本申请要求2016年2月26日提交的美国临时申请No.62/300,142的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
政府权利
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)的国立癌症研究所(National Cancer Institute)(NCI)授予的基金号R01 CA120206和U01 CA168856下，由政府支持完成的。美国政府在本发明中具有一定权利。
技术领域
本公开涉及用于检测肝脏疾病、患者分层和治疗干预的测定法、试剂盒和方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的感染是肝细胞癌(HCC)的主要病因。HBV和HCV二者均引起急性和慢性肝脏感染，并且大多数慢性感染的个体保持多年的无症状，因为临床疾病(HCC和肝硬化)通常需要数十年才能发展。所有慢性HBV携带者中有10％至40％最终发展出肝癌，并且据估计全世界有超过一百万人死于HBV/HCV相关的肝癌。实际上，HBV和HCV感染与全世界所有HCC病例中超过80％的病例相关，并且在HBV流行的地区可高达96％。
肝脏疾病向肝癌的进展主要通过利用癌胚糖蛋白、甲胎蛋白(AFP)或AFP的核心岩藻糖基化糖型(AFP-L3)的血清水平来监测。然而，AFP可以在许多情况下产生，包括其他肝脏疾病，例如人肝癌、肝母细胞瘤和乙型肝炎感染，并且AFP并非在所有HCC患者中都存在。因此，使用AFP作为HCC的初筛已经受到质疑，并且对更灵敏的HCC血清生物标志物存在需求。
蛋白质的糖基化可以是细胞特异性的，并且蛋白质携带的N-连接聚糖是在它的来源细胞中发生的修饰。从恶性或患病组织分泌的蛋白质上的糖(聚糖)结构可能并且往往确实与来自正常细胞的相同蛋白质上存在的聚糖不同。实际上，许多研究已经观察到N-连接的糖基化随着肝硬化和肝细胞癌(HCC)发展而变化(参见例如Naitoh，A.等人，肝细胞癌患者中血清糖蛋白的岩藻糖基化高度提高(Highly enhanced fucosylation of serum glycoproteins in patients with hepatocellular carcinoma).J Gastroenterol Hepatol，14：436-445，1999；Block，T.M.等人，使用靶向糖蛋白质组学来鉴定与旱獭和人类肝癌相关的血清糖蛋白(Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans).Proc Natl Acad Sci U S A，102：779-784，2005)。例如，在慢性感染HCV并且诊断为HCC的个体中，来源于从血清分离的总蛋白质制品的岩藻糖基化N-连接聚糖的量始终大于健康对象或有HCV和“非活动性”疾病的那些人(Comunale，M.A.等人，在原发性肝细胞癌的发展中血清相关岩藻糖基化糖蛋白的蛋白质组学分析(Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma).Journal of Proteome Research.，6：308-315，2006)。
然而，尚不可能鉴定赋予高度的早期检测灵敏度和能力的单一糖蛋白、糖基化模式、生物标志物组、或其他HCC指标。对于HCC的早期检测剂仍然存在未解决的需求。
技术实现要素：
本文提供了用于检测对象中的肝细胞癌的方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在。
根据本公开测量的各个生物标志物的身份对于肝细胞癌检测的准确度来说是既特异又关键的，但为了简洁起见，在本发明内容中省略了本发明的生物标志物组合。
还公开了用于检测对象中的肝细胞癌的测定法，所述测定法包括测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量，其中所述测定法在所述测量步骤之前利用试剂从所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；确定所述对象的年龄和性别；以及利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在。
本公开还涉及用于检测对象中的肝细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包含用于从来自所述对象的生物流体中去除IgG蛋白的试剂和用于从生物流体中去除IgM蛋白的试剂；用于分别测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的试剂；以及利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在的说明书。
本文还提供了将对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组的方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及基于所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出，将所述对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组。
本公开还提供了怀疑患有肝细胞癌的对象的治疗管理方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及基于所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来治疗所述对象，其中当基于所述函数的输出确定所述对象患有肝细胞癌时，对所述对象进行该疾病的治疗。
附图说明
图1A-1C描绘了由岩藻糖基化低分子量激肽原、甲胎蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALK)、年龄和性别组成的组的评价结果。图1A总结了用于区分全部HCC患者(N＝115)与全部肝硬化患者(N＝93)、区分早期HCC(N＝69)与肝硬化(N＝93)、区分AFP阴性(AFP-，AFP水平在正常对象例如没有HCC的对象中观察到的范围内)HCC(N＝39)与AFP阴性肝硬化(N＝84)、以及区分早期且AFP阴性HCC(N＝29)与AFP阴性肝硬化(N＝84)的AUROC数据。图1B总结了在同一研究中以90％特异性界点(cutoff)区分相同的相应患者组的灵敏度值，并且图1C总结了在同一研究中以95％特异性界点区分相同的相应患者组的灵敏度值。
具体实施方式
通过结合形成本公开的一部分的附图和实施例参考以下详细说明，可以更容易理解本发明。要理解，这些发明不限于在本文中描述和/或显示的特定的方法、测定法、试剂盒、条件或参数，而且在本文中使用的术语只是为了示例性描述具体实施方式，并不意图限制所要求保护的发明。
本文件中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的全部公开内容在此通过引用并入本文。
在上文和整个公开内容中使用时，除非另有说明，否则以下术语和缩写应理解为具有以下含义。
在本公开中，没有具体数量指示的指称形式包括复数形式，并且提及特定数值至少包括该特定值，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“试剂”是指这样的试剂及其本领域技术人员已知的等同物中的一种或多种，等等。此外，当指示某个元素“可以是”X、Y或Z时，这样的用法并不打算在所有情况下都排除对该元素的其他选择。
