一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用，属于再生医学领域。

背景技术：

注射微整形技术，是微整形的一种形式，以其微创、无痛和恢复期短等优势受到人们的追捧，是近几年流行起来的整形项目。在颌面部软组织缺陷的修复治疗、隆鼻和隆下巴中也逐渐显示出其创伤小、恢复快的独特优势。无论是单独使用还是作为正颌、正畸修复手术的补充，微创注射技术在创伤重建，颌面部软组织缺陷修复，隆鼻和隆下巴中具有广阔的应用前景。

目前可以注射的材料主要有胶原蛋白，胶原蛋白可使表皮细胞变得丰满，从而使肌肤滋润、光滑、水嫩，具有弹性，随着年龄的增长，肌肤内的胶原白也随之减少，面部注射胶原蛋白就显得尤为重要。胶原蛋白中独有的羟脯氨酸具有收紧结缔组织的作用，能使松弛的组织紧实。但胶原蛋白由于体内胶原蛋白酶的存在，即便通过交联后的蛋白质，其维持时间也不超过六个月，需要定期注射以达到良好的治疗效果。还有一种注射材料是透明质酸，通过将其注射到面部真皮而达到修复较深层皱纹，还可以用来丰唇、隆下巴和隆鼻，使皮肤恢复弹性和光泽。注射后维持时间为六个月。而注射肉毒素，可以抑制周围运动神经末梢突触前膜乙酰胆碱释放，阻断神经和肌肉之间的信息传导，从而引起肌肉的松弛性麻痹。肉毒素可以除去皱纹，但是维持时间为6-8个月。

中国专利cn200510044005.5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方法，该方法采用猪皮经脱脂，脱细胞，戊二醛交联等工序，物理加工制成微粒。该专利制备微粒的方法只是将交联后材料通过物理方法切割成边长为300-500μm的微粒，然而其微粒粒径过大，无法采用直径较小的针头注射，从而限制其在注射整形领域的实用价值。

中国专利cn02156797.2公开了一种注射性胶原蛋白的制备方法及其产品和应用，该方法采用动物组织中的胶原蛋白纤维类制备注射性胶原蛋白，然而在制备过程中会破坏动物组织原有结构及其他成分，也损失了组织中具有生物活性或生物功能的活性成分，只能单纯起到胶原蛋白的填充作用。

如上所述，目前已上市的一些微创注射整形植入材料及国内同类专利公开的微创注射整形植入材料制备方法均存在一定的缺点，尤其是胶原和透明质酸植入剂产品，并未包含生物活性因子，因此其作用仅仅是填充，当这些填充材料被机体降解吸收后，组织修复效果就会消失，使其效果不佳。目前尚无采用脱细胞小肠黏膜下层为原料制备可注射的填充材料的产品，亦无专利及文献报道。

现有技术产品在注射后未被降解的时间内，会起到一定的填充，抗皱作用，但是这材料随着植入时间的延长，会被机体的相关酶类逐渐降解吸收，由于其不存在活性成分，因此效果也会消失。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种富含生物活性成分、结构疏松多孔的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其包括以下步骤：

(1)取动物小肠组织，依次进行漂洗、消毒和反复冻融处理；

(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中；

(3)将小肠黏膜下层进行脱细胞处理，然后进行漂洗；

(4)将经步骤(3)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取20-30小时，漂洗；

(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡，然后冷冻干燥、研磨，得到可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)采用消毒剂进行消毒，所述消毒剂由(ⅰ)体积分数为5-30％的乙醇水溶液，和(∏)体积分数为0.2-2％的过氧乙酸水溶液和/或体积分数为0.5-10％的过氧化氢水溶液组成；所述步骤(1)中，反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻0.5-3小时，然后取出，于37℃下解冻0.1-1小时；反复冻融的次数为2-5次。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述动物小肠组织为哺乳动物小肠组织；优选的，所述动物小肠组织取自屠宰两小时内哺乳动物的小肠组织。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中3-6小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为0.5-3mmol/l。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，脱细胞处理的方法为：将小肠黏膜下层先置于脱细胞液a中浸泡8-24小时，漂洗，再置于脱细胞液b中浸泡8-24小时；其中，所述脱细胞液a含有下述质量百分比的组分：(a)0.01-1％edta三钠或四钠，和(b)2-10％碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠或磷酸钾；所述脱细胞液b含有下述浓度的组分：(c)0.8-2mol/lhcl、磷酸、硫酸、醋酸、乳酸或甘醇酸，和(d)0.8-4mol/l氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾；所述脱细胞液a和脱细胞液b与小肠黏膜下层的体积比均为4-30：1。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，除垢剂为曲拉通溶液，所述曲拉通溶液中曲拉通的质量百分比为1-4％。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(5)为：将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡10-16小时，然后冷冻干燥、研磨，再筛选粒径为20-200μm的微粒，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。由于所得脱细胞小肠黏膜下层基质微粒直径为20-200μm，可使用25-27g小针头注射。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中，采用缓冲溶液进行漂洗。

