通过结合FXR激动剂和ARB获得的药物的制作方法

本发明涉及一种用于非酒精性脂肪性肝炎(在本说明书中以下也缩写为nash)的治疗剂，并且具体涉及一种有效对抗nash中肝纤维化的治疗剂。更具体地，本发明涉及用于nash的治疗剂，该治疗剂包含作为活性成分的法尼醇x受体(在本说明书中以下也缩写为fxr)激动剂(具体地，奥贝胆酸(obeticholicacid))或其药学上可接受的盐和血管紧张素ii受体阻断剂(在本说明书中以下也缩写为arb)或其药学上可接受的盐。

现有技术

nash是一种常见的慢性肝脏疾病，其特征在于代谢障碍(例如肥胖症和2型糖尿病(t2dm))的发生。随着近年来代谢综合征患病率的增加，人们越来越关注预防和治疗由代谢综合征引起的各种疾病。在这些疾病中，nash一直是特别感兴趣的焦点。

nash是一种由肝脏中的脂肪(该肝脏中的脂肪由于例如氧化应激、胰岛素抵抗和炎性细胞因子等因素从早期脂肪肝发展而来)堆积所引起的肝炎，并且其特征是脂肪性肝脏疾病的转变，病理学越来越严重。此外，在nash和其继发的肝纤维化的进展中，存在进展为例如致命性肝硬化或肝细胞癌等疾病的严重风险。

目前已知具有以下所示的化学式的奥贝胆酸在抑制各种肝脏疾病(包括nash)中的纤维化的单一疗法中具有作用，并且预期将会用于治疗例如nash和pbc等疾病(专利文件1-3)。奥贝胆酸也被称为3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷-24-酸、6α-乙基-3α,7α-二羟基-5β-胆烷-24-酸、6α-乙基-鹅脱氧胆酸、6-乙基-cdca、6ecdca、胆烷-24-酸、6-乙基-3,7-二羟基-(3α,5β,6α,7α)-、oca、dsp-1747和int-747。

[化学式1]

arb(其是血管加压药血管紧张素ii的拮抗剂)是通过与血管紧张素ii受体结合而发挥抗高血压作用的药物，其中临床使用的该类抗高血压药的实例包括氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦和阿齐沙坦。由于arb不仅具有抗高血压作用，还具有例如减少炎症、改善内皮功能、抑制心血管重塑、抑制氧化应激、抑制生长因子和改善胰岛素抵抗等其他作用，其可用于治疗如下障碍：例如心血管等疾病、肾脏疾病和动脉硬化，并且arb已成为很多临床和非临床研究的主题(非专利文件1-2)。

关于arb，由于还有报道称这些药物可以减轻肝纤维化并且血管紧张素ii受体在肝纤维化中起作用，因此预期arb能够抑制肝脏疾病中的肝纤维化(非专利文件3-5)。

尽管这些药物(其以这种方式显示出有希望抑制肝脏疾病中的肝纤维化)中的若干种是已知的，但实际上，没有发现这类药物作为有效预防和治疗肝病中肝纤维化的药剂是有效的，并且迫切需要开发此类药剂。

尽管本发明的诸位发明人过去曾报道熊脱氧胆酸和arb的组合抑制肝纤维化的进展(非专利文献6)，但尚未有关于使用fxr激动剂(具体是奥贝胆酸)和arb的组合来治疗肝脏疾病(具体是nash)中的肝纤维化的报道。熊脱氧胆酸不具有fxr激动剂作用(非专利文件7)。

现有技术文件

专利文件

专利文件1：日本专利号4021327

专利文件2：日本专利号5094384

专利文件3：日本审查专利申请公开号2015-52162

非专利文件

非专利文件1：amer.j.hypertension[美国高血压杂志],18,720-730(2005)

非专利文件2：currenthypertensionreport[最新高血压报告],10,261-267(2008)

非专利文件3：bmcresnotes[bmc研究笔记]；2:70(2009)

非专利文件4：hepatology[肝脏学],34,745-750(2001)

非专利文件5：hepatolres[肝脏病学研究],27,51-56(2003)

非专利文件6：journalofgastroenterology[胃肠病学杂志],doi:10.1007/s00535-015-1104-x,第1-11页,在线优先出版:2015年7月21日

非专利文件7：journaloflipidresearch[脂质研究杂志],45,132-138(2004)

技术实现要素：

发明目的

本发明的目的是提供一种可用于预防和/或治疗nash(更具体地，预防、治疗或改善nash中的肝纤维化)的药剂，该药剂含有作为其活性成分的fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐。

用于实现目的的手段

为了实现上述目的，本发明的诸位发明人具体考虑到nash构成涉及多种相互关联因子的复杂病理，进行了各种研究以试图使用多种具有不同作用机制的药物的各种组合来提供有效的治疗，并且由于广泛研究，发现给予fxr激动剂或其药学上可接受的盐(具体是奥贝胆酸或其药学上可接受的盐)和arb或其药学上可接受的盐的组合在大鼠的非酒精性脂肪性肝炎(nash)模型中明显地抑制了肝纤维化，从而实现了本发明。更具体地，诸位发明人发现，与单一疗法中常规给予奥贝胆酸或arb相比，这些药物的组合产生了协同和显著增加的治疗作用。

具体地，本发明包括以下实施例。

[1]一种组合药物试剂，该组合药物试剂包含作为活性成分的法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐和血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐。

[2]如上述[1]所述的药物试剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452。

[3]如上述[1]或[2]所述的药物试剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175或px-104。

[4]如上述[1]-[3]中任一项所述的药物试剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸或int-767。

