣重复提取2～3次，合并各次所得提取液，减压浓缩至生药含量为0.5g/ml，离心，取上清液，加入5％(质量分数)氯化钠和4％(质量分数)明胶的混合水溶液，明胶与上清液中所含生药的质量比为1：100，搅拌均匀后得到混合液，再加入所得混合液1倍体积量的乙醇，静置4h，过滤，滤液减压浓缩至生药含量为0.5g/ml，然后置于大孔吸附树脂diaionhp20上，用去离子水以2.0ml/min流速洗脱除去水溶性杂质，再用50％(体积分数)乙醇解吸，最后50％(体积分数)乙醇洗脱液经浓缩、干燥，即得山茱萸总苷。

所述山茱萸总苷还可以制成山茱萸总苷可药用盐的形式(例如盐酸山茱萸总苷)，或者与人体可接受的药用辅料组成药物组合物的形式，因此，本发明还包括所述山茱萸总苷可药用盐或所述药物组合物在制备防治心室重构或以心室重构为基础的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明采用山茱萸总苷对抗大鼠心室重构作用及其机制初步研究，山茱萸总苷抑制心肌梗死后大鼠心室重构，山茱萸总苷抑制tgf-β1/smad通路对抗自发性高血压大鼠心室重构；应用不同剂量的中药活性成分山茱萸总苷，经药效学整体动物实验研究，取得了肯定的治疗效果，为新药筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1：实施例1中he染色检测山茱萸总苷对iso诱导大鼠心肌细胞的影响(×200)，(n＝9)；

图2：实施例1中各组大鼠心肌组织学改变(masson染色，×200)，(n＝9)；

图3：实施例1中山茱萸总苷对心室重构(ventricularremodeling,vr)大鼠心肌组织tgf-β1表达的影响(n＝5)；

图4：实施例1westernblot检测山茱萸总苷对iso诱导vr中pkcα、p-pkcα表达的作用，(n＝5)；

图5：实施例2he染色检测山茱萸总苷对心肌梗死大鼠心肌组织的影响(×200)，(n＝8)；

图6：实施例2western-blot检测各组大鼠心肌组织nf-кb-p65、mmp9的蛋白表达(n＝3)；

图7：实施例3山茱萸总苷对shr心肌组织he染色形态学的影响(n＝5)；

图8：实施例3山茱萸总苷对shr心肌胶原纤维的影响(massonstaining，×400，n＝5)；

图9：实施例3山茱萸总苷对shr大鼠心肌tgf-β1蛋白表达的影响(×400，n＝5)；

图10：实施例3山茱萸总苷对shr大鼠心肌组织samd3蛋白表达的影响(×400，n＝5)；

图11：实施例3tgco对shr大鼠心肌组织tgf-β1、samd3蛋白表达的影响(n＝5)，*p＜0.05，**p＜0.01vswky；#p＜0.05，##p＜0.01vsshr；

图12：实施例3山茱萸总苷对shr大鼠心肌组织tgf-β1，smad3蛋白表达的影响，n＝3；*p＜0.05，**p＜0.01vswky；#p＜0.05，##p＜0.01vsshr。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：山茱萸总苷对抗大鼠心室重构作用及其机制初步研究

1材料与方法

1.1动物、试剂和主要仪器

健康雄性wistar大鼠，体质量(234±22)g，自浙江省实验动物中心购买，许可号:scxk(浙)2015-0004。山茱萸总苷(totalglucosidesfromcornusofficinalis，tgco)，实验室制备，方法见结果；兔抗大鼠p-pkcα多克隆抗体，购自美国santacruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和兔抗小鼠igg、tgf-β1单抗购自武汉博士德生物技术有限公司；增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ecl)试剂盒，购自云天生物技术有限公司，其他试剂均为市售的分析纯。血管紧张素ii(angiotensinii，angii)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor；tnf-α)elisa试剂盒购自南京建成生物工程研究所。彩色多普勒超声波诊断仪，美国ge公司。

