ILC2的功能可塑性、免疫和COPD的制作方法
先天淋巴样细胞(ilc)是最近描述的组织驻留的先天淋巴样细胞群，其在炎症中具有不同的作用，包括防御病原体、维持上皮屏障功能、防范共生微生物群、组织修复、和代谢调节。(artis,d.&spits,h.thebiologyofinnatelymphoidcells[先天淋巴样细胞的生物学].nature[自然]517,293-301(2015)；mckenzie,a.,spits,h.,&eberl,g.innatelymphoidcellsininflammationandimmunity.[炎症和免疫中的先天淋巴样细胞]immunity[免疫]41,366-374(2014))。尽管这些细胞数量有限，但它们对持续的免疫应答有显著影响。ilc被分类为与辅助性cd4+t细胞谱系非常相似的功能上离散的亚群(ilc1、ilc2和ilc3)。调节cd4+t细胞辅助性亚群的许多转录因子和细胞因子在相应的ilc组中也起关键作用。因此，t-bet已经显示对ilc1发育和功能是关键的，而gata-3和rorγt分别是ilc2和ilc3功能所必需的。
尽管ilc已被分组为不同的表型亚群，但是出现的证据表明ilc不是“固定的”，并且取决于炎症环境，这些细胞展示出相当大的功能可塑性。(artis等人；diefenbach,a.,colonna,m.,&koyasu,s.development,differentiation,anddiversityofinnatelymphoidcells[先天淋巴样细胞的发育、分化和多样性].immunity[免疫]41,354-365(2014))。例如，人类ilc1可以应答于局部的环境信号(例如il-1β、视黄酸和il-23)而分化成ilc3。这种分化成ilc3的能力是双向的，因为ilc3可以在il-12的存在下分化成ilc1。此外，肠驻留的ilc3共表达t-bet和rorγt，并且已经显示应答于微生物区系驱动的信号(il-23、或il-12+il-18)而产生ifnγ。最后，ilc3可以应答于tlr2配体而产生il-5和il-13，这表明ilc3可以分化成ilc2。然而，尽管已经证明了ilc1和ilc3亚群之间的可塑性，但不清楚ilc2是否展示出任何生理学相关的功能柔性。最近的报告分析了不同ilc亚群之间的基因表达谱，揭示了ilc2是最同源的并且与其他亚群不同(robinette,m.l.等人transcriptionalprogramsdefinemolecularcharacteristicsofinnatelymphoidcellclassesandsubsets.[转录程序定义了先天淋巴样细胞类别和亚群的分子特征]natimmunol[自然免疫学]16,306-317(2015))，这与ilc2可能具有比ilc1和ilc3更有限的过继替代表型的能力的观点是一致的。
慢性阻塞性肺疾病(copd)是一种与长期香烟烟雾暴露有关的障碍，并且其特征是肺功能进行性、不可逆的丧失。copd患者的亚群在呼吸道感染后经历症状的急性恶化，并且这些恶化是发病率和死亡率的重要原因。呼吸道病原体流感、呼吸道合胞体病毒(rsv)、鼻病毒(hrv)和非分型流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)是copd相关的恶化的主要疑似触发条件。预计到2030年，copd将成为全球第三大死亡原因；然而，很少有人了解copd相关的触发条件如何影响肺部的免疫应答。在小鼠模型中，许多il-1家族成员细胞因子(包括il-1、il-18、和il-33)与烟雾相关的炎症和恶化有关。(kearley,j.等人cigarettesmokesilencesinnatelymphoidcellfunctionandfacilitatesanexacerbatedtypeiinterleukin-33-dependentresponsetoinfection.[香烟烟雾沉默了先天淋巴样细胞功能并促进i型白细胞介素-33依赖性感染应答恶化]immunity[免疫]42,566-579(2015))。kearley等人之前报道了香烟烟雾与st2受体表达的显著再分布相关，其结果改变了肺部的il-33应答性，远离th2相关的ilc2对th1-偏斜的nk细胞和巨噬细胞的应答。因此，肺部驻留ilc群的改变可对所得到的炎症应答的类型和量级产生显著影响。
小鼠肺部的大多数ilc是ilc2，尽管有罕见但数量可观的1型和3型ilc。香烟烟雾暴露与肺部驻留ilc引起的th2细胞因子的减少的产生相关，但这种环境下局部ilc亚群之间的动态和发育关系仍未进行探索。在本发明中，已经发现ilc2展示出相当大的功能可塑性，其依赖于促进ilc2向ilc1分化的局部il-12和il-18信号。
技术实现要素：
ilc是粘膜免疫的关键介质，之前已经建立了组1和组3ilc之间的表型可塑性。本文证明了驻留肺部的ilc2还展示出应答于传染性或有害试剂的功能可塑性，其特征在于gata-3的丧失并且伴随转换为产生ilc1的t-bet+ifn-γ。th1细胞因子、il-12和il-18诱导这种转化，而过继转移的gfp+ilc2簇在发炎区域内过继应答于病毒的ilc1样表型。在机制上，这些ilc1以t-bet依赖性方式显著增加病毒诱导的炎症。值得注意地，il-12可以将人类ilc2转化为产生ilc1的t-bet+ifn-γ，并且copd患者中ilc1的频率与疾病严重程度和恶化的敏感性相关联。总的来说，这些数据证明ilc2的功能可塑性可以导致恶化的抗病毒免疫，这可能对copd等呼吸系统疾病产生不良结果。
本发明的一些主要方面总结如下。另外的方面描述于此披露的具体实施方式、实例、附图、和权利要求书部分。此披露的每个部分中的描述旨在与其他部分一起阅读。此外，此披露的每个部分中所述的各种实施例能以各种不同的方式进行组合，并且所有此类组合旨在落入本发明的范围之内。
在一个方面，本披露提供了抑制先天淋巴样细胞(亚群2)(ilc2)转化为先天淋巴样细胞(亚群1)(ilc1)的方法，该方法包括使ilc2与调节剂接触，该调节剂预防ilc2转换为t-bet+ifnγ+ilc1、保持或阻遏ilc1上il-12受体或il-18受体表达的水平、和/或保持或增加ilc2上st2或gata3表达的水平。
在披露的方法中，与调节剂接触的ilc2可以是ilc2的局部库，或定位于肺部或肺部组织，或可以是循环ilc2。在本发明的另外的方面，抑制转化为ilc1的ilc2可以是循环ilc2，或可以是定位于其他组织(特别是可能受肺部炎症疾病或copd影响或与其相关的组织)的ilc2。
在其他方面，本披露提供了预防或治疗有需要的受试者中与肺部炎症相关的疾病或障碍的方法，其中与ilc1的预定水平相比和/或与一个或多个对照样品中的ilc1水平相比，在取自受试者的一个或多个样品中确定该受试者具有升高的ilc1水平。
在其他方面，本发明还提供了预防或治疗有需要的受试者中与肺部炎症相关的疾病或障碍的方法，由此与ilc1/ilc2的预定比率相比和/或与一个或多个对照样品中的ilc1/ilc2比率相比，在一个或多个取自所述受试者样品中确定该受试者具有升高的ilc1/ilc2比率。
本发明还提供了预防或治疗有需要的受试者中与肺部炎症相关的疾病或障碍恶化的方法，该方法包括给予所述受试者疾病调节药物，由此与ilc1的预定水平相比和/或与一个或多个对照样品中ilc1的水平相比，在取自所述受试者的一个或多个样品中确定所述受试者具有升高的ilc1水平。
在本发明的方法中，肺部炎症可以由香烟烟雾、细菌感染或病毒感染引起。此外，在本发明的方法中，疾病或障碍是慢性阻塞性肺疾病(copd)。
本发明还提供了选择被诊断患有与肺部炎症相关的疾病或障碍的患者作为用疾病调节药物治疗的候选者的方法，该方法包括如果与ilc1/ilc2的预定比率相比和/或与一个或多个对照样品中ilc1/ilc2的比率相比，在取自所述受试者的一个或多个样品中确定该患者具有升高的ilc1/ilc2比率，则选择该患者进行治疗。在某些实施例中，疾病调节药物是ilc2向ilc1转化的调节剂、支气管扩张剂、吸入类固醇、组合吸入剂、口服类固醇或磷酸二酯酶-4抑制剂。
在具体的实施例中，具有升高的ilc1/ilc2比率的确定或具有升高的ilc1水平的确定是基于ilc2的分子标记与ilc1的分子标记之间的转换的确定。在另外的实施例中，ilc2的分子标记对应于选自由gata3、rora、il4、il5、il9、ll13、penk(脑啡肽原)、areg(双调蛋白)、il17rb、和il1ri1组成的组的一种或多种th2相关的转录物的表达。在另外的实施例中，ilc1的分子标记对应于选自由gata3、rora、il4、il5、il9、ll13、penk(脑啡肽原)、areg(双调蛋白)、il17rb和il1ri1组成的组的一种或多种th2相关的转录物的较低表达，以及选自由tbx21、ifng、il12rb2、il18r1、cxcr3、和ccr5组成的组的一种或多种转录物的较高水平，其中将所述水平与ilc2中所述转录物的水平相比。
通过本发明的方法治疗或预防的肺部炎症可能由香烟烟雾、细菌感染、病毒感染或其组合引起。在一个实施例中，通过所披露的方法治疗或预防的疾病或障碍是慢性阻塞性肺疾病(copd)。
附图说明
图1.流感感染触发肺部驻留ilc中gata-3的下调。(a)通过流式细胞术鉴定肺部驻留ilc为cd45+、活的、cd3-、cd49b-、谱系(lin)阴性、cd90+。谱系标志物：tcrαβ、tcrγδ、cd5、cd27、f4/80、gr1、cd19、b220、fcεri、cd11c和cd11b。(b)与同种型对照(灰色阴影)相比，ilc相关的标志物在lin-cd90+肺部ilc(无阴影)上的表达。(c)初试小鼠肺部中ilc1、ilc2和ilc3的绝对数量。ilc亚群分别基于t-bet、gata-3和rorγt的表达来定义。(d)来自在st2-gfp报告小鼠的肺部驻留ilc中表达的st2-gfp的代表性facs。(e)来自初试小鼠和感染甲型流感的小鼠的肺部驻留ilc中胞内gata-3的代表性facs和定量。(f)初试小鼠和感染小鼠的肺部驻留ilc中t1/st2和il-18rα表达的代表性facs和定量。(g)初试小鼠和被感染的小鼠的肺部驻留ilc中st2和il-18rα表达的相关性。(h)初试小鼠和被感染的小鼠的肺部驻留ilc中il-12rβ2表达的代表性facs图和平均荧光强度(mfi)。(i)在p.i.第7天，初试小鼠和被感染的小鼠的肺部驻留ilc中胞内t-bet表达的代表性facs图和定量。(j)在p.i.第7天，被感染的小鼠中il-18rα阴性或阳性ilc的胞内t-bet表达。(k)在初试小鼠和被感染的小鼠中表达il-18rα的ki67+细胞的百分比。(l)如所示刺激的、来自富集的ilc培养物的上清液中的il-5、il-13和ifn-γ的水平，数据表示为相对于来自模拟感染的小鼠的ilc的绝对细胞因子水平的改变。a-c和e-i中的数据代表5个独立的实验，d中的定量合并自3个独立的实验，j合并自两个独立的实验，并且l-k代表两个独立的实验。*p<.01、**p<.001、***p<.0001。除非另有说明，否则在第7天分析来自被感染的小鼠的数据。
图2.多种触发条件显著改变肺部驻留ilc动态。(a)感染甲型流感(a/fm/1/47)、甲型流感(pr8)或呼吸道合胞病毒(rsv)，(b)金黄色葡萄球菌，和(c)流感嗜血杆菌的wtbalb/c小鼠的肺部驻留ilc的gata-3mfi。(d-f)在感染后第5天，来自初试小鼠和感染流感嗜血杆菌的小鼠的肺部驻留ilc的il-18rα和t-bet表达的代表性facs和mfi定量。(g-h)来自初试室内空气对照和在指示的时间点暴露于香烟烟雾的小鼠的肺部驻留ilc中的gata-3表达的代表性facs和mfi。(i-k)来自初试室内空气对照或暴露于香烟烟雾八周的小鼠的肺部驻留ilc中的t-bet和il-18rα表达的代表性facs和mfi定量。(l-m)来自初试室内空气对照或暴露于香烟烟雾八周的小鼠的肺部驻留ilc中的il-12rβ2表达的代表性facs和mfi。a-f中的数据代表2-3个独立的实验，每组具有n≥5只小鼠。i-m中的数据代表3-4个独立的实验，每组具有至少5只小鼠。*p<.01、**p<.001、***p<.0001。