[5]如上述[1]-[4]中任一项所述的药物试剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸。

[6]如上述[1]-[4]中任一项所述的药物试剂，其中该fxr激动剂是int-767。

[7]如上述[1]-[6]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦。

[8]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是氯沙坦。

[9]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是坎地沙坦。

[10]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是替米沙坦。

[11]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是缬沙坦。

[12]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是奥美沙坦。

[13]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是厄贝沙坦。

[14]如上述[1]-[7]中任一项所述的药物试剂，其中该arb是阿齐沙坦。

[15]一种用于非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗剂，该治疗剂包含如上述[1]-[14]中任一项所述的组合药物试剂。

[16]如上述[15]所述的治疗剂，其特征在于法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐和血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐的组合使用。

[17]如上述[16]所述的治疗剂，其特征在于该fxr激动剂或其药学上可接受的盐和该arb或其药学上可接受的盐是同时地或在不同时间分开地给予。

[18]一种用于非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗剂，该治疗剂包含法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐，该治疗剂的特征在于血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐的组合使用。

[19]一种用于非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗剂，该治疗剂包含血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐，该治疗剂的特征在于法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐的组合使用。

[20]如上述[18]或[19]所述的治疗剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452。

[21]如上述[18]-[20]中任一项所述的治疗剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175或px-104。

[22]如上述[18]-[21]中任一项所述的治疗剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸或int-767。

[23]如上述[18]-[22]中任一项所述的治疗剂，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸。

[24]如上述[18]-[22]中任一项所述的治疗剂，其中该fxr激动剂是int-767。

[25]如上述[18]-[24]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦。

[26]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是氯沙坦。

[27]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是坎地沙坦。

[28]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是替米沙坦。

[29]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是缬沙坦。

[30]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是奥美沙坦。

[31]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是厄贝沙坦。

[32]如上述[18]-[25]中任一项所述的治疗剂，其中该arb是阿齐沙坦。

[33]如上述[15]-[32]中任一项所述的治疗剂，其中该上述nash治疗是抑制nash中的肝纤维化。

[34]如上述[1]-[14]中任一项所述的组合药物试剂用于生产用于非酒精性脂肪性肝炎(nash)的治疗剂的用途。

[35]如上述[1]-[14]中任一项所述的组合药物试剂用于生产用于抑制nash中的肝纤维化的药剂的用途。

[36]一种用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法，其特征在于以治疗有效剂量向患者给予法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐和血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐的组合。

[37]如上述[36]所述的治疗方法，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452。

[38]如上述[36]或[37]所述的治疗方法，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175或px-104。

[39]如上述[36]-[38]中任一项所述的治疗方法，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸或int-767。

[40]如上述[36]-[39]中任一项所述的治疗方法，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸。

[41]如上述[36]-[39]中任一项所述的治疗方法，其中该fxr激动剂是int-767。

[42]如上述[36]-[41]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦。

[43]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是氯沙坦。

[44]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是坎地沙坦。

[45]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是替米沙坦。

[46]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是缬沙坦。

[47]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是奥美沙坦。

[48]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是厄贝沙坦。

[49]如上述[36]-[42]中任一项所述的治疗方法，其中该arb是阿齐沙坦。

[50]如上述[36]-[49]中任一项所述的治疗方法，其中该上述nash治疗是抑制nash中的肝纤维化。

[51]一种法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐和血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐的组合，用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)。

[52]如上述[51]所述的组合，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452。

[53]如上述[51]或[52]所述的组合，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175或px-104。

[54]如上述[51]-[53]中任一项所述的组合，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸或int-767。

[55]如上述[51]-[54]中任一项所述的组合，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸。

[56]如上述[51]-[54]中任一项所述的组合，其中该fxr激动剂是int-767。

[57]如上述[51]-[56]中任一项所述的组合，其中该arb是氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦。

[58]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是氯沙坦。

[59]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是坎地沙坦。

[60]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是替米沙坦。

[61]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是缬沙坦。

[62]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是奥美沙坦。

[63]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是厄贝沙坦。

[64]如上述[51]-[57]中任一项所述的组合，其中该arb是阿齐沙坦。

[65]如上述[51]-[64]中任一项所述的组合，其中该上述nash治疗是抑制nash中的肝纤维化。

[66]一种用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)的试剂盒，该试剂盒包含：

1)包含法尼醇x受体激动剂(fxr激动剂)或其药学上可接受的盐的药物试剂；

2)包含血管紧张素ii受体阻断剂(arb)或其药学上可接受的盐的药物试剂；和

3)用于给予上述1)和2)的组合的说明。

[67]如上述[66]所述的试剂盒，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452。

[68]如上述[66]或[67]所述的试剂盒，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175或px-104。

[69]如上述[66]-[68]中任一项所述的试剂盒，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸或int-767。