1.2心室重构(ventricularremodeling,vr)模型制备

wistar大鼠50只，随机分成对照组，模型组，tgco低、中、高(50、100和200mg/k剂量组。大鼠背部s.c异丙肾上腺素(isoprenaline,iso)30d进行造模。各给药组第二日开始灌胃给药，连续30d，造模和给药间隔时间4h以上。对照组背部s.c等量生理盐水，模型组和对照组均用等容积生理盐水灌胃，于第31天处死动物。iso和药物治疗组第一天背部s.ciso20.0mg/kg，第二天背部s.ciso10.0mg/kg，第三天背部s.ciso5.0mg/kg/d，第四天背部皮下注射iso为3.0mg/kg，持续30d，食水均无限制。同时开始药物治疗组灌胃给药，1次/d共30d，模型制备和给药时间间隔4h。对照组背部s.c等量生理盐水溶液，对照组和iso组灌胃等容积蒸馏水，末次给药后禁食24h，于第31d处死所有实验动物。

1.3多普勒超声心动图评价vr大鼠心脏功能

药物治疗30d后，采用多普勒超声心动图对大鼠心脏功能进行检测。形态学指标包括左室舒张末期内径(lvdd)及收缩末期内径(lvds)，左室舒张末期左室后壁厚度(lvpwd)、左室收缩末期左室后壁厚度(lvpws)。收缩功能指标包括射血分数(ef)、短轴缩短率(fs)。

1.4大鼠血清血管紧张素ii、tnf-α含量的测定

腹主动脉取血，3000r/min低温离心10min，取上清液，用elisa法测定血管紧张素ii(angiotensinii，angii)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor；tnf-α)含量。具体步骤按试剂盒说明书操作。

1.5vr指标检测

各组大鼠取血处死后，快速打开胸腔取心脏，去除心房组织，分离左、右心室，冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，准确称取左心室和全心质量。计算左心室肥厚指数(左心室质量/体质量，lvwi)和全心肥厚指数(全心质量/体质量，wh/bw)。

1.6心室组织形态学检测

取左室心尖下部心肌组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，分别he染色、masson胶原纤维特异性染色。光镜下观察心肌组织病理学变化；×400倍下测定大鼠心肌纤维直径(mfd)。

1.7westernblot检测磷酸化pkcα(p-pkcα)蛋白表达

取左室后壁心肌组织，制备心肌组织匀浆，提取心肌组织总蛋白，采用bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取组织蛋白提取上清液进行sd-page凝胶电泳。电泳分离后的蛋白转移到pvdf膜上，加上5％脱脂奶溶液封闭4℃过夜，依次加入鼠源化的p-pkcα和β-actin抗体，4℃孵育过夜，tbst洗涤3次，10min/次，再用相应ⅱ抗室温孵育1h，化学发光ecl显色剂显色，x光胶片显影、定影，蛋白条带用quantityone凝胶分析软件进行半定量分析。

1.8免疫组织化学染色检测左室tgf-β1蛋白表达

左心室肌甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度4μm，envision法检测大鼠心脏组织tgf-β1(1∶100)表达。tgf-β1阳性反应为黄色至棕黄色颗粒，定位于胞核、近细胞核及细胞质处，阴性对照用pb取代一抗染色为阴性。应用全自动图像分析仪，在每组随机选择6个高倍视野自动计数100个左右的细胞，用mediacybernetics公司的image-proplus5.0图像分析软件分析各组tgf-β1在心肌组织中表达的平均光密度值。单位面积阳性表达积分光密度＝积分光密度/视野面积×100％。

1.9统计学分析

统计学处理应用spss17.0forwindows统计分析软件进行处理，所有数据以表示，多组间比较采用anova，组间两两比较用q检验，p<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1tgco的制备