图3.(a)显示用指示的细胞因子培养96h的小鼠肺部ilc的ifn-γ表达的代表性流式细胞术图。(b)在ilc培养物中的ifn-γ水平。显示在来自鼻内给药pbs、il-33、il-12+il-18或il-12+il-18+il-33的scid小鼠的ilc上的gata-3(c)、或t-bet和il-18rα(d)的表达的代表性流式细胞术图。(e)如所示处理的小鼠中肺部驻留ilc2(圆形)或ilc1(方形)细胞的数量。来自特定治疗组并如所示刺激24小时的小鼠肺部富集的ilc上清液中的il-5(f)和ifn-γ(g)水平。(h)显示来自用il-12+il-18+il-33处理的小鼠的肺部富集的ilc上的细胞因子表达的代表性流式细胞术图。(i)来自初试同窝出生仔畜对照或st2-gfp报告小鼠或用il-12+il-18+il-33处理的报告小鼠的肺部驻留ilc上的st2-gfp对比il-18rα表达的代表性流式细胞术图。(j)如所示处理的报告小鼠中ilc2或ilc1细胞上st2-gfp表达的mfi。(k)自初试肺部(ilc2和nk细胞)、用il-12+il-18+il-33(活性ilc2细胞(st2+)和活性ilc1细胞(il-18rα+))处理的肺部、或初试肝脏(ilc1细胞)分选细胞，并将所选基因的qpcr分析可视化为热图。将数据表达为3(f-g)或4(a-d)个重复；或具有5只小鼠/组或9只小鼠/组(仅pbs组)的2个独立的实验(e)；或合并自具有3个(初试)或4个(经细胞因子处理的)小鼠/组的2个独立的实验(i-j)的平均值或平均值±s.e.m。*p<.01、**p<.001。
图4.过继转移的ilc2在感染流感后上调ilc1标志物。(a)转移的gfp+ilc经由流式细胞术可鉴定为表达cd25、cd90和st2的lin-gfp+细胞。(b)从il-33鼻内处理的全gfp报告小鼠的肺部中分选st2+il-18rα-ilc2。将100,000个分选的ilc2、3000万个脾细胞和三百万-四百万个c57bl/6gfp阴性肺源性t/nk细胞静脉内转移到受体rag/scid缺陷型小鼠中，将这些小鼠在12小时后感染流感。在感染后第7天，过继转移的gfp+ilc的gata3(c)、il-18rα(d)和il-12rβ2(e)的流式细胞术。在感染后第7天对过继转移的gfp+ilc进行gata-3(f)、il-18rα(g)和il-12rβ2(h)的mfi。b-h中的数据代表3个独立的实验，其中每组至少4只小鼠。
图5.在与病毒复制和th1细胞因子产生相关的区域中的ilc2簇。(a)个体gfp+细胞及其gata-3和核含量的平均表达(测量为自动分段gfp+细胞掩蔽中的dna探针dapi(深灰色)的平均强度(roi；参见方法))的散点图。(b)显示对照和被感染的小鼠中合并的gfp+细胞(y轴)的频率与针对核dapi含量调整的gata-3值的直方图(histogram)。(c)在感染后第6天，个体小鼠中的ilcgata-3表达的定量。a-c中的数据代表每种条件下总计数700-1700个细胞。
图6.ilc1细胞以t-bet依赖性的方式增加抗病毒免疫。在用流感pr8攻击后第7天，c57bl/6和tbx21-/-小鼠的肺部驻留ilc中(a-b)gata-3、(c-d)il-12rβ2、和(e-f)st2和il-18rα表达的定量和代表性流式细胞术图。(g)显示在感染后第7天富集的初试和被感染的c57bl/6和tbx21-/-小鼠的ilc中的ifn-γ表达的代表性流式细胞术图。将来自分别用il-33或il-33+il-12+il-18处理的小鼠的ilc2和ilc1细胞进行纯化，并且(h)转移到rag/γc缺陷型小鼠中。在用纯化自细胞因子处理的小鼠的ilc2或ilc1细胞所重建的rag/γc缺陷型小鼠中，在感染后第2天(j)测量的病毒诱导的体重减轻和(i)bal细胞因子表达(参见方法)。(k)在感染后第2天测量的用纯化自c57bl/6或tbx21-/-小鼠的ilc1细胞所重建的rag/γc缺陷型小鼠的bal液中细胞因子的表达。a-g中的数据代表具有5个(c57bl/6)、6个(被感染的tbx21-/-)或7个(初试tbx21-/-)小鼠/组的两个独立的实验。i-j中的数据代表用4个(ilc2重建的，ilc1重建的对照)或5个(ilc1重建的感染的)小鼠/组的两个独立的实验。k中的数据来自一个具有7只小鼠/组的实验。*p<.01、**p<.001。
图7.il-12阻遏gata-3并诱导人类ilc2中的t-bet和ifn-γ。将ilc2(定义为cd45+活的cd3-cd19-lin-il-7rα+cd161+crth2+)从正常人类供体的外周血液中分选，并用il-33、il-12或il-33+il-12培养5天。所有培养物均含有il-2。在指示的条件下培养5天后，ilc2上的(a)gata-3、(b)t-bet和(c)cd25表达。通过elisa在培养物上清液中测量(d)il-13、(e)il-4和(f)ifn-γ的水平。数据代表4个独立的实验，并且每个实验从3-4个健康供体合并细胞。
图8.copd患者增加与疾病严重程度相关的循环ilc1的百分比。(a)在非吸烟对照和copd患者的外周血液中的ilc上的代表性t-bet和crth2表达。(b)在健康对照、吸烟对照和总copd患者中的循环ilc1的百分比；ilc1被定义为t-bet+。(c)在健康对照、吸烟对照和总copd患者中的循环ilc2的百分比；ilc2被定义为crth2+。(d)按gold状态分层，健康对照、吸烟对照和copd患者中的循环ilc1和(e)ilc2的百分比。(f)ilc1的百分比与预测的fev1％之间的相关性。(g)按恶化频率分层，健康对照、吸烟对照和copd患者中循环ilc1和(h)ilc2的百分比。(i)在健康对照、吸烟对照和总copd患者中循环ilc2和ilc1的百分比之间的相关性。图中的缩写：ns＝非吸烟者；sm＝吸烟者。*p<.05、**p<.01、***p<.001。
具体实施方式
本发明证明了流感相关的炎症在肺部ilc群中引起显著的表型改变，其特征在于gata-3的丧失和th2相关的标志物的表达的降低，这与il-18rα+t-bet+ilc1的显著的扩增强烈相关。此外，还提供了新的证据，该证据利用st2-gfp报告小鼠和gfp+ilc2的过继转移，证明应答于il-12和il-18刺激而发生的ilc1扩增是由驻留肺部ilc2直接转化的结果。进一步显示，多种触发条件(尤其是与copd恶化相关的那些)在局部ilc2(包括许多病毒和细菌感染以及香烟烟雾暴露)中引发这种可塑性。值得注意地，触发ilc2的功能转化的损害程度表明，这种应答是肺部炎症和/或损伤的一般特征。
此外，本发明提供了ilc2可塑性涉及事件的多步骤顺序：ilc2迁移到组织内的发炎区域、经由gata-3的显著丧失沉默、随后暴露于微环境诱因，这些诱因决定了这些细胞的表型转换和功能局部应答。使用具有gfp+ilc2的过继转移系统，本发明提供了在感染后，“沉默的”ilc(即gata-3低)在与局部的il-12和il-18产生相关的炎症区域内汇聚，并转换为ilc1表型。il-12+il-18+il-33刺激后的分子分析与ilc2可塑性的这个概念一致，因为出现的ilc1(即前ilc2(ex-ilc2))与活化的ilc2共享部分重叠但不同的基因标记。其特征在于th2转录物的抑制和与促炎应答相关的th1样基因的显著的增加。重要的是，与静息的ilc2相比，il-12+il-18+il-33活化的ilc2展示出混合的th1/th2标记，包括转录因子gata-3和t-bet的共表达，表明肺部ilc2可塑性发生于对局部的微环境改变的应答。
有趣的是，针对il-12和il-18的受体的上调在细菌感染以及香烟烟雾暴露期间在ilc上发生，表明这些细胞因子在多种环境下与ilc1转化相关。此外，已经显示这些th1样炎症细胞因子在宿主对细菌感染和烟雾诱导的炎症的应答中是必不可少的。因此，ilc2转换表型的能力似乎需要多种信号，并且涉及与肺疾病(例如copd)相关的触发条件。
肺部驻留ilc群对传染性和有害试剂的应答惊人相似，这支持了这些表型改变潜在的共同机制。il-12最近以人类ilc3可塑性的关键调节子出现，并且数据指示该细胞因子在直接诱导小鼠和人类ilc2的可塑性中的作用。实际上，il-12是在本文使用的病毒和细菌感染期间产生的，并且鼻内给予il-12和il-18导致非常相似的表型，即gata-3的丧失和ilc1的特异性出现。另外地，在病毒攻击期间局部给予外源il-12增强了gata-3的丧失并增加了随后的ilc1扩增。在il-18rα之前il-12rβ2在ilc2上的早期表达和共表达st2和il-12rβ2的ilc2的存在与il-12可以促成这些细胞中的初始沉默和表型转换这一观察结果一致。由il-12诱导的关键下游效应物之一是ifn-γ并且最近的报道表明该细胞因子可以直接抑制ilc2应答。(molofsky,a.等人interleukin-33andinterferon-γcounter-regulategroup2innatelymphoidcellactivationduringimmuneperturbation.immunity[免疫干扰期间白细胞介素-33和干扰素-γ反调节第2组先天淋巴样细胞活化]43,161-174(2015))。因此，il-12-ifn-γ轴似乎是调节ilc2沉默和表型转换为ilc1的关键因素。
大多数病毒(包括流感)的感染引起肺部疾病，其特征在于与病毒复制区域相关的组织学上不同的炎症位点。尽管ilc数量较少，但在本研究中进行的广泛的免疫组织化学图像分析揭示，感染后，ilc汇聚在组织的发炎区域内。本发明披露了在肺部中特异性可视化ilc的第一种情况，并且重要的是，数据揭示了这些细胞聚簇在紧邻表达il-12和il-18mrna的骨髓衍生细胞的流感密集区域内。除了这些细胞的高细胞因子输出外，这种ilc的积累暗示着在感染期间微环境细胞因子浓度会显著增强。实际上，过继转移的ilc1显著扩增了th1样炎症细胞因子产生(包括由病毒感染诱发的tnfα、il-1β、il-12p70和ifn-γ)以及与感染前接受ilc2的动物相比，病毒诱导的体重减轻。
显著地，还发现与组织未受影响的区域相比，与肺部感染区相关的ilc具有较低的gata-3的表达。总之，这些数据证明遇到炎症位点的ilc2被主动沉默并局部地定向转换表型并且产生替代介质从而放大病毒诱导的免疫。本发明的广泛ihc图像分析突出了局部改变检查的重要性，因为全群体水平分析，即总肺部消化物(digest)可能使组织驻留ilc表型的微环境改变模糊或被低估。
长期暴露于香烟烟雾会导致copd的发展，并且与这些患者的亚群的随后的恶化易感性有关。出人意料的是，关于肺部免疫系统如何对这种有害试剂作出应答的了解相对较少。本文提供的一项重要发现是，烟雾暴露还会触发驻留肺部ilc2转化为ilc1，并且由此潜在地增加慢性吸烟者对伤害的易感性并加重在慢性吸烟者中观察到的炎症反应。在机制上，这些数据还为从暴露于烟雾的小鼠的肺部中分离的ilc2上观察到的沉默效应提供了潜在的背景，其中离体刺激后il-5和il-13的产生显著减少。il-12似乎是传染性环境中ilc2可塑性的关键调节子，但这种细胞因子也被显示出是应答于香烟烟雾暴露而产生的。此外，增加il-12诱导的ilc2可塑性的两个因素il-18和il-33在实验的烟雾暴露期间和在copd患者中均显著地上调。因此，il-12诱导的呼吸道感染可以在与先前香烟烟雾暴露相关的il-33和il-18升高的背景下引发超炎症ilc1应答。
之前的研究显示，用il-12培养人类ilc3导致ilc1标志物的上调，而ilc1可以在il-23、il-1β和视黄酸的存在下分化成ilc3。本发明中的数据证明人类crth2+ilc2通过下调gata-3和上调t-bet和ifn-γ来应答il-12。这些细胞也丧失cd25，这与il-18rα+小鼠ilc1中cd25的较低表达一致。此外，之前的研究证实，在il-12和/或il-1β+il-12刺激后，人类ilc2可以转换为产生ilc1-ifn-γ的细胞。现在明显的是，所有人类ilc亚群都展示出功能可塑性，这引发了ilc在疾病状态中翻转表型有多频繁的问题。
在此，研究结果也扩展到人类copd，显示患者的循环ilc2和ilc1的比率有显著改变。具体而言，具有较高数量的循环ilc1的患者肺部功能较差、疾病更严重、并且似乎更易频繁恶化。因此，循环ilc亚型可能反映了该疾病中的局部ilc群。鉴于ilc1能够显著放大小鼠中感染诱导的炎症，copd患者中ilc1数量的增加可能是恶化的频率或严重程度的原因。copd患者中ilc1和ilc2之间的强相关性与发炎小鼠肺部中st2+和il-18rα+ilc之间的关系相呼应，这表明可塑性在这种疾病可能是主动过程。鉴于ilc的表型混杂的性质以及缺乏已知的针对耗竭的细胞特异性表面标志物，通过操纵细胞的可塑性(即通过将超炎症ilc1转化为组织保护性ilc2)来靶向这些细胞可以在治疗和管理copd恶化中提供新的治疗方法。