当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方式。用于本文时，“约X”(其中X是数值)优选是指所叙述的值的±10％，包括端值。例如，短语“约8”可以指7.2至8.8的值，包括端值；作为另一个实例，短语“约8％”可以指7.2％至8.8％的值，包括端值。如果存在，所有范围都是包含性和可组合的。例如，当叙述“1至5”的范围时，所叙述的范围应被解释为任选包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”，“1-2和4-5”、“1-3和5”等。另外，当肯定性提供可选项列表时，这样的列表也可包括可以排除任何可选项的实施方式。例如，当描述“1至5”的范围时，这样的描述可以支持排除1、2、3、4或5中的任何一个的情况；因此，“1至5”的叙述可以支持“1和3-5，但不是2”，或简单地说“其中2不被包括在内”。
用于本文时，术语“治疗”或“疗法”(及其不同的单词形式)包括预防性(例如防预性)、治愈性、姑息性或抗增殖性治疗。这样的预防性、治愈性、姑息性或抗增殖性治疗可以是完全的或部分的。例如，完全消除不想要的症状或部分消除一种或多种不想要的症状将代表本文所考虑的“治疗”。
本公开尤其涉及用于检测肝细胞癌的方法、测定法和试剂盒，以及用于将对象在患肝细胞癌的较高风险和较低风险类别中进行分层的方法，以及怀疑患有肝细胞癌或具有患肝细胞癌风险的对象的治疗和治疗管理方法。除非另有说明，否则针对本公开的一个方面(例如结合本发明的方法、试剂盒和测定法中的任何一个)公开的步骤、试剂和因素(例如生物标志物)可以结合本公开的任何其他方面使用。
虽然以前的工作试图通过评估一种或多种生物因素来解决对高灵敏度的肝细胞癌早期预测指标的需求，但是均未接近临床相关确定对象、尤其是无症状对象是否有该疾患所需要的灵敏度。本发明人已经发现某些因素组合通过赋予以前达不到的高准确度水平而满足了这个需要。重要的是，所鉴定的组合可利用在单独基础上不代表肝细胞癌的准确检测指标的因素、可以省略传统上被认为代表疾病的指标的因素、或两者兼而有之。本文中更全面地描述了本公开的主题的这些和其他特征。
本文提供了用于检测对象中的肝细胞癌或确定对象患肝细胞癌的可能性的方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及利用所确定的年龄和性别以及生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在。
在本公开的主题的发现过程中，本发明人观察到不可能鉴定来自对象的生物流体内的某些糖型，包括含岩藻糖的糖型。本发明人确定在对象样品中存在的一些物质在用于鉴定糖型的测定法中产生非特异性信号，并最终发现主要混杂物质是IgM。进一步发现，去除IgM和IgG两者就去除了污染信号，并允许以从前不可能的方式准确分析特定蛋白质糖型。已经意外地确定，去除IgM以及IgG的步骤和用于完成这些步骤的试剂代表了根据本发明的方法、测定法和试剂盒来早期检测肝细胞癌的方法的临床必要方面。在一些实施方式中，通过将生物流体与蛋白A/G一起温育来去除IgG，发现这比其他被测试的策略更有效，并通过使生物流体穿过过滤器来去除IgM。所述过滤器可以是例如1000kD过滤器、900kD过滤器、800kD过滤器、500kD过滤器、450kD过滤器、400kD过滤器、350kD过滤器、300kD过滤器、250kD过滤器、200kD过滤器、175kD过滤器、150kD过滤器、125kD过滤器、100kD过滤器，80kD过滤器、75kD过滤器、70kD过滤器、60kD过滤器、50kD过滤器、40kD过滤器、30kD过滤器、25kD过滤器、20kD过滤器、15kD过滤器、或10kD过滤器。过滤可以例如通过重力或离心来完成。或者，可以通过利用聚乙二醇进行沉淀来去除IgG和IgM。根据这样的实施方式，可以将血清与聚乙二醇一起温育，然后进行离心，所得上清液代表在其中测量目标生物标志物的相应量的材料。
根据本发明可以使用任何生物流体。例如，生物流体可以是全血、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、粘液、或这些流体中两种或更多种的组合。
从生物流体中去除IgG和IgM后，测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量。生物流体中的生物标志物的“量”可以指其在所述生物流体中的浓度，例如以ng/mL表示，或者，在生物标志物是岩藻糖基化糖蛋白的情况下，可以指相对于生物样品中非岩藻糖基化的所述生物标志物的量，样品中岩藻糖基化的所述生物标志物的量。在一些实施方式中，岩藻糖基化生物标志物的量可以以相对于样品中生物标志物总量的百分比表示。
以前的工作已经鉴定到超过50种糖蛋白，它们在已知患有肝细胞癌、肝硬化或两者的对象中表现出岩藻糖基化增加(Comunale，M.A.等人，J Proteome Res.2006Feb；5(2)：308-15)。各种已发表的研究评估了单独的岩藻糖基化糖蛋白担当肝细胞癌标志物的能力，包括胎球蛋白-A(也称为α-2-HS-糖蛋白)(Comunale，MA等人，J.Proteome Res.2009；8；595-602)、激肽原(Wang，M等人，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2009；18；1914-1921)、α-1抗胰蛋白酶(同上)、血红素结合蛋白(Comunale，MA等人，2009)、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(Comunale，MA等人，Proteomics Clin.Appl.2013；7；690–700)、GP73(Drake，RR等人，Mol Cell Proteomics.2006；5；1957-67)、和LRAGG(凝集素反应性抗α-半乳糖IgG)(Mehta，AS等人，J Virol.2008；82；1259-1270)。在这些糖蛋白中，表现最佳的包括例如血红素结合蛋白(AUROC＝0.87)和胎球蛋白-A(AUROC＝0.90)。本发明人已经确定某些因素组合(可称为组)，其中一些因素是岩藻糖基化糖蛋白，可用于鉴定肝细胞癌的存在，其准确度明显高于通过评估任何单个糖蛋白或其他单个因素所得的准确度。出乎意料的是，在单独评估时担当肝细胞癌的最佳指标的某些糖蛋白，对包括这样的蛋白等的评估的因素(例如一种或多种其他岩藻糖基化糖蛋白)组只有中等贡献或甚至负面贡献。因此，发现以前鉴定单独的肝细胞癌指标的工作不能用于预测这些指标对用于鉴定患有肝细胞癌的对象的因素组的贡献。