取山茱萸药材，加95％的乙醇回流提取三次，每次1h，提取液减压回收乙醇(75℃，-0.08mpa)，并浓缩至生药0.5g/ml，离心(×5000r/min)10min，上清液加5％氯化钠的4％明胶溶液(明胶：生药＝1:100)，搅拌均匀，再加一倍量乙醇，静置4小时过滤，回收乙醇，继续浓缩至生药0.5g/ml，置预处理过的大孔吸附树脂diaionhp20上(径高比为1：5；生药与树脂比为0.5：1)，上样液取自然ph值，盐离子浓度0.5mol/l、上样液浓度2.60mg/ml、上样量6bv。吸附完全后，用4bv去离子水以2.0ml/min流速除去水溶性杂质，再用6bv50％乙醇解吸，回收乙醇、浓缩、干燥，即得tgco，总苷纯度为61.86％(uv法)。

2.2tgco可减轻iso诱导大鼠vr的组织病理学变化

he染色显示，对照组心肌肌纤维完整，排列整齐，染色均匀；iso模型组心肌肌纤维断裂、缺损，排列紊乱，局部或片状坏死灶分布，坏死处心肌成纤维细胞增生明显；tgco干预组心肌肌纤维损伤较iso模型组不同程度减轻，呈片状或点状，显示出剂量依赖性，见图1。

masson染色显示，模型组心肌坏死灶内纤维沉积，胶原纤维(蓝染部分)明显增加；tgco治疗组胶原纤维受到不同程度抑制，显示出剂量依赖性，见图2。

2.3tgco减轻iso诱导的vr大鼠心室增大

与对照组比较，模型组lvdd，lvds，lvpwd，lvpws明显增加(p＜0.05或p＜0.01)；与模型组比较，tgco各剂量组上述指标不同程度降低(p＜0.05或p＜0.01)，见表1。

2.4tgco对iso诱导的大鼠心室重构lvds/d和lvpws/d的影响

由表1可以看出：iso组lvdd，lvds，lvpwd，lvpws明显增加，与对照组比较有统计学意义；与模型组相比较，tgco高中低剂量组也不同程度的降低了上述各项指标。

表1tgco对iso诱导的心室重构大鼠形态学指数的影响(n＝9)

*p＜0.05，**p＜0.01vscontrol；#p＜0.05，##p＜0.01vsisogroup

2.5tgco对iso诱导的大鼠心室重构心肌纤维直径、尾动脉压和心室功能的影响

由表2可看出，iso组心肌纤维直径(mfd)明显增加，尾动脉压(cbp)明显升高，而射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)明显下降，与对照组比较有统计学意义；与iso组比较，tgco高中低剂量组也不同程度的降低了mfd，升高cbp、ef和fs，(p＜0.05或p＜0.01)。

表2tgco对iso诱导的心室重构大鼠心脏功能的影响(n＝9)

*p＜0.05，**p＜0.01vscontrol；#p＜0.05，##p＜0.01vsisogroup

2.6tgco可降低iso诱导的大鼠hw/bw、lvi

与对照组比较，模型组hw/bw、lvi含量明显升高(p＜0.05或p＜0.01)，tgco三个剂量组均能降低hw/bw，lvi水平(p＜0.05，p＜0.01)。见表3。

表3tgco对vr大鼠hw/bw、lvi的影响(n＝9)

*p＜0.05，**p＜0.01vscontrol；#p＜0.05，##p＜0.01vsisogroup

2.7tgco可降低iso诱导vr中tgf-β1表达

对照组tgf-β1表达量(46.74±6.69)很少；模型组tgf-β1阳性深棕色染色细胞数明显增多(157.34±29.5.21，p＜0.01)，主要分布于胞质中，说明iso能促进tgf-β1表达；tgco组三个剂量组不同程度地抑制了tgf-β1表达(高、中、低剂量组分别为59.48±9.43、83.17±17.26、119.94±26.85,p＜0.05，p＜0.01)，见图3。

