本发明涉及生物医药的技术领域，尤其涉及一种联合靶向沉默DC的负调控因子的表达与DC的体内动员扩增的肿瘤新型疗法。
背景技术：
肿瘤一直是医学界亟待攻克的难题，肿瘤的发生涉及到多种分子及基因的改变，包括原癌基因突变、扩增或抑癌基因丢失、失活等因素。
肿瘤的免疫治疗是激发和增强机体以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的的概念，其常被作为一种辅助疗法，与手术、化疗或放疗等常规疗法联合应用。其中树突状细胞(Dendritic cell，DC)是目前所知惟一能激活初始性T细胞的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，具有激活CD8+CTL和CD4+T辅助细胞的强大能力，其在免疫应答中居于中心地位，对机体克服肿瘤的免疫逃逸、增强机体对肿瘤的免疫清除等具有十分重要的作用。DC作为肿瘤免疫应答的中心环节，已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的热点之一。在肿瘤患者体内，由于受肿瘤免疫抑制作用的影响，DC处于失能状态，难以激发机体有效的抗肿瘤免疫反应。为此，众多学者通过各种方法培养、激活和致敏DC，研制DC疫苗，使其在诱导特异性免疫应答时发挥重要作用，以达到控制肿瘤的目的。肿瘤疫苗旨在诱导细胞毒性T细胞(CTL)针对肿瘤抗原反应，以启动宿主抗瘤免疫应答。CTL的活化需要APC表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子对抗原进行递呈。DC是最有效的APC，用它作肿瘤疫苗接种可诱导CTL反应并使一些病灶的肿瘤消退。
目前，以DC为基础的免疫治疗策略主要可分为2种：(1)体外分离并培养DC后，用肿瘤抗原修饰加工合成DC疫苗，然后重新回输给患者；(2)应用FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase-3ligand，Flt3-L)在体内动员DC，刺激DC的扩增和成熟进行治疗，避免了体外提取DC的过程。Flt3-L是一种与造血调控有关的早期造血生长因子，可促进DC分化，具有在体内大量扩增小鼠及人类外周血和淋巴组织中DC的功能，并可刺激T细胞、NK细胞增殖，是一种重要的免疫网络因子。已被应用于肿瘤患者，在体内动员DC达到治疗目的，Flt3-L处理小鼠后，可明显增加体内DC的数量，促进DC的功能；且在乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、颅内肿瘤等肿瘤的基础或临床研究中，显示了延缓肿瘤生长、扩散及诱导肿瘤特异性免疫应答作用。
多年来DC疫苗的应用研究取得了一定效果，迄今，已有超过100项有关DC疫苗应用于Ⅰ、Ⅱ期临床实验的研究报导。然而，近年来已有不少学者发现接受自体DC疫苗治疗的患者，病情有所加重，生存期缩短，出现DC功能抑制，引起机体对肿瘤抗原的免疫耐受并促进肿瘤生长，表明DC疫苗的临床应用还存在许多亟待解决的问题。研究表明应用生物免疫治疗激发或增强特异性抗肿瘤免疫应答，肿瘤细胞仍能够逃脱宿主的免疫攻击，即肿瘤免疫逃逸。
研究发现，肿瘤细胞和DC等能产生一种重要的免疫负调节因子——吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2,3-deoxygenase，IDO)，它可以使肿瘤逃避免疫系统的监控，改变肿瘤侵袭和转移能力，影响DC疫苗临床治疗的效果。DC的许多亚型包括单核细胞来源的DC、浆细胞样DC、CD8+DC、“IDO-competent”DC、及DC疫苗中IFN活化的DC都不同程度的表达IDO，表达IDO的DC可以通过诱导活化的T细胞凋亡，并使体内抗原特异性T细胞免疫无能而抑制机体免疫反应。siRNA是当前选择性地阻断基因表达最有效的技术，但siRNA介导的基因沉默技术目前缺乏有效、特异的细胞导入系统，不但影响体外siRNA-DC疫苗的效果，更无法对体内DC的免疫抑制分子IDO进行靶向性干预。
技术实现要素：
本发明为克服上述的技术问题，提供DC的负调控因子靶向沉默与DC动员扩增的肿瘤联合疗法，该疗法提供DC靶向导入系统以抑制相关免疫负调控因子，并在体内动员DC扩增，进行联合性的辅助治疗，该方法可提高机体抗肿瘤免疫能力并增强肿瘤抑制效果。
本发明的技术方案如下：
一、体内靶向DC运输siRNA纳米递送系统man-GNR-siRNA的合成：
(1)化学合成GNR：根据化学还原法合成金纳米棒GNR，具体方法如下：溴化十六烷基三甲基氯化铵(CTAB)与氯金酸(HAuCl4)混合，25℃下，加入提前预冷的硼氢化钠(NaBH4)直到溶液颜色变成棕黄色，制备种子溶液。然后，制备生长液，包括一定比例的氯金酸、溴化十六烷基三甲基氯化铵(CTAB)、硝酸银(AgNO3)和柠檬酸钠的混合液。在28℃下,定量种子溶液加入生长液中生长24小时制备金纳米棒GNR；
(2)化学合成MUA-PEI/MUA-PEI-mannose：在室温下，根据缩合酰化反应，在HCCl3溶剂中加入一定摩尔比的MUA和PEI制备MUA-PEI；在DMSO溶剂中加入一定摩尔比的MUA-PEI和Mannose制备MUA-PEI-mannose；