根据本发明的方法，测量其相应量的生物标志物可以是下列一种或多种：碱性磷酸酶，GP-73，血红素结合蛋白，HBsAg，乙型肝炎病毒粒子，α-酸-糖蛋白，α-1-抗胰凝乳蛋白酶，α-1-抗胰凝乳蛋白酶His-Pro-less，α-1-抗胰蛋白酶，血清转铁蛋白，血浆铜蓝蛋白，α-2-巨球蛋白，胎球蛋白-A/α-2-HS-糖蛋白，甲胎蛋白，触珠蛋白，纤维蛋白原γ链前体，免疫球蛋白(包括例如IgA、IgD、IgE)，APO-D，激肽原，富含组氨酸的糖蛋白，补体因子1前体，补体因子I重链，补体因子I轻链，补体C1，补体因子B前体，补体因子B Ba片段，补体因子B Bb片段，补体C3前体，补体C3β链，补体C3α链，C3a过敏毒素，补体，C3bα'链，补体C3c片段，补体C3dg片段，补体C3g片段，补体C3d片段，补体C3f片段，补体C5，补体C5β链，补体C5α链，C5a过敏毒素，补体C5α'链，补体C7，B-2-糖蛋白，维生素D结合蛋白，间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2，α-1B-糖蛋白，血管紧张素原前体，血管紧张素-1，血管紧张素-2，血管紧张素-3，GARP蛋白，β-2-糖蛋白，簇集蛋白(Apo J)，整联蛋白α-8前体糖蛋白，整联蛋白α-8重链，整联蛋白α-8轻链，丙型肝炎病毒粒子，elf-5，激肽原，HSP33同源物，赖氨酰内肽酶，和含有富亮氨酸重复序列的蛋白质32前体。在一些实施方式中，根据本发明的方法测量这些糖蛋白的糖型。例如，可以测量这些糖蛋白的N-连接糖基化形式，例如所述生物标志物的岩藻糖基化N-连接糖型，并且特别地，可以测量核心-岩藻糖基化N-连接糖型。另外的生物标志物可以是丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、胆红素、白蛋白、血小板计数或白细胞计数中的一种或多种。另外，根据本公开，任何以上提到的因素的量随时间的变化可以代表“生物标志物”。
在某些实施方式中，测量其相应量的生物标志物是下列一种或多种：甲胎蛋白，岩藻糖基化胎球蛋白-A，岩藻糖基化血红素结合蛋白，岩藻糖基化激肽原，岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，和碱性磷酸酶(ALK)。在一个方面，本发明的方法包括测量甲胎蛋白、岩藻糖基化激肽原、ALK和AST。在另一个方面，本发明的方法包括测量甲胎蛋白、岩藻糖基化激肽原、ALK、AST和岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶。在又一个方面，本发明的方法包括测量甲胎蛋白、岩藻糖基化激肽原、ALK、AST和岩藻糖基化胎球蛋白-A。可选地，本发明的方法可以包括测量甲胎蛋白、岩藻糖基化激肽原、ALK、AST、岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶。根据本发明的方法测量的生物标志物的其他组合包括：甲胎蛋白和岩藻糖基化胎球蛋白-A；甲胎蛋白和岩藻糖基化血红素结合蛋白；甲胎蛋白和岩藻糖基化激肽原；甲胎蛋白、岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化血红素结合蛋白；甲胎蛋白、岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化激肽原；甲胎蛋白、岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶和岩藻糖基化激肽原；以及甲胎蛋白、岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶、岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化激肽原。
根据本发明的方法，可以使用任何可接受的用于确定所述生物标志物的相应量的方法。总蛋白质生物标志物例如总甲胎蛋白可以使用常规技术例如免疫测定法来检测。当所述生物标志物被糖基化时，检测试剂可直接标记糖基部分，例如经由碳水化合物特异性化学物质或染料，或经由标记的凝集素、标记的碳水化合物结合蛋白或标记的抗体来直接标记糖基部分。所述检测试剂可以是二级试剂，例如，首先捕获靶分析物，然后使捕获试剂-靶复合物与标记的二级试剂接触。在一些实施方式中，检测和定量可以通过以下方式来进行：从蛋白质分离糖基部分，然后可定量检测糖基化。在其他实施方式中，可以从生物流体中分离糖蛋白，然后可定量检测糖基化。这些和其他途径描述于2012年4月10日提交的美国公布No.2012/0196277中，所述美国公布的全部内容通过引用并入本文。当使用凝集素来检测糖基化蛋白时，所述凝集素可以是野生型，或者可以是对特定的目标聚糖具有增强的结合亲和力的重组凝集素。例如，2012年2月3日提交的美国公布No.2015/0198610公开了各种重组橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素，所述凝集素的特征在于与核心岩藻糖基部分的结合增强，已知与未患肝细胞癌的对象的糖蛋白相比，所述核心岩藻糖基部分在患有该疾病的对象的糖蛋白上存在的程度更高，所述美国公布通过引用并入本文。
ALT和AST的相应量可以利用基于AST和ALT的相应酶活性的动力学测定法，利用比色、分光光度、化学发光、色谱、荧光或UV吸光度、放射化学和电化学技术进行检测来确定。本领域普通技术人员熟悉这些测定法和技术。
根据本发明的方法，确定对象的年龄和性别。对象的年龄可以根据需要以年、月或日表示。年龄和性别以前已被证明在患有肝细胞癌的对象中是相关因素(参见Wang，M.等人，会议论文集.2012年IEEE国际生物信息学和生物医学会议(Proceedings.IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine 2012)；Wang，M.等人，BMC Medical Genomics，2013，6Suppl 3：S9)。
在测量特定生物标志物的相应量和确定对象的年龄和性别之后，利用所确定的年龄和性别以及所述生物标志物的相应测量量的函数的优化输出来确定肝细胞癌的不存在或存在。例如，所述函数可以包含针对所确定的年龄和性别以及针对生物标志物的测量量的相应优化加权系数。可以使用适当的统计方法来鉴定年龄、性别和生物标志物量的优化函数。例如，可以针对每个期望的因素组(即，生物标志物、年龄和性别)使用逻辑回归，以便生成逻辑回归算法。为了判断每个回归的拟合度，可以得出下列一个或多个：AIC，R2，Dxy，似然比检验，Pearson拟合优度，对数似然，偏差统计量，Tau-a，NRI，和表观验证的ROC曲线下面积(AUC)(参见Steyerberg，E.(2009)，“临床预测模型(Clinical Prediction Models)”，Springer-Verlag New York)。根据这些判据和检验，可以选择具有最高拟合度的逻辑回归模型用于进一步评价。任选地，为了避免过度拟合，可以应用留一交叉验证(leave-one-out cross-validation)、自展验证(bootstrap-validation)和3折交叉验证(3-fold cross-validation)中的一个或多个以验证候选模型。
年龄、性别和生物标志物量的优化函数产生表示对象患有肝细胞癌的概率的值。根据本发明的方法，所述值可以在临床相关的确定性水平上揭示所述对象患有肝细胞癌。例如，所述确定性水平可以是约50％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、约91％或更高、约92％或更高、约93％或更高、约94％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、或约98％或更高。因此，本发明的方法可用于以很高程度的确定性来确定对象是否患有肝细胞癌。
用于本文时，“检测肝细胞癌”或“确定肝细胞癌的不存在或存在”可以包括在对象中检测通常通过在本公开时已经存在的方法不能检测到的类型或阶段的肝细胞癌。例如，本公开的方法、测定法和试剂盒可用于确定对象是否患有早期肝细胞癌；甲胎蛋白阴性(AFP-)肝细胞癌；或早期肝细胞癌和甲胎蛋白阴性(AFP-)肝细胞癌(即，早期且AFP-的HCC)。
“甲胎蛋白阴性(AFP-)肝细胞癌”是指不以与没有肝脏疾病的对象中发现的AFP水平显著不同的AFP水平为特征的疾病。例如，当来自对象的生物样品中AFP的量小于约20ng/mL时，则可以说所述对象是AFP-。