2.8tgco可降低iso诱导vr中p-pkcα蛋白表达

与对照组比较(设为1)，模型组p-pkcα表达(3.89±0.52)明显升高(p＜0.001)；tgco高、中、低三个剂量组均能降低vr心肌组织中p-pkcα表达(分别为1.41±0.19、2.62±0.26、2.95±0.33，p＜0.05，p＜0.01)。见图4。

实施例2：山茱萸总苷抑制心肌梗死后大鼠心室重构

1材料与方法

1.1动物、试剂和主要仪器

健康雄性wistar大鼠，体重(224±22)g，浙江省实验动物中心购买，许可证号：scxk(浙)2015-0007。山茱萸总苷(totalglucosidesfromcornusofficinalis，tgco)，实验室制备，具体方法同前；卡托普利(captopril,cap)中美上海施贵宝制药有限公司，12.5mg/片，批号160104。兔抗大鼠nf-κbp65多克隆抗体；小鼠抗大鼠mmp-9单克隆抗体购自美国santacruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和兔抗小鼠igg购自武汉博士德生物技术有限公司；增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ecl)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司公司；其他试剂均为市售的分析纯。dw-3000小动物人工呼吸机，上海兴化生物科技有限公司；ecg-11d心电图机，惠州科美思医用仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1急性心肌梗死大鼠模型制作

参照相关文献方法，10％水合氯醛i.p麻醉大鼠后，仰卧位固定，气管插管连接呼吸机，左胸纵切口，三、四肋间开胸，分离心包，暴露心脏，于左心耳下缘2mm处无菌线结扎左冠状动脉前降支，观察大鼠心电图st段变化，以st段弓背抬高并出现室性心律失常为标准，判断心肌梗死模型成功。假手术组仅在相应部位穿线不结扎冠状动脉。排除胸腔内气体，逐层关胸，自主呼吸恢复后拔出气管插管，缝合皮肤，术后i.p青霉素20万单位/d，连续5d，预防感染。

1.2.2实验分组和给药方法

将术后存活的模型成功大鼠随机分为模型组、tgco高、中、低剂量组(200mg/kg/d,100mg/kg/d和50mg/kg/d，每组各10只)，cap组(50mg/kg/d，n＝10)，另设假手术组(n＝10)。术后第2天开始给药，每日1次，tgco，cap灌胃给药，假手术组和模型组分别给予等量的生理盐水。每周称定质量调整药量1次，连续给药4周。4周后各组存活动物数分别为模型组9只，tgco低中高剂量组各8只，cap组9只，假手术组10只。

1.2.3标本采集及处理

4周后，各组大鼠称定体质量，然后断头处死，开胸迅速取出心脏，称心脏质量，计算心质量与体质量的比值(hw/bw)。可以看到梗死区呈苍白色，非梗死区呈深红色，剪取左室后壁组织，一部分标以10％甲醛固定，石蜡包埋，其余部分-80℃冰箱保存备用。

1.2.4心肌组织he染色

取上述石蜡标本相应部位，连续切片各8张，作he染色，观察心肌组织病理学变化。

1.2.5western-blot测定nf-κb、mmp9的表达

取左室后壁心肌组织，制备心肌组织匀浆，提取心肌组织总蛋白，采用bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取组织蛋白提取上清液进行sd-page凝胶电泳。电泳分离后的蛋白转移到pvdf膜上，加上5％脱脂奶溶液封闭4℃过夜，依次加入鼠源的nf-κb、mmp9和β-actin抗体，4℃孵育过夜，tbst洗涤3次，10min/次，再用相应ⅱ抗室温孵育1h，化学发光ecl显色剂显色，x光胶片显影、定影，蛋白条带用quantityone凝胶分析软件进行半定量分析，以靶蛋白条带的吸光度值与β-actin蛋白条带吸光度值的比值代表靶蛋白的水平。

1.3统计学处理

数据以均数±标准差表示，采用spss17.0统计软件处理，多组间计量资料比较用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2结果