作为本发明所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)和步骤(5)中，缓冲溶液为pbs溶液。

另外，本发明还提供了一种采用上述方法得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

本发明以动物小肠组织为原料制备可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒，较以软组织和脂肪组织为原料而言，本发明制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒无免疫介导的炎性反应，且富含生长因子。另外，本发明制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒结构疏松多孔，在保持支架结构的基础上，多孔的结构有利于细胞组织长入，和脂肪组织、软组织为原料相比，有更好的结构特点，且含有更多的ⅳ型胶原，因为ⅳ型胶原主要是存在于基底膜这个组织中。

本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒(sis)含有生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要含有ⅰ、ⅲ、ⅳ和ⅵ型胶原，血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、转化生长因子(tgf)等多种生长因子，还含有天然粘多糖(透明质酸、硫酸软骨素)、糖蛋白类(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)以及sod(superoxidedismutase，超氧化物歧化酶)。ⅰ、ⅲ、ⅳ和ⅵ型胶原等通过改善表皮细胞生长微环境，促进微循环，增强新陈代谢，活化具有免疫活性的郎格汉氏细胞，诱发免疫系统和修护功能，减少色素沉积；富含的细胞生长因子(vegf、fgf以及tgf等生长因子)可以改善由于日光照射、滥用去角质化妆品以及环境污染引起的皮肤发红、褪皮、变薄、敏感等皮肤症状，激活细胞能量，焕发肌肤水润光泽；天然保湿因子天然粘多糖(透明质酸、硫酸软骨素)，能够渗入皮肤深层细胞，扩张毛细血管，增加血液循环，促进皮肤营养吸收，增加皮肤弹性，清除氧自由基，淡化皱纹，延缓皮肤衰老；sod具有特殊的生理活性，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害；糖蛋白类(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)能够促进细胞移动、黏附和增殖，调节纤维结构和细胞移动，连接生长因子，刺激血管生长；能够修复角质层，加强皮肤的厚度，对使用化妆品中出现的脱皮物及不良成分造成的角质层变薄、红血丝外露、脆弱、易发红、发痒、过敏等现象有很好的修复作用。另外，sis的功效除了对皮肤具有修复作用外，还含有少量的ⅳ型胶原，ⅳ型胶原是一种非纤维状胶原蛋白，sis通过使用脂质体负载技术进入到皮肤深层后，ⅳ型胶原能与周围皮肤深层组织具有良好的亲和性，从而起到修复功能；sis中的各种胶原分子之间通过交联形成的连续三维网格结构，具有高度的稳定性，能够锁住水分，被皮肤吸收。此外，sis作为一种复合物，还具有如下功能，可以作为上皮细胞的支撑垫，在上皮细胞组织与结缔组织之间起结构连接作用；作为细胞的选择性通过屏障，可以阻止结缔组织细胞与基底膜上的上皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过，且该复合物对分子的通透性具有高度选择性。

最后，本发明还提供了一种植入剂，其含有上述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料，所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的质量与所述植入辅料的体积的比为1：1～10g/ml。

本发明的植入剂作为微创注射整形植入材料，一方面可作为在创伤、疾病或先天畸形和美容的后续重建的组织替代或填充物，另一方面，保留了小肠黏膜下层的天然三维立体结构以及大量的天然活性成分，降低了微创注射产品在临床使用后因原料来源而引起的免疫排斥反应，适用于注射至皮下真皮层深层至皮下浅层以修复创伤，疾病，组织缺陷，并具有良好的组织修复效果。

作为本发明所述植入剂的优选实施方式，所述植入辅料包括磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、自体富血小板血浆、聚电解质溶液中的至少一种；优选地，所述聚电解质溶液中的聚电解质为氧化纤维素、羧甲基甲壳素、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、透明质酸、硫酸软骨素、海藻糖钠、聚谷氨酸中的至少一种，所述聚电解质溶液中聚电解质的浓度为0.5-40g/l。