[70]如上述[66]-[69]中任一项所述的试剂盒，其中该fxr激动剂是奥贝胆酸。

[71]如上述[66]-[69]中任一项所述的试剂盒，其中该fxr激动剂是int-767。

[72]如上述[66]-[71]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦。

[73]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是氯沙坦。

[74]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是坎地沙坦。

[75]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是替米沙坦。

[76]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是缬沙坦。

[77]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是奥美沙坦。

[78]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是厄贝沙坦。

[79]如上述[66]-[72]中任一项所述的试剂盒，其中该arb是阿齐沙坦。

[80]如上述[66]-[79]中任一项所述的试剂盒，其中该上述nash治疗是抑制nash中的肝纤维化。

[81]一种用于抑制肝脏疾病中的肝纤维化的药剂，该药剂包含如上述[1]-[14]中任一项所述的组合药物试剂。

[82]如上述[81]所述的用于抑制肝纤维化的药剂，其中该肝脏疾病选自乙型肝炎；丙型肝炎；寄生虫性肝脏疾病；移植后细菌感染、移植后病毒感染或移植后真菌感染；酒精性肝脏疾病(ald)；非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)；甲氨蝶呤引起的肝脏疾病、异烟肼诱导的肝脏疾病、酚丁诱导的肝脏疾病、甲基多巴诱导的肝脏疾病、氯丙嗪诱导的肝脏疾病、甲苯磺丁脲引起的肝脏疾病或胺碘酮诱导的肝脏疾病；自身免疫性肝炎；结节病；威尔逊氏症；血色素沉积症；戈谢病；糖原贮积症iii型、糖原贮积症iv型、糖原贮积症vi型、糖原贮积症ix型或糖原贮积症x型；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；脑肝肾综合征(zellwegersyndrome)；酪氨酸血症；果糖血症；半乳糖血症；巴德-吉亚利综合征相关血管病、静脉闭塞性病相关血管病、门静脉血栓形成相关血管病；或先天性肝纤维化。

[83]如上述[81]或[82]所述的用于抑制肝纤维化的药剂，其中该肝脏疾病是ald或nafld。

[84]如上述[81]-[83]中任一项所述的用于抑制肝纤维化的药剂，其中该肝脏疾病是nafld。

本发明的作用

根据本发明，可以预期通过给予fxr激动剂或其药学上可接受的盐(具体是奥贝胆酸或其药学上可接受的盐)与arb或其药学上可接受的盐的组合或混合物，可以实现与用这些药物中的任一种的单一疗法相比，治疗作用的显著增加，从而提供治疗和/或预防nash的作用，更具体地，提供预防、抑制和/或减轻nash中的肝纤维化的作用。此外，根据本发明，可以预期通过在组合给予或混合给予中使用上述两种药物(活性成分)增加治疗作用，可以以与它们在单一疗法中的剂量相比降低的剂量来给予这些药物，从而减少与之相关的不良反应。

此外，可以预期本发明不仅在nash中，而且在所有类型的肝脏疾病中都显示出对肝纤维化的治疗作用，这些肝脏疾病包括：乙型肝炎；丙型肝炎；寄生虫性肝脏疾病；移植后细菌感染、移植后病毒感染和移植后真菌感染；酒精性肝脏疾病(ald)；非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)；甲氨蝶呤引起的肝脏疾病、异烟肼诱导的肝脏疾病、酚丁诱导的肝脏疾病、甲基多巴诱导的肝脏疾病、氯丙嗪诱导的肝脏疾病、甲苯磺丁脲引起的肝脏疾病或胺碘酮诱导的肝脏疾病；自身免疫性肝炎；结节病；威尔逊氏症；血色素沉积症；戈谢病；糖原贮积症iii型、糖原贮积症iv型、糖原贮积症vi型、糖原贮积症ix型和糖原贮积症x型；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；脑肝肾综合征；酪氨酸血症；果糖血症；半乳糖血症；巴德-吉亚利综合征相关血管病、静脉闭塞性病相关血管病、和门静脉血栓形成相关血管病；以及先天性肝纤维化。

附图说明

[图1]图1显示了工作实例1的组(g1-g5)的经天狼星红染色的肝脏切片的显微照片的代表性实例。

[图2]图2显示了工作实例1的组中的纤维化进展的组织学特征的半定量分析的结果。此外，在该图中，条状物指示各组中纤维化区域的平均面积指数。星号(**)指示所示组之间的统计学显著差异(p<0.01；斯氏t检验)。

[图3]图3显示了工作实例2中的组(g1-g5)的经α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)免疫组织学染色的肝脏切片的显微照片的代表性实例。

[图4]图4显示了工作实例2的各组的免疫组织化学特征的半定量分析结果。此外，在该图中，条状物指示各组中经α-sma染色的区域的平均面积指数。星号(**)指示所示组之间的统计学显著差异(p<0.01；斯氏t检验)。

[图5]图5显示了通过rt-pcr对工作实例2的组中的tgf-β1和α1(i)前胶原mrna表达进行定量分析的结果。此外，在该图中，条状物指示mrna表达的量。星号(*；**)指示所示组之间的统计学显著差异(*：p<0.05；**：p<0.01)。

[图6]图6显示了当氯沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2l、g2a、g2al、g3、g4、g5)中抑制人肝星状细胞的增殖能力的作用的研究结果。

[图7]图7显示了当缬沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制人肝星状细胞的增殖能力的作用的研究结果。

[图8]图8显示了当坎地沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制人肝星状细胞的增殖能力的作用的研究结果。

[图9]图9显示了当氯沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2l、g2a、g2al、g3、g4、g5)中抑制tgf-β1纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图10]图10显示了当缬沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制tgf-β1纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图11]图11显示了当坎地沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制tgf-β1纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图12]图12显示了当氯沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2l、g2a、g2al、g3、g4、g5)中抑制α1(i)前胶原纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图13]图13显示了当缬沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制α1(i)前胶原纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图14]图14显示了当坎地沙坦用作arb时，在工作实例3的组(g1、g2al、g3、g4、g5)中抑制α1(i)前胶原纤维化标记基因表达的作用的研究结果。