2.1各组大鼠hw/bw比值

模型组hw/bw比值较假手术组明显升高，山茱萸总苷处理组hw/bw比值，较模型组均有降低，高剂量组较为明显，卡托普利组hw/bw比值，较模型组明显降低。见表4。

表4各组大鼠心/体比

注：与假手术组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#p＜0.05

2.2he染色各组大鼠心肌组织病理学变化

假手术组肌丝完整，心肌细胞清晰可见，排列规则、细胞间隙均匀，模型组部分心肌纤维溶解断裂、胞间组织松散，细胞核大量消失、固缩、碎裂，胞质嗜酸性染色增强，心肌细胞明显肥大，心肌组织坏死严重，表明急性心肌梗死模型建立成功，tgco中、高剂量组心肌细胞排列及肌纤维溶解断裂程度介于假手术组与模型组之间，表明山茱萸总苷对心室重构有明显抑制作用，tgc高剂量组心肌受损的改善程度与卡托普利组类似，见图5。

2.3western-blot检测nf-кb-p65、mmp9的蛋白表达

模型组nf-кb-p65的表达明显高于假手术组(p＜0.01)，tgco低、中、高剂量组nf-κb-p65的表达显著低于模型组(p＜0.05)，cap组nf-κb-p65的表达显著低于模型组(p＜0.05)见图6。

模型组mmp9的表达明显高于假手术组(p＜0.05)，tgco中、高剂量组mmp9的表达显著低于模型组(p＜0.05)，cap组mmp9的表达低于模型组(p＜0.05)见图6、表5。

表5western-blot检测各组大鼠心肌组织nf-кbp65、mmp-9的蛋白表达(n＝5)

注：与假手术组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01

实施例3：山茱萸总苷抑制tgf-β1/smad通路对抗自发性高血压大鼠心室重构

1.材料和方法

1.1实验动物、药物、试剂和仪器

雄性自发性高血压大鼠(spontaneoushypertensiverat，shr)40只，wistar-kyoto大鼠(wky)10只，12周龄，体质量210-240g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为scxk(沪)2016-0002。大鼠分笼饲养，自由进食(饲料购于浙江省实验动物中心)和饮水。山茱萸总苷(totalglucosidesfromcornusofficinalis，tgco)，实验室制备，方法同前；卡托普利(cap)，中美上海施贵宝制药有限公司，12.5mg/片，批号160104，用前加适量蒸馏水，配制成3.5g/l的混悬液，置4℃冰箱保存备用。masson染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；血管紧张素ⅱ(angio-tensinⅱ，angⅱ于北北方生物技术研究所；兔抗转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，tgf-β1)多克隆抗体、即用型sabc免疫组化试剂盒、dab显色购于武汉博士德生物工程有限公司；smad3购于北京博奥森生物技术有限公司；bca蛋白浓度测定试剂盒、pmsf、sds-page凝胶配制试剂盒、彩色预染蛋白质分子量marker、sds-page电泳液和pvdf膜均购于上海碧云天生物技术有限公司。722型分光光度计(上海光学仪器厂)；eg1160织包埋机、rm2245组织切片机、st5020全自动染色机leica；gc-1200型γ放射免疫计数器(安徽科大创新股份公司)；mpa多通道生物信号分析系统、alc-nibp无创尾动脉血压分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)；miniprotean转膜系统、miniprotean电泳系统(美国bio-rad公司)。

2方法

2.1实验分组及用药方法

40只shr随机分为模型组、tgco高(200mg/kg/d)、低(50mg/kg/d)剂量组、cap组(50mg/kg/d)，每组10只。另设10只wky大鼠作为正常对照组。模型组和wky正常对照组均给予等量生理盐水。每日给药1次，连续8周，根据体重变化改变给药剂量。

2.2血压测量

采用尾袖法测定分析系统分别量给药前及给药后每2周清醒状态下的大鼠尾动脉收缩压(systolicbloodpressure，sbp)。将大鼠固定于舒适位置，引入加压袖口放置于大鼠尾根部，加热器加热鼠尾，打开alc-nibp无创尾动脉血压测定分析系统，等待平稳脉搏出现后，点击重启加压按钮，充气加压使之超过sbp(压力达到sbp水平时脉搏搏动消失，据此判断)，然后自动减压，经alc-nibp无创尾动脉血压测定分析系统记录sbp。每只鼠连续测量3次sbp，间隔60s，取其平均值。