(3)合成man-GNR：在室温下，根据-SH和Au之间键合，以一定摩尔比的MUA-PEI和MUA-PEI-mannose修饰GNR表面，合成man-GNR；
(4)合成携带siRNA的man-GNR-siRNA：在室温下，根据PEI和siRNA表面带的正负电荷静电作用，以一定比例的man-GNR和siRNA在无核酶或者DEPC水中混合，制备man-GNR-siRNA。
二、DC的动员扩增：一定浓度的Flt3-L静脉注射动员扩增外周免疫系统中DC的含量。
三、靶向沉默DC表达的免疫负调控因子：靶向沉默体内原有DC和动员扩增后DC中IDO的表达。
本发明的有益效果在于：
(1)该疗法有广泛的施用范围，其可作为手术、放疗或化疗在内的其他临床治疗手段的辅助治疗方法，同时，可以用于治疗实体瘤或非实体瘤；
(2)该疗法效果显著，但对患者副作用小，能有效抑制肿瘤细胞生长甚至杀死肿瘤细胞；
(3)肿瘤患者体内，DC和动员扩增后的DC处于失能状态，该方法可激发机体有效的抗肿瘤免疫反应，为临床肿瘤的免疫治疗研究提供一条新途径。
附图说明
图1为体内DC动员和DC靶向IDO沉默联合治疗肿瘤的示意图。
图2为具有DC靶向功能携带siRNA的man-GNR相关结果示意图：(A)GNR(a)和man-GNR(b)的TEM表征；(B)GNR、PEI-GNR和man-GNR的紫外吸收光谱；(C)man-GNR的核磁共振光谱；(D)FA-GNR的siRNA装载的凝胶阻滞测试结果。
图3为体外man-GNR-siRNA的DC转染效率和基因沉默效率结果示意图：(A)荧光显微镜示意图；(B)细胞流式示意图；(C)IDO基因沉默效果示意图。
图4为体内man-GNR-siRNA的DC靶向性和基因沉默效率结果示意图：(A)荧光显微镜检测对DC富集的脾脏的靶向性结果示意图；DC中IDO基因沉默效果示意图：(B)q-PCR测定结果和(C)WB测定结果。
图5中(A)为细胞流式技术检测体内Flt3-L动员扩增DC的示意图和man-GNR-siRNA沉默DC的IDO后成熟度表征：(B)MHCII结果，(C)CD80结果，(D)CD40结果。
图6中(A)为凋亡试剂盒检测体内man-GNR-siRNA沉默DC的IDO后T细胞的凋亡量；(B)为CFSE染色检测T细胞增值量；(C)为LDH测试检测CTL细胞对LLC细胞的杀伤能力结果示意图。
图7为体内Flt3-L和man-GNR-siRNA联合治疗小鼠肺癌模型20天后相关结果：(A)肿瘤生长曲线、(B)肿瘤组织图片和(C)肿瘤重量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步说明。
实施例1：体内动员DC扩增和靶向沉默DC中IDO表达联合治疗小鼠肺癌的模型
图1为本发明的DC动员扩增和靶向沉默DC中免疫负调控因子表达的新型肿瘤免疫联合治疗技术的示意图。
一、体内靶向DC运输siRNA纳米递送系统man-GNR-siRNA的合成：
(1)化学合成GNR：根据化学还原法合成金纳米棒GNR，TEM表征结果如图2A所示；
(2)化学合成MUA-PEI/MUA-PEI-mannose：根据缩合酰化反应，在HCCl3溶剂中制备MUA-PEI；在DMSO溶剂中制备MUA-PEI-mannose；
(3)合成man-GNR：根据-SH和Au之间键合，以1:1摩尔比的MUA-PEI和MUA-PEI-mannose修饰GNR表面，合成man-GNR，通过紫外吸收光谱和核磁共振图谱进行检测，结果分别如图2B和2C所示；
(4)合成携带siRNA的man-GNR-siRNA：根据PEI和siRNA表面带的正负电荷静电作用，以一定比例(wt:wt＝5:1)混合man-GNR和siRNA，制备man-GNR-siRNA，产物通过凝胶阻滞检测siRNA的携带量，结果如图2D所示；图3A和3B分别为荧光显微镜示意图和细胞流式技术检测出的体外DC转染效率约为56％，图3C所示的q-PCR检测基因沉默效率约为71％，图4A为通过静脉注射后荧光显微镜检测体内DC靶向性示意图，图4B和4C分别为q-PCR和WB结果示意图，检测目的基因的沉默效率63％。
二、DC的动员扩增：
一定浓度的Flt3-L(10g/mouse/day，8天)静脉注射于小鼠体内，动员扩增外周免疫系统中DC的含量，通过细胞流式技术检测，DC的含量增加到8倍，结果如图5A所示。
三、靶向沉默DC表达的免疫负调控因子：
在小鼠体内，利用300μl man-GNR-siIDO(400μg PEI-GNR and 80μg siIDO)靶向沉默体内原有DC和动员扩增后DC中IDO的表达，经细胞流式技术检测DC的成熟度的提高，MHC-II、CD40、CD80分子表达分别明显提高到80％、56％、61％(图5B、5C和5D)、CD4+和CD8+T细胞的凋亡比例的降低(图6A)、T细胞的增值能力的增强(图6B)和LDH测试检测CTL细胞的肿瘤杀伤能力的提高(图6C)，增强抗肿瘤能力，治疗小鼠肺癌模型22天，明显抑制肿瘤生长(图7)，肿瘤的重量下降了9倍(图7C)，该肿瘤联合疗法是一种潜在的肿瘤治疗新方法。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。