[图15]图15显示了在工作实例7的药物给予组(g3、g4、g5)中减轻肝细胞肿胀的作用的研究结果。此外，在该图中，条状物指示肝细胞肿胀改善率。

[图16]图16显示了在工作实例8的药物给予组(g3、g4、g5)中改善alt活性的作用的研究结果。此外，在该图中，条状物指示alt活性的变化。

优选实施例的说明

在本发明的上下文中，术语“法尼醇x受体激动剂”或“fxr激动剂”是指对于法尼醇x受体(fxr)具有特异性的配体，其是具有结合fxr的作用、因此特异性地刺激配体依赖性fxr转录活性(与在不存在任何配体的情况下确定的基线水平不同)的化合物(所述化合物包括天然化合物、衍生自天然化合物的半合成化合物和合成化合物)。该作用也简称为fxr刺激作用或fxr活化作用。此外，还可以使用作为“fxr激动剂”、“fxr激活剂”、“fxr刺激剂”、“fxr活化配体”、“fxr特异性配体”或简称“fxr配体”的同义词。

已知fxr(法尼醇x受体)(是具有胆汁酸作为配体的核受体)参与胆汁酸代谢、胆固醇代谢、脂质代谢等，并且预期fxr激动剂对障碍(例如肝脏疾病、代谢疾病和器官纤维化)具有作用。

将天然胆汁酸鹅脱氧胆酸分离为具有最高活性的天然fxr配体，并随后发现奥贝胆汁酸在半合成烷基化胆汁酸中具有最强的fxr刺激作用。

对fxr激动剂没有特别限制，其中实例包括下表中所示的奥贝胆酸、鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104、ljn-452。用于本发明的fxr激动剂优选为奥贝胆酸或int-767，并且更优选为奥贝胆酸。

用于本发明的fxr激动剂还可包括两种或更多种fxr激动剂。

[表1]

fxr激动剂(更具体地，任何上述化合物)可以是任何公知的化合物，并且可以通过任何公知的方法产生。例如，可以通过日本审查专利申请公开号2015-52162中披露的方法产生奥贝胆酸。

对本发明中使用的“血管紧张素ii受体阻断剂”或“arb”没有特别限制，其中实例包括下表中提到的药物，例如氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦和阿齐沙坦。用于本发明的arb优选为氯沙坦、缬沙坦或厄贝沙坦，更优选为氯沙坦或厄贝沙坦，并且最优选为氯沙坦。

在另一个实施例中，所用药物优选为坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦或阿齐沙坦，更优选为替米沙坦、奥美沙坦或阿齐沙坦，甚至更优选为替米沙坦或奥美沙坦，并且最优选为奥美沙坦。

此外，在另一个实施例中，所用药物优选为坎地沙坦、替米沙坦或阿齐沙坦，更优选为替米沙坦或阿齐沙坦，并且最优选为替米沙坦。

在另外的实施例中，所用药物优选为坎地沙坦、奥美沙坦或阿齐沙坦，更优选为奥美沙坦或阿齐沙坦，并且最优选为阿齐沙坦。在另外的实施例中，所用药物优选为坎地沙坦、替米沙坦或奥美沙坦，

更优选为坎地沙坦或奥美沙坦，并且最优选为坎地沙坦。在另外的实施例中，所用药物优选为氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦。

本发明的arb可以以两种或更多种arb的形式包括在内。

在本发明的上下文中，术语“氯沙坦”是指具有下表所示结构式的氯沙坦和商业上使用的氯沙坦的钾盐(氯沙坦钾)两者。氯沙坦钾是优选的。

在本发明的上下文中，术语“坎地沙坦”是指具有下表所示结构式的坎地沙坦和商业上使用的坎地沙坦的西来替昔(cilexitil)酯(坎地沙坦西来替昔)两者。坎地沙坦西来替昔是优选的。

在本发明的上下文中，术语“奥美沙坦”是指具有下表所示结构式的奥美沙坦和奥美沙坦的medoxomil酯(奥美沙坦medoxomil)两者。奥美沙坦medoxomil是优选的。

[表2-1]

[表2-2]

arb或其药学上可接受的盐可以通过公知的方法产生。还可以使用商业arb。

本发明的fxr激动剂和arb可以以药学上可接受的盐的形式使用。“药学上可接受的盐”可以是不影响fxr激动剂或arb本身活性的任何药学上可接受的盐，其中实例包括无机酸的盐、有机酸的盐、无机盐的盐和有机盐的盐。

在药物试剂是碱性化合物的情况下，合适的盐的实例包括：具有与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸或磷酸)或有机酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、或谷氨酸)的酸加成盐。

在药物试剂是酸性化合物的情况下，合适的盐的实例包括：与无机盐(例如钠盐、钾盐、锂盐、钡盐、钙盐或镁盐)或有机盐(例如吡啶鎓盐、甲基吡啶盐或三乙铵盐)的碱加成盐。

在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的盐”包括水合物和溶剂化物。用于形成此类物质的溶剂的实例包括水和生理学上可接受的有机溶剂(例如乙醇和丙酮)，但在这方面没有特别限制。

在使用多种fxr激动剂和/或arb的组合的情况下，所用各种化合物的盐和溶剂化物可以是相同的或不同的。

在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”是指化合物、物质、组合物、载体和/或剂型的如下特性：在合理的医学判断范围内，不会引起任何过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或不良事件的，显示出合理的风险-收益比，并且适合用于与人和动物组织接触。

此外，fxr激动剂和arb或其药学上可接受的盐的前药也包括在本发明的范围内。在本发明的上下文中，术语“前药”是指本发明化合物的化学修饰的功能衍生物，其在体内转化为药理学活性化合物后或在到达靶位点后表现出其药理作用。