有意义的是，本公开中提供的数据例如表3A和3B中的数据证明了本公开的方法、测定法和试剂盒提供了可以在对象中检测早期和/或甲胎蛋白阴性肝细胞癌的体系的能力。随后可以进行适当的治疗。本发明主题的这个方面的高度临床意义对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，尤其是考虑到早期肝细胞癌是可治愈的(而晚期疾病通常仅适于姑息治疗)。与本公开的主题不同，以前用于检测肝细胞癌的体系不能检测早期肝细胞癌、甲胎蛋白阴性(AFP-)肝细胞癌、或早期肝细胞癌和甲胎蛋白阴性(AFP-)肝细胞癌。
因此，本公开还提供了包括具体针对早期肝细胞癌、甲胎蛋白阴性肝细胞癌、或也是甲胎蛋白阴性肝细胞癌的早期肝细胞癌对对象进行治疗或建议治疗的方法。这样的方法可以是用于检测肝细胞癌的本公开方法的辅助，或者可以是使用本公开的测定法和试剂盒的结果。可以由执业医师来鉴定为早期肝细胞癌、甲胎蛋白阴性肝细胞癌、或也是甲胎蛋白阴性肝细胞癌的早期肝细胞癌具体定制的适当治疗。
示例性方法可以包括从来自怀疑患有早期肝细胞癌、AFP阴性肝细胞癌或二者的对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；利用所确定的年龄和性别以及生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中早期肝细胞癌、AFP阴性肝细胞癌或二者的不存在或存在；以及，如果确定所述对象中存在早期肝细胞癌、AFP阴性肝细胞癌或二者，则治疗所述对象或提供所述对象的治疗建议，其中所述治疗被具体地选择用于治疗早期肝细胞癌、AFP阴性肝细胞癌或二者的。这样的方法中涉及从生物流体中去除IgG和IgM蛋白、测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量、确定对象的年龄和性别、以及利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定疾病的不存在或存在的方面，可以根据前面公开的用于检测肝细胞癌的不存在或存在的方法的相应方面来进行。
还公开了用于检测对象中的肝细胞癌的测定法，所述测定法包括测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量，其中所述测定法在所述测量步骤之前利用试剂从所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；确定所述对象的年龄和性别；以及利用所确定的年龄和性别以及在所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在。
用于从生物流体中去除IgG的试剂可以是蛋白A/G。在其它实施方式中，所述试剂可以是蛋白L。在本文中针对本公开的测定法、方法和试剂盒使用时，用于去除IgM的“试剂”可以是实验室设备或机械系统的物品。例如，用于去除IgM的试剂可以是基于分子量的过滤器或过滤系统。例如，可以通过基于重力或离心的过滤进行过滤。在其它实施方式中，用于去除IgG和IgM二者的试剂可以是聚乙二醇，其非限制性实例包括PEG-400、PEG-3350、PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000。
为了定量检测所述一种或多种生物标志物，可以根据本发明的测定法使用各种不同测定形式中的任何一种。免疫测定法是一种优选的测定法，并包括但不限于ELISA、放射免疫测定法、竞争测定法、Western印迹、珠凝聚测定法、侧向流动免疫测定法、免疫层析测试条、试纸条、迁移形式免疫测定法等。其他合适的免疫测定法对于本领域相关技术人员来说是已知的。也可以使用显微镜检术。在一些实施方式中，色谱法代表所选的测定形式。高效液相色谱法(HPLC)是特别优选的。在一些实施方式中，质谱法是优选的测定法。在一些实施方式中，使用与密度计量法相结合的凝胶电泳作为测定形式。
所述测定法的一般形式可以包括使合适的试剂与含有目标分析物即生物标志物的测试样品接触，所述目标分析物可以与样品中发现的其他组分区分开。所述样品可以是来自所述对象的生物流体，或者可以是来源于所述生物流体的单独样品。在分析物与试剂相互作用之后，可以洗涤所述体系，然后直接检测或通过二级试剂检测。
在一些实施方式中，用于检测生物标志物的试剂被固定在固体载体上。在其它优选的实施方式中，将测试样品或从所述测试样品中分离或纯化的分子例如翻译后修饰的多肽固定在固体载体上。从样品例如细胞、组织或生物流体中纯化生物分子的技术是本领域公知的。所选择的技术可随所检查的组织或样品而变化，但是将适当的纯化程序与测试样品源相匹配则完全在本领域技术的范围内。
合适的固体载体的实例包括但不限于玻璃，塑料，金属，乳胶，橡胶，陶瓷，聚合物如聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯酰胺，葡聚糖，纤维素，硝化纤维素，pvdf，尼龙，淀粉酶等。固体载体可以是平面、凹面或凸面的、球形的、圆柱形的等，并且可以是粒子、珠子、膜、条、沉淀物、凝胶、片、容器、孔、毛细管、薄膜、板、载玻片等。所述固体载体可以是磁性的，或柱。
本发明的测定法中包括测量生物流体中的一种或多种生物标志物的量、确定对象的年龄和性别、以及利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定肝细胞癌的不存在或存在的步骤的其它方面，可以根据上文针对用于检测对象中的肝细胞癌的本发明方法所描述的任何方面来进行。
本公开还涉及用于检测对象中的肝细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包含用于从所述对象的生物流体中去除IgG蛋白的试剂、和用于从所述生物流体中去除IgM蛋白的试剂；用于分别测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的试剂；以及，利用所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来确定所述对象中肝细胞癌的不存在或存在的说明书。
用于从生物流体中去除IgG的试剂可以是蛋白A/G。在其它实施方式中，所述试剂可以是蛋白L。用于从生物流体中去除IgM的试剂可以是基于分子量的过滤器，例如1000kD过滤器、900kD过滤器、800kD过滤器、500kD过滤器、450kD过滤器、400kD过滤器、350kD过滤器、300kD过滤器、250kD过滤器、200kD过滤器、175kD过滤器、150kD过滤器、125kD过滤器、100kD过滤器，80kD过滤器、75kD过滤器、70kD过滤器、60kD过滤器、50kD过滤器、40kD过滤器、30kD过滤器、25kD过滤器、20kD过滤器、15kD过滤器、或10kD过滤器。过滤可以例如通过重力或离心来完成。
在某些实施方式中，用于去除IgG的试剂和用于去除IgM的试剂可以是相同的。该种类的示例性实施方式是聚乙二醇。
当生物标志物是多肽例如糖蛋白时，用于测量生物流体中的所述一种或多种生物标志物的试剂可以利用所述多肽含有一种或多种翻译后修饰(例如糖基化)的事实。翻译后修饰的检测可以通过检测某种多肽-部分复合物来完成。在另一个优选实施方式中，可以通过分离多肽和部分并检测所述部分来进行翻译后修饰的检测。所述多肽-部分复合物的检测可以使用特异性识别所述部分、特定类别的部分或作为与多肽的复合物的部分的试剂来进行。合适的检测试剂对于本领域技术人员来说是显而易见的，其非限制性实例在下文描述。所述试剂可包含多个分子，每个分子具有针对不同的靶部分的特异性，从而导致多个试剂-靶标相互作用。