除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见，例如，ausubel等人编辑(2015)currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学现代方案](johnwileyandsons[约翰·威利父子出版公司])；greenfield编辑(2013)antibodies:alaboratorymanual[抗体：实验室手册](第2版，coldspringharborpress[冷泉港出版社])；green和sambrook编辑(2012),molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册](第4版，coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社])；krebs等人编辑(2012)lewin’sgenesxi[lewin的基因xi](第11版，jones&bartlettlearning[琼斯与巴特利特学习])；freshney(2010)cultureofanimalcells[动物细胞培养](第6版，wiley[威利])；weir和blackwell编辑，(1996)handbookofexperimentalimmunology[实验免疫学手册]，卷i-iv(第5版，wiley-blackwell[威利-布莱克威尔])；borrebaeck编辑(1995)antibodyengineering[抗体工程](第2版，oxforduniv.press[牛津大学出版社])；glover和hames编辑，(1995)dnacloning:apracticalapproach[dna克隆：实用方法]，卷i和ii(第2版，irlpress[irl出版社])；rees等人编辑(1993)proteinengineering:apracticalapproach[蛋白质工程：实用方法](第1版，irl出版社)；mayer和walker编辑(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology[细胞和分子生物学中的免疫化学方法](academicpress[学术出版社]，伦敦)；nisonoff(1984)introductiontomolecularimmunology[分子免疫学介绍](第2版，sinauerassociates,inc.[西诺尔出版社公司])：以及steward(1984)antibodies:theirstructureandfunction[抗体：它们的结构和功能](第1版，springernetherlands[斯普林格出版社])。
为了使本发明可以更容易理解，定义了某些术语。另外的定义在整个披露中阐述。除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，thedictionaryofcellandmolecularbiology[细胞与分子生物学词典](第5版，j.m.lackie编辑，2013)，theoxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology[生物化学和分子生物学牛津词典](第2版，r.cammack等人编辑，2008)，和theconcisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology[生物医学与分子生物学简明词典](第2版.p-s.juo，2002)可以为技术人员提供本文使用的一些术语的通用定义。
定义
如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(oneormore)”和“至少一个/至少一种(atleastone)”可以互换地使用。
此外，“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者一起的特定披露。因此，术语“和/或”如在词组例如“a和/或b”中使用时，旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、以及“b”(单独)。同样地，术语“和/或”如在词组如“a、b、和/或c”中使用时，旨在包括a、b、和c；a、b、或c；a或b；a或c；b或c；a和b；a和c；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(systèmeinternationaldeunites)(si)接受形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。本文提供的小标题不是本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面和实施例。因此，下面直接定义的术语通过以其全文参考说明书更完整地定义。
当用语言“包括”来描述实施例时，包括了关于“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施例。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们普遍公认的单字母代码来表示。
“il-12”是指白细胞介素12。il-12的活性形式是一种异二聚体；p35亚基由il-12a基因编码，并且p40亚基由il-12b基因编码。人类和其他哺乳动物il-12两者的亚基的全长氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的。il-12与i型细胞因子受体结合。il-12受体(il-12r)是由β1和β2亚基构成的跨膜蛋白。人类和其他哺乳动物il-12β1和il-12β2的全长氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的。
“il-18”是指白细胞介素18，也称作ifn-γ诱导因子。人类和其他哺乳动物il-18的全长氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的。il-18与il-18受体(il-18r)结合，il-18受体是由il-18受体辅助蛋白(il-18rap)和il-18受体1(il-18r1)蛋白构成的异聚复合物。人类和其他哺乳动物il-18rap和il-18r1的全长氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的。
“抑制剂”是抑制、阻断或阻遏另一分子的活性的分子。例如，通过干扰配体与其受体的结合、或通过干扰受体的结合诱导的活化，可以抑制配体的活性。抑制可以通过阻断配体本身、或通过阻断与其结合的受体来实现。此外，在跨膜受体的情况下，可溶性受体衍生物的引入可以抑制配体的活性。可溶性受体衍生物竞争与天然跨膜受体结合的配体，从而减少或消除由与天然受体结合的配体导致的细胞活化或信号传导。抑制可以是激动的或拮抗的。例如，抑制剂可以是小分子、结合分子(包括突变蛋白和抗体或其抗原结合片段)、抑制性rna或反义寡核苷酸。用于本发明的抑制剂优选地是“特异性的”，意指它们对一个靶标或一组结构相关的靶标发挥效应。
术语“抑制”、“阻断”、以及“阻遏”可以互换地使用，并且指生物活性的任何在统计学上显著的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的降低。因此，当应用术语“抑制”或“阻遏”来描述例如对信号转导途径的效应时，这些术语是指相对于未处理的(对照)细胞，抑制剂在统计学上显著降低信号或靶诱导的细胞发育、可塑性或信号转导的能力。在某些实施例中，抑制剂可以将靶应答的细胞中靶介导的细胞活化或信号转导抑制至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％，如通过流式细胞术、蛋白质印迹、elisa或其他本领域技术人员已知的其他测定法确定的。“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低该抗体结合的抗原的生物活性的抗体。在某些方面，阻断性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。令人希望的是，生物活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％。
“结合亲和力”总体上是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文使用的，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的通常方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持更长时间的结合。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(elisa)、或放射免疫测定(ria)、或动力学(例如，
术语“调节剂”是指引起代谢途径改变(例如，抑制、阻遏、刺激或增加活性)的分子或化合物。例如，“调节剂”可以是小分子、多肽、抗体、抗原结合片段、或突变蛋白。
“小分子”典型地是低分子量(即小于约一千道尔顿)的有机分子。例如，可以通过使用常规方法筛选小分子文库来鉴定小分子抑制剂。
“结合分子”是能够以足够的亲和力结合其靶标的分子，这样使得该结合分子可用作治疗剂或诊断试剂。与其靶标“特异性结合”的结合分子与不相关的蛋白结合的程度小于结合分子与其靶标结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(ria)、
“突变蛋白”是天然存在的蛋白的类似物，其中相对于天然氨基酸序列，一个或多个氨基酸残基被添加、缺失、或被不同的氨基酸残基替代。突变蛋白可以通过已知的合成方法(例如，如本文所述，通过定点诱变、或通过本领域已知的任何其他合适的技术)来制备。
术语“抗体”是指通过免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合靶标(例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用的，术语“抗体”涵盖多克隆抗体；单克隆抗体；多特异性抗体，例如由至少两种完整抗体产生的双特异性抗体；人源化抗体；人类抗体；嵌合抗体；包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白；和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展示出希望的生物活性即可。抗体可以是基于其分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的一致性的以下免疫球蛋白的五个主要类别中的任何一个：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。存在两类哺乳动物轻链，λ和κ轻链。抗体可以是裸露的或轭合至其他分子如毒素，放射性同位素等。