对本发明中使用的前药没有特别限制，其实例包括以下类型：

(1)根据本发明的化合物的羟基或氨基基团的磷酸酯前药；

(2)根据本发明的化合物的羟基或氨基基团的碳酸酯或氨基甲酸酯前药；

(3)根据本发明的化合物的羧酸或氨基基团的氨基前药；

(4)根据本发明的化合物的羧酸或氨基基团的氨基酸连接的前药；

和

(5)本发明化合物的酮、脒或胍的肟前药。

例如，本发明的前药可以通过naturereviewsdrugdiscovery[自然评论药物发现]7；255-270(2008)；或journalofmedicinalchemistry[药物化学杂志]2005,48(16),5305-5320中描述的方法产生。

此外，根据本发明的fxr激动剂可以以氨基酸缀合物的形式使用。在本说明书的上下文中，术语“氨基酸缀合物”是指与化合物(例如奥贝胆酸或鹅脱氧胆酸)缀合的任何所希望的合适的氨基酸。

大多数天然胆汁酸以通过主要与氨基酸(例如甘氨酸和牛磺酸)缀合进行生物合成的氨基酸缀合物的形式存在于体内(也称为缀合的胆汁酸)。例如，在人类中，胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸缀合以分别形成缀合的胆汁酸甘氨胆汁酸和牛磺胆汁酸。

例如，以相同的方式，本发明的fxr激动剂与天然胆汁酸鹅脱氧胆酸和半合成烷基化胆汁酸奥贝胆汁酸形成氨基酸缀合物。此类氨基酸缀合化合物应优选具有在胆汁或肠液中显示出增加的稳定性的另外的优点。任何合适的氨基酸优选包括甘氨酸和牛磺酸，但在这方面没有特别限制。更具体地，可以以氨基酸缀合物的形式使用奥贝胆酸，并且所述氨基酸缀合物包括甘氨酸和牛磺酸缀合物。

本发明的“非酒精性脂肪性肝炎(nash)治疗剂”是在诊断患有nash或怀疑患有nash的患者中用于治疗和/或预防的药剂。根据例如日本肝脏疾病学会(japansocietyofhepatology)的nash/nafld实践指南等标准，非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)是一种包括nash的上位概念，其中nafld构成由脂肪肝的组织学或图像诊断确定的病理，排除其他肝脏疾病，例如酒精性肝损伤。脂肪性肝脏疾病是疾病(包括肝细胞中中性脂肪(tg)沉积引起的肝损伤)的通用术语。由于许多nafld病例是由例如肥胖症、糖尿病、血脂异常和高血压等障碍引起的，因此它们被视为与代谢综合征相关的肝脏病变。在组织学上，nafld基于大液滴肝脂肪变性，并且该疾病分为非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafl)和nash两类。在nafl(也称为单纯性脂肪肝)中，预后被认为是有利的，并且几乎不会进展。nash的特征在于脂肪堆积、炎症和肝细胞损伤(气球样)，并且随着严重程度的增加，nash伴有进行性肝纤维化。nash的预后被认为取决于肝纤维化进展的程度，并且在预后不良的情况下，该疾病可能发展为肝硬化和肝细胞癌。本发明的“用于治疗nash的药剂”能够预防和/或治疗nafld，以及预防从nafl进展到nash。

本说明书中的“抑制肝纤维化的药剂”是用于预防、抑制和/或减轻肝纤维化的药剂。在本发明的上下文中，术语“纤维发生”包括纤维化的病理状态及向纤维化的转变，以及其发生、进展和恶化。“纤维化”是指包括组织或器官(例如瘢痕组织)中过量纤维组织堆积的病症。这种瘢痕组织可能由于例如疾病、创伤或化学毒性等因素，或者对感染、炎症或器官损伤的反应而发生。纤维化可以发生在多种组织和器官(例如肝脏、肾脏、肠、肺和心脏)中。

在本发明的上下文中，术语“肝纤维化”是指在肝脏中发生的组织纤维化，并且包括纤维化的病理状态及向纤维化的转变，以及其发生、进展和恶化。

此外，本发明并不具体限于肝纤维化的各个阶段，而是涉及所有类型的肝脏疾病，包括乙型肝炎；丙型肝炎；寄生虫性肝脏疾病；移植后细菌感染、移植后病毒感染或移植后真菌感染；酒精性肝脏疾病(ald)；非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)，包括非酒精性脂肪性肝炎(nash)；甲氨蝶呤引起的肝脏疾病、异烟肼诱导的肝脏疾病、酚丁诱导的肝脏疾病、甲基多巴诱导的肝脏疾病、氯丙嗪诱导的肝脏疾病、甲苯磺丁脲引起的肝脏疾病或胺碘酮诱导的肝脏疾病；自身免疫性肝炎；结节病；威尔逊氏症；血色素沉积症；戈谢病；糖原贮积症iii型、糖原贮积症iv型、糖原贮积症vi型、糖原贮积症ix型或糖原贮积症x型；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；脑肝肾综合征；酪氨酸血症；果糖血症；半乳糖血症；巴德-吉亚利综合征相关血管病、静脉闭塞性病相关血管病、或门静脉血栓形成相关血管病；或先天性肝纤维化，并且可以预期本发明可有效治疗所有这些疾病中的肝纤维化。

本发明可优选用于与酒精性肝脏疾病(ald)或非酒精性脂肪性肝脏疾病(nafld)(包括非酒精性脂肪性肝炎(nash))相关的肝纤维化，更优选用于与nafld(包括nash)相关的肝纤维化，并且具体优选用于与nash相关的肝纤维化。

此外，本发明可以在患有继发于代谢障碍(例如肥胖症症和2型糖尿病(t2dm))的nash的患者中显示出出色的治疗作用。本发明具体适用于治疗由代谢疾病引起的nash。也适用于治疗伴有高血压的nash。