用于检测生物标志物的试剂可以是抗体。例如，可以根据本发明的试剂盒使用特异性结合目标靶部分的任何抗体。可以使用从任何来源产生的单克隆和/或多克隆抗体，同样可以使用重组抗体如单链抗体和噬菌体展示的抗体、以及嵌合和人源化抗体。也可以使用抗体的抗原结合片段，如Fab或Fv。
在一些实施方式中，用于检测生物标志物的试剂是特异性识别糖蛋白的抗体。优选地，所述抗体特异性识别碳水化合物部分，包括单糖和多糖。在一些情况下，所述抗体特异性识别岩藻糖部分，例如核心岩藻糖基部分。能够特异性识别岩藻糖的抗体已有描述。参见例如Roy SS等人，(2002)Ann.Bot.89：293-9；以及，Srikrishna G等人，(1998)Glycobiology 8：799-811。或者，也可以生成针对各种部分、包括岩藻糖的抗体，并用于本发明。用于生成和纯化抗体的方法是本领域公知的。另外，单克隆抗体可以通过本领域已知的许多技术来制备，包括最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497开发的技术。
具有碳水化合物识别结构域的其他蛋白质也可以用作用于检测生物标志物的试剂。具有碳水化合物识别结构域的蛋白质已有描述，参见例如Bouyain S等人，(2002)J.Biol.Chem.277：22566-72(识别岩藻糖的果蝇蛋白CG2958(Drosophila melanogaster protein CG2958that recognizes fucose))。
在特别优选的实施方式中，凝集素用作用于检测生物标志物的试剂。凝集素可以从任何生物体获得，所述生物体包括植物、动物、酵母、细菌、原生动物等。纯化的凝集素是可商购的，参见例如Sigma-Aldrich目录(St.Louis，MO)。凝集素也可以通过本领域技术人员公知的手段，从它们天然存在的来源分离，或重组表达和纯化。凝集素可以但不需要是特异性针对特定碳水化合物部分的。岩藻糖特异性凝集素已有描述。参见例如Mansour MH等人，(2005)Immunobiology.210：335-48；Amano K等人，(2003)Biosci.Biotechnol.Biochem.67：2277-9；Loris R等人，(2003)J.Mol.Biol.331：861-70；和Ishida H等人，(2002)Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1002-8。2012年2月3日提交的美国公布No.2015/0198610公开了各种重组橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素，所述凝集素的特征在于与核心岩藻糖基部分的结合增强，所述美国公布通过引用并入本文。考虑了未来鉴定或开发的凝集素适合用作根据本公开检测所述一种或多种生物标志物的试剂。
具有凝集素样结构域的蛋白质也适合用作检测所述一种或多种生物标志物的试剂。具有凝集素样结构域的蛋白质是本领域已知的。参见例如Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9：585-90。
也可以使用基于核酸的凝集素替代物。这样的试剂被称为适体，其利用了单链核酸的巨大构象灵活性。从庞大的随机短核酸库中，已经通过迭代选择分离出对许多非核酸配体具有高亲和力的单个分子。聚糖结合性“凝集物(lectamer)”试剂的优点是浸出的DNA不太可能搅乱或干扰下游分析。凝集物可以在均一的结合条件(pH，离子强度)下起作用。合成核酸可以被制备成各种衍生化形式(例如末端生物素化的)。靶聚糖不受现有凝集素特异性的限制，显著扩展了现有的分级和分析能力。
用于检测生物标志物的试剂可以用可检测部分直接标记。或者，使用特异性识别一级试剂并用可检测部分标记的二级试剂。所述二级试剂可以是任何分子，例如抗体。所述二级试剂用可检测部分标记。被考虑用于本发明的可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光染料如荧光素、藻红蛋白、Cy-3、Cy5、别藻蓝蛋白、DAPI、德克萨斯红、罗丹明、俄勒冈绿、荧光黄等、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、角海葵(Cerianthus)橙色荧光蛋白、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶(neor、G418r)二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、lacZ(编码α-半乳糖苷酶)、和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-葡糖醛酸酶、胎盘碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶、或者萤火虫或细菌荧光素酶。酶标签与它们的关联底物一起使用。如同与本发明的实践相关的其它标准程序一样，技术人员知道可以使用的另外的标记。在一些实施方式中，将所述试剂或二级试剂与生物素偶联，并与具有可检测部分标签的亲和素或链霉亲和素接触。
在一些实施方式中，通过翻译后修饰与多肽生物标志物连接的部分可以被直接标记和检测，从而避免了对特异性识别特定部分的标记的试剂的需要以及对标记的二级试剂的任何需要。对本公开的目的而言，生物标志物的检测包括检测通过翻译后修饰与生物标志物连接的部分。在一些实施方式中，可以从生物标志物中分离通过翻译后修饰与生物标志物连接的部分，并对所述部分进行直接标记和检测。例如，但不作为限制，碳水化合物和碳水化合物部分可以使用本领域已知的各种方法直接标记。标记碳水化合物和碳水化合物部分的试剂盒是可商购的。碳水化合物和碳水化合物部分也可以被生物素化并用结合有亲和素或链霉亲和素的可检测部分例如本文所描述的那些进行标记。可直接标记寡糖的试剂的非限制性实例包括2-氨基苯甲酰胺和2-氨基苯甲酸。
可以通过本领域适合的任何手段从多肽生物标志物中分离翻译后连接的部分，所述手段包括化学手段，例如通过用肼或酸如氢氟酸或三氟甲磺酸处理；酶学手段，例如通过用N-糖苷酶例如PNGase F、O-糖苷酶、内切糖苷酶或外切糖苷酶处理；或物理手段。有可商购的试剂盒用于去除翻译后修饰，包括去糖基化。化学碱例如肼或引起β-消除反应的化学试剂也可用于去糖基化反应。其它技术和试剂是本领域技术人员能领会的，并被考虑在本公开的范围内。
在一些实施方式中，在标记或检测之前对所分离的先前翻译后连接的部分进行纯化。本领域已知的固相或液相提取技术可用于纯化所述分离的部分用于进一步分析。
如上所述，总蛋白质生物标志物例如总甲胎蛋白可以使用常规技术例如免疫测定法来检测，并且本发明的试剂盒中可以包括实施这样的技术所需的试剂。这对于利用比色、分光光度、化学发光、色谱、荧光或UV吸光度、放射化学和电化学技术进行检测的基于AST和ALT的相应酶活性的动力学测定法也是同样的。
本发明的试剂盒包括利用所确定的年龄和性别以及生物流体中生物标志物的测量量的函数的优化输出来确定对象中肝细胞癌的不存在或存在的说明书。所述函数可以根据上文针对用于检测对象中的肝细胞癌的本发明方法所提供的描述来提供。本公开还提供了如何可以产生所确定的年龄和性别以及测量的生物标志物量的适当函数的具体实例。
本文还提供了将对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组的方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及基于所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出，将所述对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组。