术语“抗原结合片段”是指包含抗体的互补决定可变区的完整抗体的一部分。全长抗体的片段可以是抗体的抗原结合片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、线性抗体、单链抗体(例如，scfv)、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”(mab)是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆”可以应用于完整和全长单克隆抗体连同抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)，单链(scfv)突变体，包含抗体部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，这些方式包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指衍生自非人类(例如鼠类)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成包含最小的非人类(例如鼠类)序列。典型地，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中来自互补决定区(cdr)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、或仓鼠)的cdr的残基替代，该来自非人物种的cdr的残基具有希望的特异性、亲和力、和能力(jones等人，1986，nature[自然]，321:522-525；riechmann等人，1988，nature[自然]，332:323-327；verhoeyen等人，1988，science[科学]，239:1534-1536)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的fv框架区(fw)残基被来自具有希望的特异性、亲和力、和能力的非人类物种的抗体中的相应的残基替代。
人源化抗体可以通过在fv构架区和/或替代的非人类残基内的另外的残基的取代来进一步修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地是两个或三个)可变结构域，该可变结构域含有对应于非人类免疫球蛋白的所有或基本上所有cdr区，而所有或基本上所有fr区是人类免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539和5,639,641中。
术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的定义包括包含至少一种人类重链和/或轻链多肽的完整或全长抗体，例如包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于衍生自具有希望的特异性、亲和力、和能力的一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区与衍生自另一种(通常是人类)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引发免疫应答。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中可以互换地使用。典型的抗体包括通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。每个重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区(cl)构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因子(包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。
vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其间插入更保守的称为框架区(fw)的区域。每条链中的cdr通过fw区紧密靠近在一起，并且与来自另一条链的cdr一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。每个vh和vl由三个cdr和四个fw构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fw1、cdr1、fw2、cdr2、fw3、cdr3、fw4。
存在至少两种用于确定cdr的技术：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫兴趣蛋白质序列]，第5版publichealthservice[公共卫生服务]，nationalinstitutesofhealth[国立卫生研究院]，贝塞斯达，马里兰州.(1991))；和(2)一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(al-lazikani等人，j.molec.biol.[分子生物学杂志]273:927-948(1997))。此外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定cdr。
如在kabat中的氨基酸位置编号是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的fw或cdr的截短或插入。可以通过在抗体序列与“标准”kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的kabat编号。
“抑制性rna”是通过rna干扰来抑制基因表达的rna。抑制性rna的实例包括微小rna(mirna)和小干扰rna(sirna)。“反义寡核苷酸”是与mrna结合并阻止其翻译的核酸链。反义寡核苷酸可以由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其组合构成。用于设计和产生抑制性rna和反义寡核苷酸的方法是本领域已知的。
“分离的”多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞呈天然存在的形式。分离的多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞包括已被纯化至它们不再呈自然中发现形式的程度的那些。在一些实施例中，分离的多肽、抗体、结合分子、多核苷酸、载体或细胞是基本上纯的。当在本文中使用时，术语“基本上纯的”是指大于75％、优选地大于80％或90％、并且最优选大于95％的纯度。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望进行诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农畜、体育动物和动物园动物，包括例如人类、非人类灵长类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许活性成分的生物活性有效的形式并且不含有对该组合物将要给予的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。这种组合物可以是无菌的，并且可以包含药学上可接受的载体，例如生理盐水。合适的药物组合物可以包含一种或多种缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨酯)、稳定剂(例如人类白蛋白)、防腐剂(例如苯甲醇)、用于增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂。
如本文所披露的结合分子的“有效量”是足以进行具体阐述目的(例如治疗或预防效应)的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。
术语例如“治疗(treating或treatment或totreat)”或“减轻(alleviating或toalleviate)”是指治愈、减慢已诊断的病理病症或障碍、减轻已诊断的病理病症或障碍的症状、和/或停止已诊断的病理病症或障碍的进展的治疗性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有该障碍的那些。在某些实施例中，如果患者显示例如全部、部分或瞬时减轻或消除与疾病或障碍相关的症状，则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者的与肺部炎症相关的疾病或障碍。
“预防(prevent或prevention)”是指预防和/或减缓靶标病理病症或障碍发展的预防性或防御性措施。因此，需要预防的那些包括容易患有或易患障碍的那些。在某些实施例中，如果相比于未经受本发明方法的患者，患者瞬时或永久地表现出，例如，与疾病或障碍相关的更少或更少的严重症状，或与该疾病或障碍相关的症状的更迟的发作，则根据本文提供的方法成功地预防了与肺部炎症相关的疾病或障碍。
可在本文中互换使用的术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；这些修饰是例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。在某些实施例中，这些多肽可以作为单链或相关的链出现。
如本文所用的“多核苷酸”可包括一种或多种“核酸”、“核酸分子”、或“核酸序列”，并且是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。这些多核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可以通过dna或rna聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和它们的类似物。前述说明适用于本文提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。
结合分子的制备
单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，如由kohler和milstein，nature[自然]256:495(1975)所描述的那些。使用杂交瘤方法、小鼠、仓鼠、或其他合适的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生将特异性地结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞并使用例如聚乙二醇(peg)与合适的骨髓瘤细胞系融合，以形成可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤(如通过免疫沉淀法、免疫印迹法或通过体外结合测定(例如ria或elisa)所确定的)可在体外培养物中使用标准方法(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice[单克隆抗体：原理和实践],academicpress[学术出版社]，1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤繁殖。然后可以将单克隆抗体从培养基或腹水液进行纯化。
可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人类抗体。可以产生在体外免疫或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人类b淋巴细胞(参见例如，cole等人，monoclonalantibodiesandcancertherapy[单克隆抗体和癌症疗法]，alanr.liss，第77页(1985)；boemer等人，j.immunol.[免疫学杂志]，147(1):86-95(1991)；以及美国专利号5,750,373)。
抑制剂可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达如在例如vaughan等人(nat.biotechnol.[自然生物技术]，14:309-314(1996))、sheets等人(proc.nat’l.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]95:6157-6162(1998))、hoogenboom等人(j.mol.biol.[分子生物学杂志]227:381(1991))、以及marks等人(j.mol.biol.[分子生物学杂志]222:581(1991))中所述的人类抗体。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；和7,264,963；以及描述于rothe等人，j.mol.biol.[分子生物学杂志]375:1182-1200(2007)中。
亲和力成熟策略和链改组策略是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人类抗体或其抗原结合片段。(参见marks等人，bio/technology[生物/技术]10:779-783(1992))。