术语“治疗”包括关于疾病及其症状的所有治疗(例如改善、减轻和抑制进展)。这还可以包括预防疾病的症状和/或进展。此外，术语“治疗(treatment或treating)”包括在任何疾病状态中产生改善的任何作用(例如降低、减少、抑制疾病的进展，减轻、预防、调节或消除疾病)。例如，“治疗(treatment或treating)”疾病状态包括预防疾病状态(特别是阻止疾病状态或其临床症状的进展)，或减轻疾病状态(特别是暂时地或永久地，或部分地或完全地)，以及消除疾病状态或其临床症状。

在本发明的上下文中，“治疗”是指在患者(例如哺乳动物或特别是人)中治疗和/或预防nash，以及预防、抑制和/或减轻肝纤维化。例如，nash的治疗包括预防nash的发生、抑制nash的进展、治疗nash、抑制nash的治疗后的复发等。这还包括预防和/或治疗nafld和预防从nafl进展到nash。

“患者”是指人和其他动物，例如狗、猫和小鼠。哺乳动物是优选的，并且其中人是具体优选的。

术语“治疗有效剂量”是指研究人员或医生在组织、系统、动物或人中引起所希望的生物或药物反应的药物或药物试剂的剂量。此外，在向哺乳动物进行给予来治疗疾病的情况下，“治疗有效剂量”是指足以治疗疾病的药物(fxr激动剂、arb等)的剂量。“治疗有效剂量”将根据药物、疾病及其严重程度而变化，并且在哺乳动物的情况下，根据其年龄、体重等变化。

此外，术语“有效剂量”还是指在给予适当剂量时产生急性或慢性治疗作用的药物(fxr激动剂、arb等)的剂量。该治疗作用的实例包括预防、矫正、阻断或逆转达到可检测程度的疾病/病理状态(例如肝纤维化)以及与其相关的并发症的体征、症状和潜在病理。该有效剂量的实例是本发明的fxr激动剂或arb在单一疗法中的剂量、本发明的fxr激动剂和arb的组合剂量、和/或本发明的组合药物试剂与另一种nash治疗剂一起的剂量。

在本发明中，对fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐的组合的比率没有特别限制，并且可以酌情选择该比例以达到所希望的预防和/或治疗nash的作用。对该组合比率没有特别限制，可以酌情选择，例如在1:100-100:1、1:10-10:1、或1:3-3:1的范围内。

在本发明的fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐的组合中，这两种药剂可以分开地给予，或者它们可以作为单一剂型一起给予。此外，本发明的组合的组分之一可以在其他组分之前给予、与其他组分同时给予或在其他组分之后给予。组分可以以单一剂量或分开剂量的形式制备成药物配制品。

对根据本发明的fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐的组合的实施例没有特别限制，并且可以提及下面的实施例(i)和(ii)作为实例：

(i)含有作为单一配制品的fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐(单一药物试剂组合物，混合配制品)的两种组分的实施例；和

(ii)含有作为分开配制品的fxr激动剂或其药学上可接受的盐(药物组合物)和arb或其药学上可接受的盐(药物组合物)的实施例。

在上述实施例(ii)的情况下，配制品可以同时地或以合适的时间间隔分开地给予，并且可以使用合适的给予方案以实现预防和/或治疗nash的所希望的作用。此外，在上述实施例(ii)的情况下，这两种配制品可以作为试剂盒提供，该试剂盒含有组合成单一包装的所述配制品。

对本发明的给予途径没有特别限制，其中实例包括口服、舌下、口腔、胃肠外(例如皮下、肌肉内或静脉内)、直肠、局部和鼻内给予。口服给予或肠胃外给予是优选的，其中口服给予是具体优选的。

在上述实施例(ii)的情况下，配制品之一可以口服给予，并且另一种可以胃肠外给予。

口服给予形式的实例包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂和糖浆剂。胃肠外给予形式的实例包括注射剂、栓剂、吸入制剂、透皮吸收制剂、局部皮肤制剂、滴眼剂和滴鼻剂。

本发明的活性成分可以单独配制或一起配制成适用于所讨论的给予途径的制剂，该制剂含有普通无毒的药学上可接受的载体、助剂或媒介物。在这些给予形式中，口服给予形式是优选的，其中具体优选片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂和糖浆剂。上述口服和胃肠外给予形式可以例如基于标准(例如第16次修订的日本药典针对配制品的一般规定(generalregulationsforpreparationsofthe16threvisedjapanesepharmacopoeia))中规定的方法，使用公知的配制品添加剂来产生。

本发明的药物试剂可以进一步含有药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稳定剂和其他组分。例如，如果本发明的药物剂型是注射制剂，则可以添加可接受的缓冲剂、增溶剂、等渗剂和ph调节剂。药学上可接受的组分是本领域技术人员已知的，并且它们可以在本领域技术人员的实施范围内从(例如，在第16次修订的日本药典的其他书面标准中)指定的组分中酌情选择。

对根据本发明的活性成分(fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐)的组合的剂量没有特别限制，并且可以根据各种条件(例如患者的年龄、体重、症状以及给予的形式和频率)酌情增加或减少。此外，根据本发明的组合的组分之一的剂量可以独立于其他组分酌情增加或减少。