2.3标本采集

末次用药24h后禁食不禁水，称体重(bodyweight，bw)，25％乌拉坦(4ml/kg)腹腔麻醉，腹主动脉取血3ml后置于离心管中，4℃、4000r/min离心20min，分离血浆，用于angⅱ的检测。取血后迅速打开胸腔，取出心脏，置于冰生理盐水中洗净血液，滤纸吸干后称取全心湿重(wholeheartwetweigh，hww)和左心室湿重(leftventriclewetweigh，lvw)，计算心脏脏器指数。取部分心尖区心肌组织，用4％多聚甲醛固定，经常规脱水、浸蜡、包埋后，制成4μm超薄切片，用于病理学检测。另外称取部分左心室心肌组织用于westernblot法测tgf-β1、smad3蛋白表达。

2.4肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem，raas)相关指标检测

8w后将大鼠处死后，开胸取主动脉血3ml，不加抗凝剂，静置2h后以4000r/min离心15min后取上清，采用试剂盒检测血清肾素pra、angⅱ及ald水平，操作完全遵循试剂盒说明书。

2.5指标检测

放射免疫学法测定血浆中angⅱ的含量，碱水解法测定hyp含量，he染色、masson染色心肌组织切片，光镜下观察心肌组织病理学变化(步骤均按照测试盒说明书操作)。免疫组化法检测tgf-β1、smad3蛋白：石蜡切片常规脱蜡至水后，室温条件下滴加3％过氧化氢灭活内源性的过氧化氢酶；抗原修复后滴加5％bsa封闭液，37℃、15min；滴加适当稀释的i抗：tgf-β1(1∶150)、smad3(1∶100)，4℃孵育过夜；37℃复温30min后滴加生物素标记的ii抗，37℃孵育20min；滴加sabc，37℃孵育20min；dab显色后经苏木素复染2min；无水乙醇脱水2次、二甲苯透明1min，中性树胶封片。心肌组织内阳性细胞呈黄色或褐色，使用image-proplus6.0图像分析软件进行半定量分析，测定其积分吸光度值(integralabsorbance，ia)，阳性表达水平用ia表示，ia越大其蛋白阳性表达水平愈高；反之则表达水平愈低。westernblot法检测tgf-β1、smad3蛋白：蛋白裂解液提取蛋白；取等量蛋白经sds-page分离后转移到pvdf膜上；脱脂奶粉封闭tbst洗膜3次后加入tgf-β1(1∶300)、smad3(1∶300)i抗，4℃孵育16～18h，tbst洗涤3次；加入酶标ii抗，室温孵育2h，冲洗，ecl显色，胶片扫描后，蛋白条带采用quantityone凝胶分析软件进行半定量分析，目的蛋白的表达强度以目的蛋白与内参照蛋白β-actin的比值来确定。

2.6统计学处理

用spss17.0软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差表示，各动物组间比较用单因素方差分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1tgco对shr收缩压的影响

给药前，与wky正常组相比，shr模型组sbp明显升高(p＜0.01)；给药后，与模型组相比，tgco高、低剂量组给药2周后sbp开始明显下降(p＜0.01)，并且随着给药时间的延长，sbp逐渐下降并于第8周达到稳定水平；与cap组相比，tgco高剂量、低剂量降压作用相对缓慢，稍弱于cap组(p＜0.05)，表明tgco可以降低shr的收缩压，见表6。

表6tgco对不同时间自发性高血压大鼠sbp的影响(mmhg.n＝8)

*p＜0.05,**p＜0.01vswky；#p＜0.05,##p＜0.01vsmodel；&p＜0.05，&&p＜0.01vscap.