作为本发明所述植入剂的优选实施方式，所述植入辅料还包括细胞生长因子、局部麻醉剂中的至少一种；所述植入辅料中，细胞生长因子的浓度为0.1-100mg/l，局部麻醉剂的浓度为0.1-20g/l。

作为本发明所述植入剂的优选实施方式，所述局部麻醉剂包括布比卡因、布坦卡因、卡替卡因、辛可卡因(二丁卡因)、氯丁卡因、对哌啶基乙酰基氨基苯甲酸乙酯、依替卡因、利多卡因(利诺卡因)、甲哌卡因、奥昔卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、托利卡因、三甲卡因、伐多卡因、阿替卡因、左布比卡因、阿米卡因、可卡因、丙泮卡因、氯美卡因、环美卡因、丙美卡因、地卡因(丁卡因)、苯佐卡因、布他卡因、丁托西卡因、氨基苯甲酸丁酯、氯普鲁卡因、二甲卡因(拉罗卡因)、奥布卡因、哌罗卡因、对乙氧卡因、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙氧卡因、三卡因中的至少一种。所述局部麻醉剂为酰胺型和酯型局部麻醉剂。

本发明的植入剂可通过将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料混匀得到。例如，可将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料混匀后灭菌灌装，使用时再混匀，也可将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料分别灭菌灌装，使用时再混匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒含有生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要成分为脱细胞小肠黏膜下层中的ⅰ、ⅲ、ⅳ和ⅵ型胶原，其中还包括透明质酸和氨基多糖等细胞外基质成分。本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒具备生物相容性好，可促进组织再生，dna含量少等优点，由于其本身具有三维立体结构，故可作为支撑组织、细胞生长的支架，其含有的活性成分可诱导和调控细胞的黏膜，增殖，迁移和分化，并促进组织修复和再生；该可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒在具备填充功能的同时还具有组织修复等功能。

本发明的植入剂一方面可作为在创伤、疾病或先天畸形和美容的后续重建的组织替代或填充物；另一方面，其保留了小肠黏膜下层的天然三维立体结构以及大量的天然活性成分，降低了微创注射产品在临床使用后因原料来源而引起的免疫排斥反应，并具有良好的组织修复效果。

附图说明

图1为本发明实施例1～3制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的sem图(200μm)；

图2为本发明实施例1～3制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的sem图(5μm)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法的一种实施例，本实施例所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法为：

(1)取哺乳动物小肠组织，采用缓冲溶液进行漂洗，清除血液和小肠内容物，将其放入装有无菌注射用水配制的消毒剂中浸泡消毒，再进行反复冻融处理；其中，所述消毒剂由体积分数为5-30％的乙醇水溶液和体积分数为0.2-2％的过氧乙酸水溶液组成；反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻1.5小时，然后取出，于37℃下解冻0.5小时；反复冻融的次数为3次；

(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中6小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为0.5mmol/l；

(3)将剥离的小肠黏膜下层剪开成片状，先置于脱细胞液a中浸泡16小时，漂洗，再置于脱细胞液b中浸泡16小时，然后采用缓冲溶液进行漂洗；其中，所述脱细胞液a含有下述质量百分比的组分：(a)0.5％edta三钠和(b)6％碳酸钠，所述脱细胞液b含有下述浓度的组分：(c)2mol/lhcl和(d)2.4mol/l氯化钠；所述脱细胞液a和脱细胞液b与小肠黏膜下层的体积比均为16：1；

(4)重复步骤(3)，将处理后的小肠黏膜下层置于pbs溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取30小时，采用缓冲溶液进行漂洗；所述除垢剂为曲拉通溶液，所述曲拉通溶液中曲拉通的质量百分比为1％。

(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于pbs溶液浸泡13小时，然后冷冻干燥、低温研磨，再筛选粒径为200μm的微粒，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

本实施例的一种植入剂，其由本实施例可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料组成，所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的质量与所述植入辅料的体积的比为1：1g/ml；其中，所述植入辅料由磷酸盐缓冲溶液、细胞生长因子和利多卡因(局部麻醉剂)组成，所述植入辅料中，细胞生长因子的浓度为0.1mg/l，利多卡因的浓度为0.1g/l。

本实施例的植入剂是将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料混匀得到。

实施例2

本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法的一种实施例，本实施例所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法为：