此外，由于给予本发明的活性成分(作为两种药物试剂，fxr激动剂或其药学上可接受的盐和arb或其药学上可接受的盐)的组合的组合制剂或混合制剂的治疗作用增加，可以将剂量(或给予的剂量)减少至低于单独给予组分所用的剂量，并因此可以预期所述组分的不良作用减少。例如，fxr激动剂(例如，奥贝胆酸)产生不良作用(例如瘙痒)，并且例如，通过给予处于组合制剂或混合制剂的本发明的奥贝胆酸和arb的组合，可以使用低于单一疗法所需剂量的剂量，因此允许减少瘙痒的不良事件的频率和/或严重程度。

fxr激动剂或其药学上可接受的盐可以以0.1mg-1g，并且优选1mg-500mg的日剂量使用。例如，如果fxr激动剂是奥贝胆酸，则该药物在成人中以0.1mg-1g、优选1mg-500mg、更优选2mg-100mg、并且具体优选5mg-50mg的游离药物的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg或100mg是优选的。

此外，例如，如果fxr激动剂是int-767，则该药物在成人中以0.1mg-1g、优选1mg-500mg、更优选2mg-100mg、并且具体优选5mg-50mg的游离药物的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg或100mg是优选的。

arb或其药学上可接受的盐可以以0.1mg-200mg，并且优选1mg-100mg的日剂量使用。例如，如果arb是氯沙坦、或更具体地是氯沙坦钾，则该药物在成人中以1mg-100mg、优选2mg-100mg、更优选5mg-100mg、并且具体优选10mg-50mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg或100mg是优选的。

此外，例如，如果arb是厄贝沙坦，则该药物在成人中以1mg-200mg、优选2mg-200mg、更优选5mg-200mg、并且具体优选10mg-100mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg、100mg或200mg是优选的。

此外，例如，如果arb是奥美沙坦、或更具体地是奥美沙坦medoxomil，则该药物在成人中以1mg-40mg、优选2mg-40mg、更优选5mg-40mg、并且具体优选10mg-20mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg或40mg是优选的。

此外，例如，如果arb是替米沙坦，则该药物在成人中以1mg-80mg、优选2mg-80mg、更优选5mg-80mg、并且具体优选10mg-40mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg或80mg是优选的。

此外，例如，如果arb是坎地沙坦、或更具体地是坎地沙坦西来替昔，则该药物在成人中以0.2mg-12mg、优选0.5mg-12mg、更优选1mg-12mg、并且具体优选2mg-8mg的日剂量使用，其中给予0.2mg、0.5mg、1mg、2mg、2.5mg、4mg、5mg、8mg、10mg或12mg是优选的。

此外，例如，如果arb是缬沙坦，则该药物在成人中以1mg-160mg、优选2mg-160mg、更优选5mg-160mg、并且具体优选10mg-80mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg、40mg、50mg、80mg或160mg是优选的。

此外，例如，如果arb是阿齐沙坦，则该药物在成人中以1mg-40mg、优选2mg-40mg、更优选5mg-40mg、并且具体优选10mg-20mg的日剂量使用，其中给予1mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、20mg、25mg或40mg是优选的。

关于给予间隔，上述剂量可以每日给予一次或以每日2次至若干次的分次剂量给予。

对这些活性成分在单一制剂中的制备没有特别限制，并且例如，它们可以以每1重量份的fxr激动剂或其药学上可接受的盐的0.01-100重量份、优选0.1-10重量份、更优选0.3-3重量份的arb或其药学上可接受的盐的比率混合。关于单一配制品也没有特别限制，例如，活性成分的总量可占药物组合物重量的0.1％-70％。

工作实例

以下是通过工作实例进一步详细说明本发明，但本发明的范围决不受这些实例的限制。

工作实例1

(方法)

向作为大鼠nash模型的大冢long-evans德岛肥胖(otsukalong-evanstokushimafatty，oletf)大鼠(被称为患有肥胖症的自然发生的ii型糖尿病的模型)给予猪血清(ps)以实验诱导肝纤维化，并且根据以下方法研究蒸馏水(媒介物给予组)、奥贝胆酸(fxr激动剂)和氯沙坦(arb)(给予组，组合给予组)的治疗作用。

[使用的动物]

雄性oletf大鼠(n＝40)和long-evans德岛大冢(long-evanstokushimaotsuka，leto)大鼠(n＝10：非糖尿病阴性对照组)

[使用的药物]

将奥贝胆酸(获得自interceptpharmaceuticals有限公司，经由住友制药有限公司(sumitomodainipponpharmaco.,ltd.))用作fxr激动剂，并将商业氯沙坦(氯沙坦的钾盐；在该工作实例中简称为“氯沙坦”)用作arb。

[给予剂量，给予期]

通过强制口服给予来给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和/或氯沙坦(30mg/kg/天)；所有情况的给予期均为8周。

[实验方法]

将12周龄的oletf大鼠随机分为4组(g2、g3、g4、g5)(每组n＝10)，并且每周两次腹膜内给予1.0ml/kg的猪血清(ps)，持续8周。将12周龄leto大鼠(n＝10)作为组g1并以相同的方式给予ps。在开始给予ps的同一天，通过强制连续口服给予，向组g3大鼠和组g4大鼠每天分别给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)，持续8周。以相同的方式向组g5大鼠每天给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)的组合给予，持续8周。向g1组(leto)和g2组(oletf)中的大鼠给予蒸馏水作为媒介物代替药物，并分别作为阴性对照组和阳性对照组(使用与药物组相同的给予方法)。

[组织学分析]

为了评估肝纤维化的进展，从完成上述测试并经天狼星红染色的大鼠中采集福尔马林固定的石蜡包埋的肝脏切片(宽度为5μm)。采集和收集这些经染色的切片的显微照片(在所有大鼠中，每个样品收集总共10个视野的显微图像)，并比较各组的显微照片。为了定量各组中纤维化的进展，使用来自nih(国立卫生研究院)的imagej软件对所收集的经染色的标本的图像的组织学特征进行半定量分析。

(结果)