在一些实施例中，抗体可以是人源化抗体或其抗原结合片段。用于工程化、人源化、或表面重修非人类或人类抗体的方法也可以使用并且是在本领域中熟知的。人源化、表面重修或相似的工程化的抗体可以具有来自非人类来源(例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类或其他哺乳动物)的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基被通常称为“输入”残基的残基替代，这些残基典型地取自已知人类序列的“输入”可变结构域、恒定结构域、或其他结构域。此类输入序列可用于降低免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他合适的特征。一般来说，cdr残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。因此，保持部分或全部非人类或人类cdr序列，同时可变区和恒定区的非人类序列可以被人类或其他氨基酸替代。
抗体还可以任选地进行人源化、表面重修、工程化、或人类抗体工程化，保留针对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这个目标，人源化(或人类)或工程化抗体和表面重修抗体可以任选地使用亲本、工程化、和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化和工程化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些展示的检查允许分析残基在候选结合分子序列的功能中的可能作用，即分析影响候选结合分子结合其靶标的能力的残基。按照此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并且组合fw残基，这样使得所希望的结合分子特征，例如增加对靶标的亲和力得以实现。
抗体或其抗原结合片段的人源化、表面重修、或工程化可以使用任何已知方法进行，例如但不限于描述在以下文献中的那些：jones等人，nature[自然]321:522(1986)；riechmann等人，nature[自然]332:323(1988)；verhoeyen等人，science[科学]239:1534(1988)，sims等人，j.immunol.[免疫学杂志]151:2296(1993)；chothia和lesk,j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901(1987),carter等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]89:4285(1992)；presta等人，j.immunol.[免疫学杂志]151:2623(1993)，美国专利号5,639,641、5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567、7,557,189；7,538,195；和7,342,110；国际申请号pct/us98/16280；pct/us96/18978；pct/us91/09630；pct/us91/05939；pct/us94/01234；pct/gb89/01334；pct/gb91/01134；pct/gb92/01755；国际专利申请公开号wo90/14443；wo90/14424；wo90/14430；和欧洲专利公开号ep229246。
人源化抗体及其抗原结合片段也可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在时产生全套的人类抗体。这种方法描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016。
在某些实施例中使用抗体片段。已知各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段是经由完整抗体的蛋白分解消化而衍生的。参见，例如，morimoto等人，j.biochem.biophys.meth.[生物化学和生物物理方法杂志]24:107-117(1993)；brennan等人，science[科学]，229:81-83(1985)。在某些实施例中，抗体片段是重组产生的。所有fab、fv和scfv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并且从其分泌，从而允许这些片段的大量产生。此类抗体片段也可以从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离。抗体片段也可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的从业人员将是清楚的。
根据本发明，可对技术进行改编以生产对给定靶标具有特异性的单链抗体(参见，例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建fab表达文库(参见，例如，huse等人，science[科学]246:1275-1281(1989))，以允许快速有效地鉴定针对靶标具有希望的特异性的单克隆fab片段。抗体片段也可以通过本领域技术产生，包括但不限于：(a)由抗体分子的胃蛋白酶消化产生的f(ab')2片段；(b)通过还原f(ab')2片段的二硫键产生的fab片段，(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的fab片段，和(d)fv片段。
治疗方法
提供了用于治疗或预防与肺部炎症相关的疾病或障碍(例如copd)或由香烟烟雾、细菌感染、病毒感染或其组合引起的肺部炎症的方法。与肺部炎症相关的疾病或障碍包括哮喘、囊性纤维化、支气管扩张和炎性肠病(ibd)相关的疾病。
如本文所述，本发明证明在copd患者的肺部ilc群或具有与肺部炎症相关的障碍的患者中可以发生显著的表型改变。本发明进一步证明了copd患者或患有肺部炎症病症的患者的肺部ilc群的特征在于gata-3的丧失和th2相关的标志物的表达的减少，这与il-18rα+t-bet+ilc1的显著的扩增强烈相关。此外，本发明还提供了ilc1扩增可以由从驻留肺部ilc2的直接转化引起，其应答于il-12和il-18刺激而发生。已进一步显示，多种触发条件(尤其是与copd恶化相关的那些)在局部的ilc2(包括许多病毒和细菌感染以及香烟烟雾暴露)中引发这种可塑性。
鉴于这些观察结果，本文提供了用于抑制先天淋巴样细胞(亚群2)(ilc2)转化为先天淋巴样细胞(亚群1)(ilc1s)的方法，其中ilc2与调节剂接触，该调节剂预防ilc2转换为t-bet+ifnγ+ilc1，保持或阻遏ilc1中il-12受体和/或il-18受体表达的水平，和/或保持或增加ilc2中st2、crth2和/或gata3表达的水平。抑制ilc2群转化为ilc1可以促进预防、治疗，包括治疗以限制copd相关的症状的恶化或潜在的肺部炎症病症。此外，ilc2对ilc1的这种抑制可能限制copd的进展或限制其他肺部炎症病症的进展。
为了为患者提供更具靶向性的或增强的治疗选择或治疗方案，还提供了另外的方法，其中对于已被确定具有升高的ilc1水平或升高的ilc1/ilc2比率的受试者或患者进行预防、治疗(包括治疗以限制症状恶化)，其中通过在给予调节剂或疾病调节药物之前鉴定ilc2的分子标记与ilc1的分子标记之间的转换来进行这种确定。
本发明还提供了本发明的ilc2的分子标记对应于选自由gata3、rora、il4、il5、il9、ll13、penk(脑啡肽原)、areg(双调蛋白)、il17rb、和il1ri1组成的组的一种或多种th2相关的转录物的表达。本发明的ilc1的分子标记对应于根据权利要求26所述的一种或多种th2相关的转录物的较低表达和一种或多种选自下组的转录物的较高水平，该组由以下组成：tbx21、ifng、il12rb2、il18r1、cxcr3、和ccr5，其中将所述水平与ilc2中所述转录物的水平进行比较。
在一个实施例中，本文所述的方法包括向受试者给予调节剂或疾病调节药物。给予调节剂或疾病调节药物的临床响应可以使用筛选技术评估，例如磁共振成像(mri)、x-射线照相成像、计算机断层成像(ct)扫描、流式细胞术或荧光激活细胞分选仪(facs)分析、组织学、宏观病理学、和血液化学，包括但不限于可通过elisa、elispot、ria、层析等检测的改变。此外，经历调节剂或疾病调节药物疗法的受试者可以经历与疾病或障碍相关的症状的改善。
制备调节剂或疾病调节药物并将其给予至有需要的受试者的方法是本领域技术人员熟知或是容易由本领域技术人员来确定的。给予途径可以是例如口服、胃肠外、吸入或局部给药。如本文所用的术语“胃肠外”包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠和阴道给予。口服剂型包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液和溶液。采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规的增溶剂或分散剂鼻气雾剂或吸入剂型可以例如作为盐水溶液来制备。
通常，合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，任选表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选稳定剂(例如人类白蛋白)等。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可以通过有待组合的活性成分的量、给予途径及其他熟知的变量来决定。在一个实施例中，直接给予至气道，例如通过吸入或鼻内给予。
如本文所讨论的，调节剂或疾病调节药物能以用于体内治疗与肺部炎症相关的疾病或障碍的治疗有效量给予。在这点上，应当理解，可以配制一种或多种抑制剂以促进给予并且促进活性剂的稳定性。
根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的载体，例如生理盐水、无毒性的缓冲液、防腐剂等。用于本文披露的治疗方法的合适配制品描述于remington’spharmaceuticalsciences[雷明顿氏药物科学]，第20版，mackpublishingco.[麦克出版公司]，伊斯顿，宾夕法尼亚州(2000)。
组合物可以作为单剂量、多剂量或经既定时间段的输注给予。还可以调节剂量方案以提供最佳的希望的响应(例如治疗的或预防的响应)。可与载体材料组合以产生剂型的调节剂或疾病调节药物的量将根据许多不同因素而改变，这些因素包括给予方式、靶位点、患者的生理状态(即，疾病的严重程度，疾病的病史，以及经历疗法的个体的年龄、身高、体重、健康、和身体状况)、治疗是预防性还是治疗性的、给予的其他药物改变，以及患者是人类还是动物。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。本领域普通技术人员无需过多的此披露给出的实验即可以容易确定待给予的调节剂或疾病调节药物的量。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。
本披露还提供了调节剂或疾病调节药物用于治疗或预防与肺部炎症相关的疾病或障碍(例如copd)，或由香烟烟雾、细菌感染、病毒感染或其组合引起的肺部炎症的用途。
本披露还提供了调节剂或疾病调节药物在制造用于治疗或预防与肺部炎症相关的疾病或障碍(例如copd)或由香烟烟雾、细菌感染、病毒感染或其组合引起的肺部炎症的药物中的用途。
“疾病调节药物”可以是支气管扩张剂(包括短效或长效支气管扩张剂)、吸入类固醇、组合吸入剂、口服类固醇、磷酸二酯酶-4抑制剂或茶碱。
本披露中引用的所有参考都通过引用以其整体并入本文。此外，任何针对本文引用或提及的任何产品的制造商说明书或目录均通过引用并入。通过引用并入本文中的文件或其中的任何教导可以用于本发明的实践中。通过引用并入本文的文件不被认为是现有技术。
实例
本披露的实施例可以是通过参考以下非限制性实例来进一步限定，这些非限制性实例具体说明了本披露的某些抗体的制备以及用于使用本披露的抗体的方法。本领域普通技术人员应当清楚的是可以实践对于材料和方法两者的许多修改而不偏离本披露的范围。