(1)取哺乳动物小肠组织，采用缓冲溶液进行漂洗，清除血液和小肠内容物，将其放入装有无菌注射用水配制的消毒剂中浸泡消毒，再进行反复冻融处理；其中，所述消毒剂由体积分数为5-30％的乙醇水溶液和体积分数为0.5-10％的过氧化氢水溶液组成；反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻0.5小时，然后取出，于37℃下解冻0.1小时；反复冻融的次数为5次。

(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中3小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为3mmol/l；

(3)将剥离的小肠黏膜下层剪开成片状，先置于脱细胞液a中浸泡24小时，漂洗，再置于脱细胞液b中浸泡24小时，然后采用缓冲溶液进行漂洗；其中，所述脱细胞液a含有下述质量百分比的组分：(a)0.01％edta四钠和(b)10％碳酸钾，所述脱细胞液b含有下述浓度的组分：(c)1.4mol/l磷酸和(d)0.8mol/l氯化钾；所述脱细胞液a和脱细胞液b与小肠黏膜下层的体积比均为4：1；

(4)重复步骤(3)，将处理后的小肠黏膜下层置于pbs溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取25小时，采用缓冲溶液进行漂洗；所述除垢剂为曲拉通溶液，所述曲拉通溶液中曲拉通的质量百分比为2.5％。

(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于pbs溶液浸泡10小时，然后冷冻干燥、低温研磨，再筛选粒径为20μm的微粒，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

本实施例的一种植入剂，其由本实施例可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料组成，所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的质量与所述植入辅料的体积的比为1：10g/ml；其中，所述植入辅料由生理盐水、细胞生长因子和布比卡因(局部麻醉剂)中组成；所述植入辅料中，细胞生长因子的浓度为50mg/l，布比卡因的浓度为5g/l。

本实施例的植入剂是将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料混匀得到。

实施例3

本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法的一种实施例，本实施例所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法为：

(1)取哺乳动物小肠组织，采用缓冲溶液进行漂洗，清除血液和小肠内容物，将其放入装有无菌注射用水配制的消毒剂中浸泡消毒，再进行反复冻融处理；其中，所述消毒剂由体积分数为5-30％的乙醇水溶液、体积分数为0.2-2％的过氧乙酸水溶液和体积分数为0.5-10％的过氧化氢水溶液组成；反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻3小时，然后取出，于37℃下解冻1小时；反复冻融的次数为2次。

(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中4.5小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为1.8mmol/l；

(3)将剥离的小肠黏膜下层剪开成片状，先置于脱细胞液a中浸泡12小时，漂洗，再置于脱细胞液b中浸泡10小时，然后采用缓冲溶液进行漂洗；其中，所述脱细胞液a含有下述质量百分比的组分：(a)0.1％edta三钠和(b)2％磷酸钠，所述脱细胞液b含有下述浓度的组分：(c)0.8mol/l硫酸和(d)4mol/l硫酸钠；；所述脱细胞液a和脱细胞液b与小肠黏膜下层的体积比均为30：1；

(4)重复步骤(3)，将处理后的小肠黏膜下层置于pbs溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取20小时，采用缓冲溶液进行漂洗；所述除垢剂为曲拉通溶液，所述曲拉通溶液中曲拉通的质量百分比为4％。

(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于pbs溶液浸泡16小时，然后冷冻干燥、低温研磨，再筛选粒径为110μm的微粒，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

本实施例的一种植入剂，其由本实施例可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料组成，所述可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的质量与所述植入辅料的体积的比为1：5g/ml；其中，所述植入辅料由磷聚电解质溶液和细胞生长因子、辛可卡因(局部麻醉剂)组成；所述聚电解质溶液中聚电解质的浓度为0.5-40g/l；所述植入辅料中，细胞生长因子的浓度为100mg/l，辛可卡因的浓度为20g/l。

本实施例的植入剂是将可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒和植入辅料混匀得到。

实施例4

本实施例采用elisa试剂盒检测了实施例1～3制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒中生长因子的含量，检测结果如表1所示。

表1

由表1可见，本发明制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒富含生长因子。

实施例5

本实施例采用电镜观察了实施例1～3制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的结构，其sem图如图1和图2所示。由图1和图2可见，本发明可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒结构疏松多孔，在保持支架结构的基础上，多孔的结构有利于细胞组织长入，和脂肪组织、软组织为原料制得的基质微粒相比，有更好的结构特点。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。