3.2tgco对shr心脏脏器指数的影响

与wky正常组相比，shr模组hwi、lvwi明显升高(p＜0.01)；与模型组相比，tgco高、低剂量组、cap组心脏脏器指数均有不同程度的降低(p＜0.01)；且tgco高、低剂量组各指标均高于cap组(p＜0.05)。提示tgco可以降低心脏脏器指数，减轻shr心肌肥厚的作用，但cap效果更好，见表7。

表7tgco对shr心脏湿重及脏器指数的影响(n＝8)

**p＜0.01vswky；##p＜0.01smodel&p＜0.05，&&p＜0.01vscap.

3.3各组大鼠raas系统相关指标水平比较

与假手术组相比，模型组的pra、angⅱ及ald均升高(p＜0.05)；tgco高、中、低剂量组的pra、angⅱ及ald水平均低于模型组(p＜0.05)。tgco高剂量组pra、angⅱ及ald均低于中、低剂量组(p＜0.05)，表明tgco可下降shr血清pra、angⅱ、ald的水平，见表8。

表8各组大鼠ras系统相关指标比较(n＝8)

**p＜0.01vswky；##p＜0.01vsmodel；&p＜0.05，&&p＜0.01vscap.

3.4tgco对shr心肌组织形态学的影响

各组大鼠心肌组织he染色观察光镜下可见，wky正常组大鼠心肌细胞排列整齐规则，纤维结构清晰且染色均匀，未见心肌纤维增生，细胞核染色清晰，细胞间隙未见改变与wky组比较，模型组心肌细胞明显增大且排列紊乱，细胞核增大深染，部分核周围出现病变，细胞间隙增宽，有大量的胶原纤维增生，肌纤维有中断现象，组织周围有炎性细胞浸润，说明shr心肌细胞具有病理损伤，当给予tgco后，随剂量的增加，心肌纤维排列逐渐整齐清晰，炎性细胞浸润逐渐减少，说明心肌细胞的病理损伤得到不同程度的改善，cap组效果更佳，提示tgco具有保护心肌细胞损伤，改善心肌纤维重构的作用，见图7。

各组大鼠心肌组织masson染色观察，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。wky正常对照组心肌肌束间有较少胶原纤维，而模型组有大量胶原纤维增生，主要分布于血管周围，心肌肌束间隙不同程度增大，且心肌细胞间质和血管旁纤维组织明显增多且排列紊乱，并伴有严重的胶原沉积。各给药组较模型组心肌细胞纤维化程度明显减轻，心肌肌束排列整齐，但仍可见点灶状的胶原纤维，其中卡托普利组效果更佳。说明钩藤碱对shr心肌纤维化及其间质胶原沉积有一定的改善作用，见图8。

3.5tgco对shr心肌组织中tgf-β1和smad3的蛋白表达的影响

tgf-β1和smad3主要在心肌细胞浆内表达，阳性细胞呈现黄色或棕黄色。与wky正常组相比，各shr组心肌细胞中tgf-β1和smad3蛋白表达显著增多(p＜0.01)；与模型组相比，tgco高剂量、低剂量、cap组心肌细胞中tgf-β1和smad3蛋白相对表达量均下调(p＜0.01)，见图9-11。

3.6westernblot检测shr模型组心肌组织tgf-β1和smad3蛋白表达

模型组心肌组织tgf-β1和smad3蛋白表达较wky正常组明显增加(p＜0.01)；与模型组相比较，tgco高、低剂量组和cap组大鼠心肌tgf-β和smad3蛋白表达水平下降，提示tgco和cap能够降低shr心肌组织tgf-β1和smad3蛋白表达，见图12。

结论

1.tgco能降低shr的血压、调节改善shr的心室重构。

2.tgco能降低shr心肌tgf-β1/smad3蛋白表达，下降shr血清pra、angⅱ、ald的水平。

3.其机制可能与其影响tgf-β1/smad3通路以及降低肾素血管紧张素醛固酮系统活性有关。