实例1.肺部驻留ilc2在流感攻击后下调gata-3
ilc2是主要的肺部ilc群，并且特征在于其gata-3的表达。之前已经显示，香烟烟雾通过阻遏这些细胞中il-5和il-13的产生而使肺部驻留ilc2应答沉默。本发明提供了这种改变的相关性，以及与copd相关的其他致病的刺激是否同样具有相关性。
肺部ilc2被定义为非t/nk细胞群，其对谱系标志物的表达呈阴性，且对cd90、il-7rα、cd44、icos、gata-3和st2呈阳性(高)(图1a，1b))。在香烟烟雾暴露后，st2在肺部驻留免疫细胞上的表达是动态调节的。因此，在不存在针对st2的特异性试剂并且需要更准确地理解其调节的情况下，研发了st2-gfp+报告小鼠。尽管在初试肺部存在表达t-bet或rorγt的lin-cd90+细胞小群(即ilc1和ilc3细胞)，但大多数ilc是st2higata-3hi，并且代表总ilc库的大约85％-90％。当评估st2报告小鼠中的ilc2时，证实了这一观察结果(图1c，1d)，其中ilc2可以容易地鉴定为表达cd90、il-7rα、cd44和cd25的lin-st2-gfp+细胞。
有趣的是，与来自未感染的小鼠的ilc2相比，感染甲型流感导致gata-3快速且显著的丧失(≥50％)。这种丧失在早至感染后(p.i.)48小时就观察到，并且在p.i.第6天仍然明显。(图1e)。此外，gata-3的丧失与感染后这些细胞中ilc2相关标志物st2的表达的显著降低相关(图1f)。这些标记物的丧失与ilc2脱出或细胞死亡无关，因为没有检测到血液中显著的ilc、引流淋巴结(dln)或支气管肺泡灌洗(bal)；并且，如通过pi和膜联蛋白(annexin)v染色确定的，肺部的ilc似乎不是凋亡的。
由于病毒感染与促炎细胞因子(包括il-12和il-18)的产生相关，因此检查了ilc中这些th1相关介质的受体表达。引人注目地，ilc2上st2的丧失与il-18rα+ilc群的平行增加强烈相关(图1f，1g；r＝-0.859)。尽管il-12rβ2表达似乎与st2的丧失不相关，还观察到感染后il-18rα+ilc群上的il-12rβ2显著增加(图1h)，这表明il-12rβ2可能比il-18rα更早出现在这些细胞上。
t-bet是il-12下游的转录因子，il-12是ilc1的标志物并且与th1应答的促进紧密有关。因此检查了针对t-bet表达的肺部驻留ilc，并且发现这些细胞中gata-3的丧失伴随着在p.i.第7天表达t-bet的ilc百分比的增加而发生(图1i)。实际上，病毒诱导的t-bet+ilc全部包含在肺部的il-18rα+亚群内(图1j)。虽然il-18rα+t-bet+ilc保持cd3-、cd49b-、lin-、cd90+和cd44+，但与st2+ilc相比，它们表达中间水平的cd25、il-7rα、icos和c-kit。
有趣的是，病毒感染后ilc群的改变似乎对ilc1样应答具有特异性，因为在这些相同时间点未检测到肺部中显著的rorγt+ilc3。此外，在感染期间肺部中大部分增殖的ki67+ilc表达il-18rα+(图1k)，这表明il-18rα在这些细胞的维持或功能中起作用。
为了检查转录因子表达中这些改变的结果，将总肺部驻留ilc从感染流感的小鼠中分离出并进行离体刺激以评估细胞因子的表达模式。发现在p.i.第7天时来自被感染的小鼠的肺部ilc比来自模拟(pbs处理的)动物的ilc产生显著更少的il-5和il-13(图1l)。然而，与针对il-12和il-18的受体的上调一致，从被感染的动物的肺部中分离的ilc现在应答于il-12和il-18离体刺激而产生显著水平的ifn-γ(图1l)。
总的来说，这些数据证明了在病毒攻击期间驻留肺部ilc的表型和功能能力发生了主要改变，其特征在于局部的ilc2功能降低和il-18rα+t-bet+ifnγ+ilc1的扩增。
实例2.香烟烟雾暴露和细菌感染诱导肺部ilc的表型改变
由于copd的恶化与许多病毒和细菌呼吸道感染相关，因此调查在受不同copd相关病原体攻击的小鼠中ilc亚组的转换是否发生。引人注目地，发现了一种非常相似的模式。与甲型流感(pr8)、呼吸道合胞体病毒(rsv)(图2a)、或革兰氏阳性和阴性细菌、金黄色葡萄球菌(图2b)和非分型流感嗜血杆菌(nthi)(图2c-2f)的不同株系孵育均诱导了肺部ilc群内的gata-3的丧失，以及il-12rβ2、il-18rα、和t-bet表达的随后的增加。
ilc亚组的这种移位不仅限于传染性触发条件，因为copd的主要致病原因之一的香烟烟雾暴露诱导gata-3的显著丧失(即吸入烟雾4天和10天后)。整个连续6个月的烟雾暴露，gata-3水平保持显著降低(图2g-2h；数据显示长达8周)。值得注意地，il-12rβ2+、il-18rα+、t-bet+ilc1群的出现还在暴露于烟雾8周后观察到(图2i-2m)并且在进一步治疗6个月后仍然保持。最后，在copd恶化模型中，香烟烟雾暴露与病毒感染组合，发现肺部驻留ilc的改变显著增加。与单独的烟雾或病毒相比，之前暴露于香烟烟雾的小鼠在肺部驻留ilc中对gata-3和st2具有更大的阻遏和具有较高水平的il-18rα。
总之，这些数据证明了局部的ilc群中的表型转换可以是应答于外来的和/或环境损害的一般机制。
实例3.il-12和il-18诱导ifn-γ从局部的st2+ilc2库产生ilc1
为了检查ilc2是否可以过继ilc1表型，将来自肺部的il-33扩增的ilc2富集至>98％纯度并与各种细胞因子一起培养4-7天。用il-12或il-15刺激这些细胞不会诱导ilc2产生ifn-γ。然而，(分别地)约20％-50％的这些细胞应答于il-18，尤其是il-12和il-18的组合而产生ifn-γ。这也反映在培养上清液中存在的水平(图3a，3b)。这些数据与证明了il-12和il-18可以诱导ilc3产生ifn-γ的研究一致。
尽管之前报道il-15通过ilc1促进ifn-γ的表达，但发现在这些条件下单独地il-15或其与il-12和/或il-18组合不显著影响ifn-γ的产生(图3b)。在该测定中，il-5的产生在不同条件下显著地一致，这支持了ilc2组成型地产生这种细胞因子的观点。虽然il-13的产生改变较大，但应答于nfκb活化细胞因子，尤其是il-33和il-18的水平始终较高。引人注目地，ilc2在用il-12和il-18刺激时共表达il-13和ifn-γ，这证明了这些细胞具有与ilc2的功能可塑性一致的细胞因子表达的混杂的模式。因此，肺部衍生的ilc2可以表达ilc1相关的标志物并应答于il-12+il-18产生丰富水平的ifn-γ。
为了确定il-12和il-18是否可以在体内诱导ilc1扩增，检查了鼻内单独给予il-12+il-18、il-33或给予所有这三种细胞因子的组合后的ilc应答。与pbs或il-33处理的对照相比，对初试小鼠局部的联合给予il-12p70和il-18显著降低了总肺部驻留ilc中gata-3和st2的表达(图3c)，并且与在病毒感染期间观察到的情况相似(图1)。此外，il-12+il-18治疗显著增加了il-18rα+、t-bet+ilc的表达和数量，这与pbs或il-33处理相比产生了显著更少的il-5和il-13，但产生了显著更高离体的ifn-γ量(图3d-3g)。
il-33的鼻内递送显著增加了肺部内st2+、gata-3+ilc2的数量，这产生了高水平的il-5(图3f)和il-13。有趣的是，尽管ilc1的比例显著增加，但应答于il-12+il-18(图3c，3d)，观察到这些细胞总数的最小但显著的增加(图3e)。然而，il-33与il-12+il-18的组合给予显著增加了ilc1的总数，但代价是ilc2扩增(图3e)。此外，il-33诱导产生th2细胞因子的能力在il-12和il-18的存在下被显著消除，并且这些细胞产生了显著量的ifn-γ(图3g)。这些细胞还共表达了il-5和ifn-γ(图3h)，与来自局部的ilc2库的il-18rα+t-bet+ifn-γ+ilc1的出现一致。值得注意地，单独给予il-12或il-18对gata-3、t-bet、il-18rα或ifn-γ的表达具有最小效应。因此，il-12和il-18共调节体内ilc1的扩增，而il-33以背景依赖性的方式作用来放大这种应答。
st2是ilc2中gata-3的直接靶标。为了确定细胞因子处理后ilc1是否从局部的ilc2库扩增，重复st2gfp+小鼠中的这些实验。st2-gfp+与il-18rα表达的比较揭示了初试肺部中有两个不同的ilc群，st2-gfp+il-18rα-ilc2s(93.4％)和st2-gfp-il-18rα+ilc1(4.01％)，这两个ilc群在il-12+il-18+il-33处理后显著改变，导致ilc1的频率增加，如通过他们的il-18rα的表达确定的(图3i)。引人注目地，这些il-18rα+细胞也是st2-gfp的中间体(图3i)，并且估计代表大约50％的原始的st2-gfp+ilc2群。gfp+平均荧光强度(mfi)的特别的分析揭示了在细胞因子处理后，ilc2上st2表达的中等的但显著地降低。与初试肺部的st2-gfp-il-18rα+ilc1相比，st2-gfp+在il-18rα+细胞上的表达较低，尽管该表达仍然显著地增加(图3j)。因此，ilc1出现于局部的st2+ilc2库，而不是来自肺部内预先存在的、真实的ilc1的结果。
从初试小鼠中分选的ilc2与从il-12+il-18+il-33(细胞因子)处理的小鼠中分选的ilc2(st2+il-18rα-)和ilc1(st2-il-18rα+)的基因表达谱的比较部分地揭示了重叠但不同的分子模式。从初试肺部分离的ilc2表达th2相关的转录物，包括gata3、rora、il4、il5、il9、ll13、penk(脑啡肽原)、areg(双调蛋白)、il17rb和il1ri1。相似地，来自细胞因子处理的小鼠的ilc2上调了许多这些相同的基因(图3k)。相反，来自细胞因子处理的动物的il-18rα+ilc1似乎具有改变的、独特的基因表达谱，其特征在于前述ilc2转录物的较低表达和tbx21、ifng、il12rb2、il18r1、cxcr3和ccr5的较高水平(图3k)。值得注意地，这些细胞在初试肝脏ilc1/肺部nk细胞之间相比细胞因子扩增的ilc2呈中间表型，因为他们的th1相关的转录物较高，但他们表达显著较低水平的与细胞溶解功能相关的基因(例如，prf1、gzma、gzmb、gzmc)(图3k)。有趣的是，还观察到细胞因子处理的小鼠的ilc亚群中关于趋化因子受体(例如ccr5、ccl17和cx3cr1)的差异，而与ilc2相比，活化的ilc1中il7ra、il2r和icos的表达较低(图3k)。
总的来说，这些数据突出了ilc2可塑性涉及分子标记内的转换，这与经由流式细胞术报道的蛋白组学改变一致。
实例4.ilc2在病毒攻击期间直接转化为ilc1并在炎症区域内聚簇
使用缺乏ilc、nk细胞、和成熟淋巴细胞的rag/γc双敲除小鼠直接测试ilc2是否可以转化为ilc1和/或是否具有在感染期间转化为ilc1的能力。将肺部驻留st2高、il-18rα-ilc2从il-33处理的gfp+转基因小鼠中进行facs分选，并在甲型流感感染前12h静脉内转移到rag/γc-/-小鼠中(图4a)。il-33扩增的gfp+ilc2表达高水平的gata-3和th2细胞因子，但不表达ilc1标志物(图4b-4f)。该方案用于确保所有ilc都可通过gfp表达容易地鉴定。
与野生型小鼠相比，对感染的应答在rag/γc-/-动物中延迟并对其是致死性的；因此，为了延长存活期，将这些小鼠在感染时用gfp-脾细胞和肺部衍生的nk和t细胞进行(腹膜内)重建。然后在p.i第7天和第10天分析转移的gfp+ilc的表型谱的改变，包括gata-3、il-12rβ2和il-18rα的表达。在过继转移时，gfp+ilc浸润受体小鼠的肺部，并且在初试和被感染的动物中通过流式细胞术容易地鉴定为表达cd25、cd90、和st2的lin-gfp+细胞(图4b)。
此外，应答于感染，这些gfp+ilc2在p.i.第7天时显著下调gata-3表达(图4c，4f)。此外，gata-3的这种丧失与这些gfp+细胞上il-18rα和il-12rβ2的显著上调相关(图4d、4e、4g、4h)。还观察到在p.i第10天的gfp+ilc2中的相似的表型改变，然而，在p.i第7天或第10天未检测到t-bet表达，这可能是由于这些小鼠中对感染的延迟应答。显著地，在用il-12+il-18进行离体刺激后，gfp+细胞在p.i.第10天时能够产生显著量的ifn-γ，且这种改变与il-13的下调一致。