如上文根据用于检测对象中的肝细胞癌的本公开方法所提供的，所述年龄、性别和生物标志物量的优化函数产生表示所述对象患有肝细胞癌的概率的值。该值可以在下列确定性水平上揭示所述对象患有肝细胞癌：约90％或更高、约91％或更高、约92％或更高、约93％或更高、约94％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、或约98％或更高。根据将对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组的本发明方法，可以就所述优化的函数产生的值是否应该能将所述对象分配到具有较高或较低肝细胞癌概率的组而做出临床上适当的决定。例如，当由所述年龄、性别和生物标志物量的优化函数产生的值表明对象患有肝细胞癌并且与所述函数相关的确定性水平具有临床显著性时，可以将对象分配到“较高概率”组。例如，所述确定性水平可以是至少50％更高、至少60％更高、至少65％更高、至少70％更高、至少75％更高、至少80％或更高、至少82％或更高、至少84％或更高、至少85％或更高、至少86％或更高、至少88％或更高、或至少90％或更高。有经验的病理学家与生物统计学家、生物信息学家等合作，可以应用适当的统计方法来确定由年龄、性别和生物标志物量的特定优化函数所产生的值是否能将对象分配到有较高或较低肝癌概率概率的组。
本公开还提供了怀疑患有肝细胞癌的对象的治疗管理方法，所述方法包括从来自所述对象的生物流体中去除IgG和IgM蛋白；测量所述生物流体中的一种或多种生物标志物的量；确定所述对象的年龄和性别；以及基于所确定的年龄和性别以及所述生物流体中所测量的生物标志物的函数的优化输出来治疗所述对象，其中当基于所述函数的输出确定所述对象患有肝细胞癌时，对所述对象进行该疾病的治疗。
在应用适当的统计评估后，当对象的所确定的年龄和性别以及生物流体中所测量的生物标志物的优化函数的输出指示所述对象中存在肝细胞癌时，可以根据本发明的方法对所述对象进行治疗。当对象无症状时，本发明的方法有利地允许启动考虑了所述对象中的早期肝细胞癌的治疗方案。早期肝细胞癌的治疗可以根据公认的医疗实践来进行。当根据本发明的方法确定对象未患肝细胞癌时，可以针对可能适用的任何可选或前体疾患来治疗所述对象。例如，在所述对象被怀疑患有肝细胞癌时，可能已经知道所述对象已经表现出或随后被发现具有(例如，作为因肝细胞癌的阴性诊断而促使的测试的结果)任何常见的风险因素，例如酒精中毒、乙型肝炎或丙型肝炎、黄曲霉毒素、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、血色沉着病、威尔森氏病(Wilson's disease)、2型糖尿病、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)或血友病。代表肝细胞癌风险因素的任何一种或多种疾患的治疗可以根据由本领域普通技术人员确定的适当措施进行。另外，如果确定对象未患肝细胞癌，则可以要求所述对象服从定期监测，这可以包括在一个或多个未来的场合对所述对象进行肝细胞癌测试。对于本发明方法的目的而言，“治疗”可以包括对对象进行定期监测，以便在最初确定所述对象未患肝细胞癌后确认所述对象是否发展出肝细胞癌。例如，根据本发明的方法，基于所确定的年龄和性别以及生物流体中所测量的生物标志物的优化函数的输出确定对象未患肝细胞癌，可以对所述对象进行一个或多个附加的系列测试以确定所述对象是否随后发展出肝细胞癌。附加的测试可以在肝细胞癌初次阴性诊断后例如两个月、三个月、六个月、八个月、一年、18个月、两年、30个月或三年进行，并且例如每三个月、每六个月、每年、每18个月、每两年、每30个月、每三年、每四年、或每五年进行一次，直到发现所述对象患有肝细胞癌。所述附加的测试可以根据用于检测对象中的肝细胞癌的本发明方法来进行。
实施例
阐述以下实施例以便为本领域普通技术人员提供关于本文要求保护的方法、试剂盒和测定法是如何开发和评价的完整公开和描述，并且所述实施例旨在纯粹是本发明的示例，并不意图限制发明人认为的发明的范围。已经努力确保关于数字(例如量)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。
实施例1–临床数据分析和HCC预测指标鉴定
使用来自两个临床群组的数据完成了本发明预测指标的开发：一个临床群组由115名HCC患者和93名肝硬化患者组成(该群组的肝功能测试数据可得)，另一个临床群组由66名HCC患者、38名肝硬化患者组成(该群组的肝功能测试数据不可得)。
使用二十四种特征选择算法来探查每种潜在的组成分(panel constituent)(血清生物标志物；患者人口统计学因素)和组合。应用的特征选择算法包括：相关特征选择过滤(cfs过滤)，卡方过滤，基于一致性的过滤，线性相关过滤，秩相关过滤，信息增益过滤，信息比过滤，系统不确定性，穷举搜索算法，贪婪向前搜索，贪婪向后搜索，爬山搜索，oneR算法，随机森林过滤，有3个近邻的relief过滤，有5个近邻的filter过滤，逐步逻辑回归，逐步惩罚逻辑回归，惩罚svm，bestglm(bic)，bestglm(aic)，鲁棒逻辑回归，GLM的贝叶斯(Bayesian)分数多项式(glmBfp)，和贝叶斯模型平均(BMA)。随后，以由所述24个特征选择算法提供的预测指标子集来应用逻辑回归。有21个子集特征选自所述特征选择算法和购物篮分析。为此，将全部预测指标和AFP添加到该商议子集中，并由此构建了23个逻辑回归算法。为了判断每个回归的拟合度，发明人导出了AIC、R2、Dxy、似然比检验、Pearson拟合优度、对数似然、偏差统计量、tau-a、NRI、和表观验证的ROC曲线下面积(AUROC)。根据这些判据和检验，选择具有最高拟合度的四个逻辑回归模型用于进一步评价。为避免过度拟合，应用了留一交叉验证、自展验证和三折交叉验证，以便验证所述四种候选模型。
评估了14个生物标志物、临床和人口统计学变量：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，胆红素(BIL)，白蛋白(ALB)，血小板(PLT)，碱性磷酸酶(ALK)，白细胞(WBC)，甲胎蛋白(AFP)，岩藻糖基化A1AT，岩藻糖基化低分子量(LMW)激肽原，岩藻糖基化胎球蛋白-A，岩藻糖基化血红素结合蛋白，年龄和性别。AFP值在宽范围内分布(1至347,000ng/ml)，并进行对数转换用于进一步分析。由于其余因素的数据分布不影响统计分析和算法探索，因此使用原始数据格式。
初步分析表明，AFP、ALK、AST、年龄和男性性别与HCC概率呈正相关。HCC组中男性比例高，比值比为1.75，χ2＝5.36，df＝1，p＝0.02056。发现包含AFP产生了用于区分HCC的超高AUROC值。当在没有岩藻糖基化生物标志物的情况下使用AFP时，AUROC值从只有AFP时的0.8016变化到包括四个附加因素(年龄，性别，ALK，ALT)时的0.9066。增加变量的数目并没有使AUROC改变到超过这个值，提示需要包含新的生物标志物来驱动检测。
为此，进行含有各种生物标志物的组的评估。AFP、岩藻糖基化低分子量(LMW)激肽原、岩藻糖基化A1AT、年龄和性别的组合产生的AUROC为0.9405。添加AST和ALK使AUROC增加至0.9835。消除岩藻糖基化A1AT使AUROC略降低至0.9826。这后一种最小组由岩藻糖基化LMW激肽原、AFP、AST、ALK、年龄和性别组成，产生下面的算法A，并用于生成如图1A-1C所示的患者子集数据(按早期和AFP阴性疾病划分)。