引人注目地，来自这些相同小鼠的肺部组织的免疫组织化学(ihc)分析揭示了对肺部内感染的显著的块状样应答。转移的gfp+ilc似乎聚簇在与病毒诱导的炎症特征性相关的炎症病灶内。更高倍率放大率揭示了ilc典型地聚簇在病毒复制区域内，甚至在与非发炎区域紧密接壤的组织区域中也是如此。然而，还观察到实质组织的非发炎区域中的gfp+ilc，尽管这些数量少得多并且主要是孤立的。使用双ihc，证实了这些ilc簇与流感+上皮细胞的共定位，以及与发炎气道相邻的血管周的区域。重要的是，ihc和原位杂交的组合揭示了表达il-12和il-18mrna的骨髓衍生的细胞常常被鉴定为在肺部炎症区域内与gfp+ilc紧密靠近。
采用四重组织化学与组合免疫荧光和显色ihc(参见实例9)来检查和定量感染后肺部gata-3相关的ilc表达。使用数字化整个载玻片图像的计算机图像分析，在组织中自动鉴定所有个体的gfp+ilc(绿色荧光)，并对它们的蓝色dapi(每个横截面的总核含量的dna标志物)以及它们的红色/粉红色gata-3免疫染色的染色强度进行评分。
分析对照小鼠中的gata-3高ilc，并且将来自经流感治疗的动物的非感染区域分别与在p.i.第5天和第6天的感染的区域中的典型地gata-3低ilc进行比较。首先检查来自对照(pbs处理的)与被感染的小鼠的整个肺部截面中的ilc2相关的gata-3表达。个体gfp+细胞的散点图分析清楚地显示，与未感染的小鼠相比，病毒感染的肺部含有显著更多的表达gata-3低的ilc(图5a)。在进一步证实所有流感治疗的小鼠中的均匀感染后，并且由于2d横截面细胞区域的核表现不同，因此将每个gfp+细胞中的gata-3表达归一化为细胞的核dapi含量。同样，发现与对照相比，被感染的小鼠中gata-3高ilc的频率显著降低(图5b)。
有趣的是，观察到来自流感治疗小鼠的ilc中gata-3的时间依赖性丧失，因为相对于p.i.第5天，在p.i.第6天检查到小鼠的gfp+细胞中的gata-3强度进一步减少。(图5a，5b)。facs数据证实了gata3表达的这个时程。重要的是，通过比较每个个体小鼠肺部截面的平均gfp+gata-3表达来量化对照和被感染的小鼠之间的ilc相关的gata-3水平的统计学上显著降低(图5c；来自p.i.第5天的数据)。
最后，鉴于感染的不均匀性质，评估了对整个肺部组织中发炎的微环境具有特异性的gata-3表达的丧失。因此，使用来自四重(流感、gfp、gata-3和dapi)染色截面的空间数据(x、y坐标)，进行了比较具有较高与较低细胞和病毒密度的肺部组织区域中gata-3表达水平的聚焦分析。将肺部的块状细胞密集区域与来自相同截面的病毒密度热图以及其中将个体gfp细胞的空间分布进行绘制并根据其gata-3强度进行颜色编码的图像来进行比较。值得注意地，gata-3低ilc在肺部感染的区域内更为频繁。相反，在周围的、未感染的组织区域中发现的ilc主要是gata-3高。
总之，这些数据证明了ilc2在病毒攻击后直接转化为ilc1样表型，并迁移至与病毒复制相关的区域。这大概是对局部促炎诱因(例如il-12和il-18，其控制了它们随后的可塑性)的应答。
实例5.t-bet对于沉默ilc2是非必需的，但是对于ifn-γ的产生是必需的
为了确定在病毒攻击后t-bet在ilc1的维持和/或增殖中是否存在功能作用，检查了t-bet缺陷型小鼠中的ilc应答。有趣的是，与c57bl/6(wt)小鼠相比，t-bet不需要gata-3和st2的丧失或il-12rβ2和il-18rα在这些细胞上的表达的增益，t-bet对于ilc1的增殖也不是必需的(图6a-6f)。然而，在用il-12+il-18离体刺激后，从被t-bet-/-感染的动物分离的ilc显著损害其产生ifn-γ的能力(图6g)。此外，来自wt和t-bet-/-小鼠的ilc通过下调gata-3和st2以及上调il-12rβ2和il-18rα链而相似于鼻内给予il-12+il-18的应答。然而，如在病毒感染研究中那样，t-bet对于应答于il-12+il-18的ifn-γ的最大表达是必需的。因此，t-bet对于ilc2应答于th1型炎症而转化为ilc1是非必需的，但似乎对于这些细胞中ifn-γ的最佳产生是必不可少的。
实例6.ilc1是致病的且可显著放大病毒诱导的体重减轻和对感染的炎症应答。
接下来检查了ilc2可塑性及其在感染期间特异性表型转换为ilc1的生物相关性。然而，鉴于缺乏ilc特异性表面标志物，抗体介导的ilc群耗竭的策略有限。在缺乏适应性免疫细胞的动物中，针对thy抗原(cd90)的抗体已经被成功用于耗竭组织驻留ilc。虽然证实了用抗cd90抗体治疗耗竭>90％的肺部驻留ilc这一事实，但也发现该抗体全身地耗竭约70％的nk细胞，以及肺部驻留cd90+cd45-cd166+sca-1+间充质干细胞的群。
因此，为了更清楚地解决ilc1的生物学功能，在免疫受损的小鼠中进行ilc1或ilc2的过继转移(图6h)。将肺部驻留ilc2(st2+、gata-3+)和ilc1(il-18rα+、t-bet+)从用il-33或il-12+il-18+il-33处理的c57bl/6小鼠中分离并在甲型流感感染前24h转移到c57bl/6rag/γc缺陷型小鼠中。引人注目地，与感染前用ilc2重建的小鼠相比，接受过继的ilc1的动物展示出显著更多的感染引起的体重减轻(图6h)。此外，ilc1的转移与显著的、过度的促炎细胞因子产生相关，包括ifn-γ、il-12p70、tnfα、il-1α、和il-6(图6i)。
未观察到在该时间点ilc1转移后细胞炎症的差异，大概是由于rag/γc缺陷型小鼠中对感染的延迟应答。为了确定地测试t-bet/ifn-γ对于ilc1的炎症潜能是否是必需的，使用从c57bl/6(wt)和t-bet缺陷型小鼠分离的ilc1重复过继转移。如之前显示的(图6i)，ilc1转移与过度的th1细胞因子产生相关(图6j)；然而，t-bet缺陷型ilc1不能够促进这种增加的抗病毒应答，包括ifnγ产生(图6j)。引人注目地，这些细胞中不存在t-bet显著触发了肺部内th2细胞因子产生，即il-4和il-5。(图6k)。
因此，具有显著增加病毒诱导的炎症的能力的il-12和il-18扩增了ilc1群，而t-bet对于这些细胞的完整炎症潜能是必需的。
实例7.il-12诱导人类ilc2中的可塑性
为了测试人类ilc2是否可以证明可塑性并分化成ilc1，将lin-il-7rα+crth2+cd161+ilc2从健康供体的外周血液中进行分选，在il-2+il-33或il-2+il-12的存在下培养5天并检查表面标志物和细胞因子输出。如之前报道的，发现crth2是人类ilc2的标志物，并且在il-2+il-33中培养的ilc2是crth2+、gata3+、tbet-、cd25+、cd161+和il-7rα+(图7a-7c)。这些细胞产生高水平的il-13和il-4，但产生显著降低量的ifn-γ(图7d-7f)。值得注意地，新鲜分离的外周血液ilc2应答于il-33而产生很少il-5或不产生il-5，这与ohne等人的观察结果一致。相反，向培养基中添加il-12显著降低了ilc2中gata-3和cd25的水平，但伴随地引起这些相同细胞中t-bet表达显著增加(图7a-7c)，验证了在小鼠ilc表型中的观察结果。此外，即使在il-33的存在下，这些ilc2也应答于il-12而产生较低水平的il-13和il-4(图7d，7e)。此外，il-12在人类ilc2中诱导高水平的ifn-γ，并且这些水平在il-33的存在下增加(图7f)。
因此，人类ilc2可以在il-12刺激后获得ilc1表型，并且类似于小鼠ilc2，il-33可以通过这些细胞而放大ifn-γ的产生。
实例8.copd患者显著改变与疾病严重程度相关的ilc应答
患有copd的个体在感染病毒或细菌病原体后经历急性症状恶化，并且这些恶化与患者发病率和死亡率相关。研发并利用于本发明的copd的小鼠模型证明了在暴露于单独的病毒、细菌感染、或香烟烟雾后肺部驻留ilc群中显著的功能和表型改变，并且当暴露于烟雾与病毒感染的组合时这些效应会放大(图2)。为了研究在copd患者中是否发生相似的改变，检查来自copd基因(copdgene)组的稳定患者的外周血液中ilc亚群的频率。对健康对照的外周血液中循环ilc的分析揭示了约40％的循环ilc表达了ilc2标志物crth2，以及cd25、il7rα、和gata-3，并且约5％的循环ilc是ilc1(在此定义为t-bethi，图8a)，这与之前的报道一致。发现循环中的许多ilc不表达已知的ilc1、ilc2、或ilc3标志物，并且不清楚这些是否代表循环ilc前体或未成熟细胞。
观察到与健康对照相比，copd患者中ilc1的频率在循环中显著升高(图8a，8b)。ilc1的这种增加与循环ilc2细胞的频率的伴随的降低相关(图8c)。此外，与患有较轻度疾病(goldi/ii)的患者相比，患有较严重疾病(goldiii/iv)的患者具有显著更高的ilc1频率(图8d)。相反地，与较轻度患者(goldii)或健康吸烟者相比，较严重的患者(goldiii/iv)的ilc2比率显著降低(图8e)。尽管与健康吸烟者相比，所有copd患者(goldi-iv)的ilc1都有(明显的)较高的频率的趋势，但是与健康对照相比，匹配的(年龄和吸烟史)健康吸烟者也展示出ilc1比率的显著增加(图8b)。有趣的是，“健康吸烟者”组的若干个人表现出相对较低的fev1/fvc比率(0.73-0.71)；即，与较轻度copd患者(≤0.7)中发现的比例相似，这可能是这些受试者中的一些的ilc1增加的原因。然而，如通过预测的fev1％(r＝-0.4162，p<0.01)和fev1/fvc比率(r＝-0.4154，p<0.01)所评估的，％ilc1与肺部功能之间存在显著的负相关(图8f)。相反，copd患者的％ilc2与肺部功能参数呈正相关。
重要的是，％ilc1与平均恶化数量之间存在显著的线性趋势，因为≥2次恶化/年的患者具有最高的ilc1和最低的ilc2频率(图8g，8h)。与％ilc1对ilc2之间的互反关系以及与疾病相关的临床终点相一致，发现ilc1与ilc2的比率之间存在强相关性(r＝-0.5529，p<0.001)，从而支持了在copd中ilc2向ilc1直接转化的假设(图8i)。实际上，始终观察到ilc1和ilc2之间的负相关；然而，ilc1和ilc2的总和仍保持在相同水平(42.3％±13.1％；平均值±sd)，表明这可能归因于现有ilc群中的可塑性。
总的来说，这些数据证明了copd与循环ilc库的显著改变相关，并且ilc1的频率的增加与疾病严重程度、肺部功能和恶化频率相关。
实例9.材料与方法
小鼠
将balb/c(哈伦(harlan))、scid(jax)、c57bl/6(jax)、rag/scid缺陷型(泰康利(taconic))、gfp转基因(c57bl/6-tg(cag-egfp)131osb/leysopj，jax)小鼠饲养于米迪缪尼公司(medimmune)并根据iacuc批准的方案进行处理。根据机构指导和方案，将t-bet-/-(jax)小鼠进行饲养并保持在宾夕法尼亚大学(universityofpennsylvania)。
st2-gfp报告小鼠的产生
将靶向构建体注射到鼠类囊胚中。该构建体含有上游4kb短同源臂(随后是位于内含子10的frt侧翼的嘌呤霉素抗性盒)，然后是il1rl1基因的外显子11，其中终止密码子被删除，并且紧接着是融合至egfp的t2a自身切割肽的融合序列(随后是新的终止密码子)。该构建体以6kb长的同源臂结束。用于创建靶向构建体的所有序列均基于ensembl转录物ensmust00000097772(il1rl1-001)，其对应于il1rl1亚型a(膜结合；uniprotid：p14719-1)。在flp介导的重组后，删除嘌呤霉素选择基因，剩余单个frt位点保持在靶向性il1rl1基因的内含子10中，随后是外显子11-t2a-egfp融合序列。用于实验的所有st2-报告小鼠是balb/c背景的杂合st2+/gfp。同窝出生仔畜被用作对照。
烟雾模型
将香烟烟雾暴露的小鼠按照之前公开的方案每周5天每天两次用烟雾进行处理，并在图2中指定的时间点进行分析。
细菌和病毒攻击模型
将50xtcid50的甲型流感(a/fm/1/47)、50xtcid50pr8菌株(均为h1n1)、或106pfursva2鼻内给予至小鼠。在一些研究中，将甲型流感根据之前建立的方案在暴露于烟雾之后给予。在图中的指定的时间点分析小鼠。将小鼠用107cfu的非分型流感嗜血杆菌进行鼻内处理并在感染后第2天和第5天进行分析，或将小鼠用105cfu的金黄色葡萄球菌进行鼻内处理并在感染后第5天进行分析。
原位ilc扩增
为了扩增体外实验的ilc群，将balb/cscid小鼠在d1、d3和d5用1μg重组il-33(内部产生)、il-12(ebiosciences公司)、或il-18(r&d公司)进行鼻内处理，并在d7处死。如下所述富集ilc用于离体分析。为了扩增ilc2，使用il-33。为了ilc1扩增，使用il-12+il-18+il-33。
富鲁达(fluidigm)分析
从初试肺部分选ilc2(定义为cd45+活的cd3-cd49b-lin-cd90+st2+il-18rα-)。如上所述，从用il-12+il-18+il-33处理的小鼠的肺部分选ilc2(cd45+活的cd3-cd49b-lin-cd90+st2+il-18rα-)和ilc1(cd45+活的cd3-cd49b-lin-cd90+st2-il-18rα+)。对于对照，从初试肺部分选nk细胞(cd45+活的cd49b+cd3-)，并从初试肝脏(cd45+活的cd3-cd19-nkp46-cd11a+trail+)分选ilc1。从细胞中分离rna，并使用富鲁达生物标志物动态阵列(fluidigmbiomarkdynamicarray)进行qpcr，该阵列装载有针对感兴趣的转录物的探针(富鲁达公司(fluidigmcorp.)，南旧金山，加利福尼亚州)。
ilc富集(小鼠)
将肺部用pbs灌注，切成约2cm的片，并与liberasetm和dnase(均来自罗氏公司(roche))在37℃孵育45分钟，然后通过70μm细胞过滤器捣碎并用完全rpmi洗涤。用ack细胞裂解缓冲液(英杰公司(invitrogen))裂解剩余的血细胞，并将单细胞悬浮液与抗cd3、cd19、b220、cd5、tcrαβ、tcrγδ、cd11c、f4/80、gr1、ter119、cd49b和cd27的生物素化抗体一起孵育。然后将细胞与抗生物素微珠(milltenyi公司)一起孵育，并按照生产商的方案进行耗竭。对于每次ilc富集，耗竭重复两次并且典型地产生>95％纯的ilc群。
用于体外培养的ilc分离(人类)
血液收集自米迪缪尼公司(medimmune)献血者程序招募的健康志愿者。所有志愿者都给出了知情同意。根据生产商的方案使用cpt管(bd)分离pbmc。使用ack裂解缓冲液裂解剩余的红细胞。将来自3-4个健康供体的pbmc进行合并，并使用nk细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(stemcelltechnologies))进行耗竭。然后将ilc分选为99％纯度、为活的、cd45+、非t/非b、lin-、il-7rα+、cd161+、crth2+细胞。
ilc的离体刺激
如上所述，将ilc从鼠类肺部或人类血液中分离，并用il-2、il-7、il-33、il-12、il-18、il-15或其组合进行刺激，如图中所述。所有细胞因子均以50ng/ml使用。通过流式细胞术分析细胞，并通过msd或elisa(麦索斯盖尔诊断(mesoscalediagnostics))测定上清液的细胞因子产生。
copd样品
从招募进copd基因(copdgene)组的健康对照、吸烟对照和copd患者收集血液。患者人口统计资料在表1和表2中给出。所有工作均由国立犹太医学中心(nationaljewishhealth)的irb批准。
表1
*受试者可能在某些人口统计学变量中缺少信息。
表2
*受试者可能在某些人口统计学变量中缺少信息。
流式细胞术
用抗cd3、cd49b、il-18rα(ebiosciences公司)、cd45、cd25、cd90、cd44(生物传奇公司(biolegend))、和st2(mdbiosciences公司)的抗体染色小鼠ilc。谱系混合物包括抗tcrαβ、tcrγδ、cd5、cd27、f4/80、cd11c、gr1、cd19、fcεri、和b220(ebiosciences公司)的抗体。胞内抗体包括gata-3、t-bet、il-13、il-5和ifn-γ(ebiosciences公司)。将活/死可固定蓝(英杰公司(invitrogen))用于所有facs实验。对于ilc的胞内细胞因子染色，将细胞与指示的细胞因子一起孵育指示的时间段，然后用pma/离子霉素(ionomycin)和布雷菲德菌素a刺激2小时-4小时，然后进行表面染色、固定和透化(foxp3染色试剂盒，ebiosciences公司)用于胞内染色。
对于来自copd患者的人类ilc的染色(图8)，将来自非吸烟健康对照、吸烟对照、或稳定copd患者的pbmc从肝素cp管(bdbiosciences公司)分离，并根据生产商的方案使用cd3和cd19微珠(美天旎公司(miltenyi))耗竭t细胞和b细胞。所有供体均来自copd基因(copdgene)库并根据研究指导给出了知情同意。然后用抗cd3、cd19、il-7rα、cd161(ebiosciences公司)、crth2、和cd56(biolegend)的抗体染色细胞。谱系混合物包括抗tcrαβ、tcrγδ、cd34、cd14、cd16、cd1α、cd303α、cd123、fcεr1(ebiosciences公司)的抗体。胞内抗体包括gata-3和t-bet(ebiosciences公司)。将活/死可固定蓝(英杰公司(invitrogen))用于所有facs实验。所有样品在lsrii上运行并使用flowjo分析。
ilc的过继转移
对于ilc2转移(图4、5、和6)，将小鼠在第1、3、和5天用2.5μg重组il-33进行鼻内处理以扩增ilc2，或用il-12+il-18+il-33进行鼻内处理以扩增ilc1。在第7天，纯化cd45+活的cd3-cd49b-lin-cd90+cd44+cd25+st2+il-18rα-细胞，并经由尾静脉注射转移1-1.5x105。除ilc2外，转移2.5-3x106肺部衍生的t/b/nk细胞。12小时后，如上所述，受体小鼠感染甲型流感。在感染后第7天和第10天进行分析。在感染后第2天通过msd测量bal中的细胞因子。
免疫组织化学方法
gfp-阳性细胞鉴定。
在自动化免疫组织化学机器人(autostainerplus，贾科公司(dako))中，在免疫组织化学染色之前，对石蜡包埋的肺部截面进行热诱导表位修复(hier)。简而言之，在用初级鸡抗gfp抗体(艾碧康公司(abcam))孵育之前，用envisiontmflex过氧化物酶阻断试剂和无血清蛋白阻断物(proteinblock)(均来自贾科公司(dako))顺序地阻断截面。接下来，将截面与轭合至hrp的山羊抗鸡抗体(艾碧康公司(abcam))一起孵育，然后与3,3'-二氨基联苯胺(dab)底物-色原溶液一起孵育，并用迈尔(mayer’s)苏木精(蓝色核)复染。最后，将截面通过乙醇系列脱水、在二甲苯中清除，并用pertex(西斯特实验室(histolab))封片。
gfp阳性细胞和甲型流感的双重免疫组织化学染色
gfp和甲型流感的免疫反应性在小鼠肺部中共可视化。简而言之，将经hier处理的截面与鸡抗gfp抗体一起孵育，通过hrp轭合的山羊抗鸡抗体(艾碧康公司(abcam))进行检测，并使用过氧化物酶底物dab作为色原产生棕色免疫反应产物。然后将截面用变性溶液(biocaremedical公司)进行处理，并与山羊抗甲型流感抗体(艾碧康公司(abcam))一起孵育，然后与轭合至hrp的兔抗山羊抗体(贾科公司(dako))一起孵育。最后，使用过氧化物酶底物vinagreen作为色原(biocaremedical公司)产生绿色流感免疫反应产物。将苏木精用作背景染色(蓝色核)，并将组织截面在二甲苯中清除并用pertex封片。
gfp、gata-3和甲型流感的三重免疫组织化学染色
将经hier处理的组织截面与山羊抗甲型流感抗体一起孵育，然后与hrp轭合的兔抗山羊抗体一起孵育并在流感免疫反应性位点进行棕色dab色原的显影。接下来，将截面用变性阻断溶液处理，并与鸡抗gfp和兔抗gata3第一抗体(艾碧康公司(abcam))一起孵育。然后分别与轭合至alexa488或555的山羊抗鸡和山羊抗兔第二抗体进行孵育(生命科技公司(lifetechnologies))。最后，将组织用dna结合荧光染料hoechst(蓝色核)处理，并用pbs/甘油封片。将所有3种标志物的免疫反应性通过组合的明视野和数字荧光扫描仪单元(奥林巴斯(olympus)vs120)捕获并数字化。
原位杂交(ish)
根据生产商的说明书(高级细胞诊断学(advancedcelldiagnostics))，使用rnascope2.0ffpe测定试剂盒使il-12和il-18mrna可视化。简而言之，将组织截面去石蜡，与内源酶阻断剂一起孵育，在预处理缓冲液中煮沸，并用蛋白酶处理，然后使用mm-il12b(319551，acd)和mm-il18(416731，acd)探针进行靶探针杂交。针对管家基因ppib或细菌基因dapb的探针分别用作阳性和阴性对照。然后将靶rna扩增并用dab色原检测。最后，使用pertex将组织截面脱水并封片。
il-12或il-18mrna和gfp阳性ilc的组合可视化
随后将之前通过原位杂交对il-12或il-18mrna染色的组织截面与鸡抗gfp抗体一起孵育，然后使用山羊抗鸡-hrp和vinagreen色原显影进行检测。
gfp+细胞中gata-3强度的四重组织化学和定量
将截面进行dna/核染色(dapi，alexa355)，组合gfp、gata-3(分别用alexa488和alexa-555免疫荧光)、和流感(用dab色原的明视野可视化)的三重免疫组织化学染色。通过组合的荧光和明视野olympusvs-120虚拟载玻片显微镜将所有染色通道数字化，以产生针对每个标志物的整个截面的一个高分辨率图像。使用基于感兴趣的区域(roi)的自动化方法(软件imagej1.47v)测量个体gfp阳性细胞中gata-3免疫染色的强度。简而言之，从alexa488图像开始，将强度阈值进行调整、锁定、并用于创建对应于gfp阳性细胞的roi。然后将多个gfproi粘贴到对应的alexa-555图像中并用于测量每个gfp阳性roi中gata-3的强度(即alexa555平均强度)。相似地，将gfproi粘贴到alexa355图像中，并计算相同gfp阳性roi中的dapi强度，以调整核含量的gata-3强度。将流感染色的扫描的明视野图像用于可视化gfp细胞、gata-3强度和区域持续感染之间的空间关系。
gfp+细胞中甲型流感的定量
对截面进行gfp和甲型流感的免疫组织化学染色(分别用dab和vinagreen进行明视野可视化)，并通过olympusvs-120虚拟载玻片显微镜进行数字化。使用计算机图像分析(visiomorph-dp，丹麦)计算甲型流感的总免疫反应性和总组织区域。将甲型流感阳性计算为具有甲型流感免疫反应性的总组织区域的％。
统计分析
copd样品
将具有异质组内方差(heterogeneous-within-groupvariance)的单向混合效应anova模型应用于连续测量的比较。将线性对比用于测试测量值与每年平均恶化水平之间的线性趋势。将菲舍尔氏精确测试(fisher’sexacttest)用于分类测量的比较，并将威尔克森测试(wilcoxontest)用于比较人口统计表中每年的平均恶化。将pearson相关系数用于评估两个连续测量之间的相关性。将sas9.3用于统计分析。
所有其他分析
如附图说明中所述的将数据使用graphpadprism进行分析和表达。误差条代表平均标准误差。
***
具体实施例的前述描述将如此充分地揭示本发明的总体性质，使得在不脱离本发明的一般概念的情况下，其他人可以无需过多的实验、通过应用本领域技术范围内的知识，容易地针对此类具体实施例的各种应用进行修改和/或适应。因此，基于本文给出的传授和指导，此类改编和修改旨在落入所披露实施例的含义和等同范围内。应当理解，本文中的短语或术语是出于描述而非限制的目的，这样使得本说明书的术语或短语可根据传授内容和指导为本领域技术人员所理解。本发明进一步通过下述权利要求进行描述。
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