算法A
图1A-1C描绘了由岩藻糖基化低分子量激肽原、甲胎蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALK)、年龄和性别组成的组的评价结果。在HCC和肝硬化患者的三个不同群组中的一个群组内对所述组进行评估。所述三个患者群组分别具有下表1中描述的特征：
表1
在用于生成图1数据的人群中，HCC的病因是61％HCV、6％HBV和33％其它，并且肝硬化的病因是48％HCV、10％HBV和42％其它。图1A总结了用于区分全部HCC患者(N＝115)与全部肝硬化患者(N＝93)、区分早期HCC(N＝69)与肝硬化(N＝93)、区分AFP阴性HCC(N＝39)与AFP阴性肝硬化(N＝84)、以及区分早期且AFP阴性HCC(N＝29)与AFP阴性肝硬化(N＝84)的接收者工作特征曲线下面积(AUROC)数据。95％置信区间(CI)在所有情况下均不重合。图1B总结了在同一研究中以90％特异性界点区分相同的相应患者组的灵敏度值，并且图1C总结了在同一研究中以95％特异性界点区分相同的相应患者组的灵敏度值。
如上所述，将AST和ALK纳入所开发的模型中使AUC从0.9405增加至0.9835。纳入这两个临床变量意外地抵消了对包含所述岩藻糖基化生物标志物之一的需要，所述岩藻糖基化生物标志物在这种情况下是岩藻糖基化A1AT：当将AST和ALK加入到该等式中并且从所述算法中弃去岩藻糖基化A1AT时，AUC保持在0.9826，提示高度预测性基本模型纳入了年龄、性别、激肽原、ALK和AST。
以前的工作将岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化血红素结合蛋白鉴定为非常好的独立肝细胞癌指标(Comunale，MA等人，J.Proteome Res.2009；8；595-602)。对这些独立藻糖基化生物标志物对于还包括年龄、性别和AFP(log)的组的贡献进行了评估。使用下面显示的算法B来测试包括岩藻糖基化胎球蛋白-A和岩藻糖基化血红素结合蛋白的组：
算法B
使用另一种算法对相同的组成员(组4，下表2所示)进行分开的测试，产生的AUC为0.8461。当用激肽原替换血红素结合蛋白时(表2中的组5b)，AUC增加至0.8661。
下面表2中提供了包括年龄、甲胎蛋白和其他指定生物标志物的组的评估结果总结。
表2
下面的表3A和3B提供了用于通过1号组(如上面表2所示)来区分下列患者的AUROC(95％置信区间)、在指定的固定特异性下的灵敏度(95％置信区间)以及阳性(LR+)和阴性(LR-)似然比：(1)HCC(N＝115)与肝硬化(N＝93)；(2)早期HCC(UNOS T1/2；N＝69)与肝硬化(N＝93)；(3)AFP-阴性HCC(<20ng/mL；N＝39)与AFP-阴性肝硬化(<20ng/mL；N＝84)；以及(4)早期(UNOS T1/2)和AFP-阴性HCC(<20ng/mL；N＝29)与AFP-阴性肝硬化(<20ng/mL；N＝84)。[HCC病因(％)＝HCV(61)、HBV(6)、其它(33)；HCC性别(M/F％)＝73/27；肝硬化病因(％)＝HCV(48)、HBV(10)、其它(42)；肝硬化性别(M/F％)＝51/49]。这些数据是利用直接从算法A获得的HCC组评分(P值)获得的。
表3A
表3B
下面的表4A和4B提供了用于通过11号组(如上面表2所示)来区分下列患者的AUROC(95％置信区间)和在指定的固定特异性下的灵敏度(95％置信区间)：(1)HCC(N＝115)与肝硬化(N＝93)；(2)早期HCC(UNOS T1/2；N＝69)与肝硬化(N＝93)；(3)AFP-阴性HCC(<20ng/mL；N＝39)与AFP-阴性肝硬化(<20ng/mL；N＝84)；以及(4)早期(UNOS T1/2)和AFP-阴性HCC(<20ng/mL；N＝29)与AFP-阴性肝硬化(<20ng/mL；N＝84)。[HCC病因(％)＝HCV(61)、HBV(6)、其它(33)；HCC性别(M/F％)＝73/27；肝硬化病因(％)＝HCV(48)、HBV(10)、其它(42)；肝硬化性别(M/F％)＝51/49]。这些数据是使用算法A(但是用ALT值替代AST值)和三折交叉验证获得的。
表4A
表4B
在审阅整体数据时，出乎意料的是，对表现最高的组有贡献的变量倾向于是在单独基础上作为肝细胞癌指标最不有效的那些变量。例如，血红素结合蛋白在单独使用时产生最高AUC值(患者集b中为0.8695)，并且A1AT(患者集a)、AFP(患者集a)和激肽原(患者集a)在单独使用时产生最低AUC值(分别为0.7395、0.8346和0.8192)，但后者促成了比含有血红素结合蛋白的那些组表现更高的组。从这些数据获悉，不可以基于特定生物标志物确定肝细胞癌存在的独立能力来预测该生物标志物对于组的贡献。
数据还揭示了所测试的组允许检测早期肝细胞癌、AFP阴性肝细胞癌和也是AFP阴性肝细胞癌的早期肝细胞癌的能力。
实施例2-将IgG和IgM鉴定为测定法污染物
用于检测肝细胞癌的平板基测定法通常受到存在的嗜异性抗体和潜在的其他凝集素结合性污染物的阻碍。已知这样的污染物会导致假阳性结果。进行研究以鉴定肝硬化和肝癌患者血清中存在的污染性凝集素反应性因子。如下所述，本发明人将IgM鉴定为污染性凝集素反应性因子，并且当在凝集素-ELISA之前从血清中去除IgM时，可以检测到特异性蛋白质相关的凝集素反应性信号。在两个独立的样品集中使用这种方法，以验证该方法并且还验证岩藻糖基化糖型作为肝细胞癌的生物标志物的性能。
方法
从每个测试对象的血液中获得血清样品，同样获得患者群体的人口统计学和临床信息。在研究中入选连续的HCC患者，以及年龄、性别和人种/种族与所述HCC患者匹配的肝硬化患者。HCC的诊断是通过包括所有T1病变的组织病理学来进行的，并且如果组织病理学不可用，则通过显示血管增强肿块>2cm的两种成像方式(超声、磁共振成像或计算机断层扫描)来进行。肝硬化的诊断是基于肝脏失代偿或门脉高压的肝脏组织学或临床、实验室和成像证据。每位肝硬化患者都具有正常超声，并且如果血清AFP升高，则通过在入选前3个月内肝脏MRI和入选后6个月的另一次MRI显示没有肝脏肿块。入选后，肝硬化对照的随访中位数为12个月(范围：7-18个月)，没有人发展出HCC。利用器官共享联合网络(United Network of Organ Sharing)修订的TNM分期系统对HCC确定肿瘤分期。早期HCC被定义为T1(直径<2cm的单个病灶)和T2(直径在2和5cm之间的单个病灶；或<3个病灶，每个病灶的直径<3cm)病变，符合美国肝脏移植标准。从每个对象抽取20ml血液样品，离心，分装，并将所得血清储存在-80℃直至进行测试。在开始HCC治疗之前抽取血液样品。使用可商购的免疫测定法，利用增强化学发光来测试AFP。
凝集素FLISA
简单地说，为了去除捕获抗体(小鼠抗人AAT或兔抗胎球蛋白，AbD SeloteC，Raleigh，NC)的岩藻糖基化，将所述抗体与10mM高碘酸钠一起在4℃温育1小时。添加等体积的乙二醇，并用pH 9.5的碳酸钠缓冲液使氧化的抗体达到10μg/ml的浓度。将抗体(5μg/孔)添加到板中，并在温育后，用0.1％Tween 20/PBS 7.4洗涤，并用3％BSA/PBS阻断过夜。为了分析，将5μL血清稀释在95μL的嗜异性阻断管TM(Heterophilic Blocking TubesTM)(Scantibodies Laboratory，Inc.，Santee，CA)中，并在室温下温育1小时。随后，将样品添加到板中2小时，并在凝集素温育缓冲液(10mM Tris pH 8.0，0.15M NaCl，0.1％Tween 20)中洗涤五次，然后用结合有生物素的橙黄网胞盘菌(AAL)凝集素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)检测岩藻糖基化蛋白。使用结合有IRDyeTM800的链霉亲和素检测结合的凝集素，并使用红外成像系统(LI-COR Biotechnology，Lincoln，NE)测量信号强度。在所有情况下，将信号强度与用商业购买的人血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)检测的信号进行比较。应注意，凝集素-FLISA检测来自每个患者样品的等量捕获分子上存在的岩藻糖基化的量，并以与任何给定患者中的蛋白质总量无关的方式进行。
污染因素的蛋白质组学鉴定
凝集素-Western
使用蛋白A/G包被的琼脂糖珠去除血清中的IgG，并使用包被有单克隆抗A1AT(AbD Serotec，Raleigh，NC)的磁性(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)进行A1AT免疫沉淀。随后，洗脱A1AT并经由SDS-PAGE解析。使用结合有生物素的橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)检测岩藻糖基化A1AT。使用结合有IRDyeTM800的链霉亲和素检测结合的AAL，并使用红外成像系统(LI-COR Biotechnology，Lincoln，NE)测量信号强度。随后，用多克隆抗A1AT(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)检测A1AT，并用结合有IRDyeTM700的抗兔抗体检测结合的抗体。
在先前对40名患者(20名患有肝硬化以及20名患有肝硬化和HCC)小样品集的分析中，凝集素-ELISA的方法不能特异性地检测给定蛋白质的岩藻糖基化改变。例如，对岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)进行凝集素ELISA。在该方法中，将已被修饰成去除其固有岩藻糖基化的A1AT抗体包被在96孔板的底部。添加利用蛋白A/G去除IgG的血清，并用重组橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)检测捕获的A1AT的岩藻糖基化水平。当使用HCC血清进行这样的测定法时，观察到凝集素反应性信号。然而，不可能用非岩藻糖基化的A1AT竞争该信号，即使在非岩藻糖基化A1AT已与捕获抗体结合的情况下。此外，使用非特异性抗体，例如在AFP阴性患者中使用AFP，导致相同的非特异性信号。在分析之前将样品进行胰蛋白酶消化证实该信号是基于蛋白质的。
将IgM鉴定为潜在的污染物
为了鉴定血清中发现的非特异性凝集素反应性物质，在96孔板中对A1AT进行凝集素ELISA。使用与正常凝集素ELISA相同的条件将板与血清一起温育，但在添加凝集素之前，将样品与SDS裂解缓冲液一起温育，并经由SDS-PAGE和通过胶体考马斯亮蓝染色用岩藻糖结合性凝集素进行凝集素印迹、或通过对人A1AT的存在进行印迹来检查样品。在～80kD的条带处观察到强凝集素染色，并在50kD处观察到较弱的条带。虽然在用胶体考马斯亮蓝染色和通过用A1AT抗体染色后也观察到该50kD条带，但经由用胶体考马斯亮蓝染色或A1AT凝集素印迹均未观察到～80kD条带。这提示这些样品中的非特异性凝集素反应性物质是高度岩藻糖基化的80kD糖蛋白。随后，在ELISA捕获后收集相同处理的孔，并在用胰蛋白酶消化后进行蛋白质组学检查。在这些样品中鉴定到的糖蛋白列表显示在下表5中，并观察到尺寸与在凝集素印迹中观察到的尺寸相似的两种主要蛋白质：补体B和IgM重链。
表5
随后，用抗补体B和抗IgM抗体重复上述相同的凝集素ELISA实验。虽然在用抗补体B抗体捕获的物质中没有染色，但免疫印迹显示在这些样品中发现的80kD凝集素反应性物质是IgM重链。80kD条带代表IgM重链，其指示整个IgM分子。总计每个IgM分子有10条重链。
为了从血清样品中去除天然IgM，开发了在凝集素-ELISA分析之前从血清中去除该物质的方法。最初，使用蛋白L，但产生的结果不令人满意。随后使用的方法包括将血清与20μl的PierceTM蛋白A/G Plus(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA)一起温育1小时，然后在100kD离心过滤器中过滤所述混合物，以便在凝集素ELISA之前从血清中去除IgG和IgM二者。当使用这种方法时，从血清中有效地去除了IgG和IgM，如通过免疫印迹或凝集素印迹二者所确定的。随后，在使用该方法去除IgM和IgG后，可以使用非岩藻糖基化A1AT来阻断凝集素反应性A1AT信号，证实了以下发现：IgG和IgM的存在造成了在这些样品中观察到的污染信号。
利用凝集素-ELISA方法先前失败的小样品集来检查该方法用于分析A1AT的岩藻糖基化糖型的能力。该集由20名肝硬化患者和20名在肝硬化背景下患有HCC的患者组成。重要的是，在这个集中，确定了示出凝集素反应性A1AT的凝集素-western数据，并且所述数据充当凝集素-ELISA的金标准(Comunale，MA等人，Proteomics Clin.Appl.2013；7；690–700)，并且允许在有和没有过滤的凝集素-ELISA的性能之间进行比较。使用未过滤方法，肝硬化样品的平均值为3.2(±2.0)，HCC样品为2.9(±1.8)。这些样品中的凝集素反应性信号之间没有统计学差异(p＝0.74)。该测定法的AUROC为0.578。相反，使用本发明的过滤方法，凝集素ELISA导致在肝硬化样品中的平均值为1.4(±0.75)，在HCC样品中为2.4(±1.1)。这种差异有统计学差异(P＝0.0016)。当比较过滤前和过滤后的样品时，过滤之前和之后的肝硬化样品之间有统计学差异(p＝0.0005)，但过滤之前和之后的HCC样品之间没有统计学差异(p＝0.5249)。
过滤后的HCC和肝硬化样品之间的比较的AUROC为0.788，与通过凝集素-western观察到的几乎相同(Comunale等人，2013)。重要的是，过滤后的凝集素-western和凝集素-ELISA之间存在高度相关性。重要的是，过滤后的每个凝集素-ELISA阳性样品都被凝集素-western显示为阳性，并且在过滤后通过凝集素-ELISA显示为阴性的每个样品都被凝集素-western显示为阴性。
该测定法随后用于评估80个独立样品中岩藻糖基化α-1-抗胰蛋白酶和岩藻糖基化激肽原的存在。利用过滤凝集素-ELISA和未过滤的凝集素-ELISA检查样品。虽然未过滤的分析导致HCC和对照样品之间没有差异，但过滤的分析确实产生统计学显著性差异。
去除IgG和IgM污染物的可选程序。
开发了去除IgG和IgM的可选方法，由此将血清与PEG-8000一起温育，离心，并在凝集素ELISA中测定上清液。例如，为了分析岩藻糖基化A1AT或岩藻糖基化胎球蛋白-A，将2μL血清添加到8μL PBS中并随后添加6μL的40％PEG-8000水溶液，使最终PEG-8000浓度为15％。将样品通过吸入和排出移液管10-20次、然后短暂涡旋来混合。接着将样品在振荡机上以1000-1500rpm温育30分钟，然后在缓慢振荡下继续在4℃温育过夜。次日早上，将样品在4℃以14,000rpm离心，并将上清液快速转移到新管中，然后进行凝集素ELISA。利用与用于去除免疫球蛋白的原始程序类似的方法，例如通过免疫印迹或通过凝集素印迹来证实IgG和IgM去除效能。