大鼠nash模型中药物给予的结果显示于图1和图2中。

图1显示了各组的经天狼星红染色的肝脏切片的显微照片的代表性实例。阴性对照组(g1)和阳性对照组(g2)的比较显示，给予ps导致在leto大鼠(g1)中没有肝纤维化进展，其中仅在oletf大鼠(g2)中观察到明显的肝纤维化进展。此外，在奥贝胆酸单一疗法组(g3)和氯沙坦单一疗法组(g4)中，纤维化被适度抑制，尽管人们预期这些组显示出与单独给予媒介物的阳性对照组(g2)相同的明显进展，并且出人意料地，给予奥贝胆酸和氯沙坦两者的组合给予的组(g5)显示出与阴性对照组(g1)相同程度的肝纤维化的完全抑制。与各自的单一疗法组(g3，g4)相比，组合给予组(g5)中的这种作用非常突出，并且这可以说是构成了意想不到的协同作用。

图2显示了各组中纤维化进展的组织学特征的半定量分析结果。在该图的纵轴上显示的纤维化指数(fi)是通过对从各组中大鼠采集和收集的经染色的肝脏切片图像进行计算机分析而计算出的纤维化区域的平均面积指数。该结果定量地支持了在图1的显微照片中看到的组织学特征的结果。

fi值显示各组之间的统计学显著差异(p<0.01；斯氏t检验)。阳性对照组(g2)显示出极高的fi值，这些值比阴性对照组(g1)大约20倍。奥贝胆酸单一疗法组(g3)和氯沙坦单一疗法组(g4)显示出适度但显著的降低，其中分别降低至阳性对照组中约6/10和7/10的水平。此外，给予奥贝胆酸和氯沙坦两者的组合给予的组(g5)中的值约为阳性对照组中水平的1/20，其中fi值显示出显著且明显降低至与阴性对照组(g1)相同的水平。该结果以定量和统计学显著的方式显示组合给予完全抑制了肝纤维化，这显示出与用各自的药物的单一疗法相比高度突出的协同作用。

工作实例2

使用工作实例1中获得的各组中大鼠的肝脏切片，通过用α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)抗体的免疫组织学染色来进行免疫组织化学研究，并对转化生长因子-β1(tgf-β1)和胶原(α1(i)前胶原)mrna表达进行定量分析。已知α-sma是肝星状细胞(hsc)(也称为肝星细胞)活化的指示物(标记)。此外，肝星状细胞(hsc)的活化、伴随所述活化的tgf-β1(纤维化促进细胞因子)的过量产生、以及细胞外基质组分(例如胶原)的过量产生被认为在nash中的进行性肝纤维化的机制中起重要作用。因此，tgf-β1和胶原(α1(i)前胶原)的mrna表达可以是纤维化指示物(标记)。

(1)通过用α-sma抗体的免疫组织学染色进行免疫组织化学研究

(方法)

使用如上述工作实例1中的[组织学分析]所述的相同的方法(除了使用用α-sma抗体进行的免疫组织化学染色代替天狼星红染色)，对各组之间的显微照片进行比较，并对所收集的经染色的切片图像的免疫组织化学特征进行半定量分析，并且评估了奥贝胆酸和氯沙坦(给予组，组合给予组)对肝纤维化进展中hsc活化的阻断作用。

(结果)

这些结果显示于图3和图4中。

图3显示了各组中经α-sma免疫组织学染色的切片的显微照片的代表性实例。与工作实例1(即抑制肝纤维化)的组织学分析结果的情况一样，阴性对照组(g1)和阳性对照组(g2)的比较显示，虽然在leto大鼠(g1)中几乎没有观察到活化的hsc(活化的肝星状细胞，ac-hsc)，但仅在oletf大鼠(g2)中观察到ac-hsc的明显增加。此外，用奥贝胆酸(g3)和氯沙坦(g4)的单一疗法适度抑制了ac-hsc的增加，并且给予了奥贝胆酸和氯沙坦两者的组合的组(g5)显示出完全抑制，该完全抑制的程度与阴性对照组(g1)相同(即，hsc的活化几乎完全被阻断)。

图4显示了各组的免疫组织化学特征的半定量分析结果。在该图的纵轴上显示的α-sma指数(α-si)是通过对从各组中大鼠采集和收集的经染色的肝脏切片图像进行计算机分析而计算出的α-sma染色的区域的平均面积指数。该结果定量地支持了在图3的显微照片中看到的免疫组织化学特征的结果。

α-si值显示各组之间的统计学显著差异(p<0.01；斯氏t检验)。与阴性对照组(g1)相比，阳性对照组(g2)显示出极高的α-si值。与阳性对照组相比，奥贝胆酸单一疗法组(g3)和氯沙坦单一疗法组(g4)显示出适度但显著的降低。此外，给予奥贝胆酸和氯沙坦两者的组合给予的组(g5)显示α-si值的显著且突出的降低，至与阴性对照组(g1)相同的水平。该结果(如工作实例1(即抑制肝纤维化)的组织学分析的结果)以定量的和统计学显著的方式显示组合给予完全抑制了ac-hsc的增加，这显示出与用各自的药物的单一疗法相比高度突出的协同作用。

(2)tgf-β1和胶原mrna表达的定量分析

(方法)

通过定量实时聚合酶链反应(rt-pcr)分析工作实例1各组的大鼠的肝脏中tgf-β1和胶原(α1(i)前胶原)mrna的表达，来进行比较研究。通过rt-pcr的mrna表达水平的定量是使用荧光染料sybr^(r)green在steponeplus^tm系统(由appliedbiosystems^(r)制造)上进行的。

(结果)

结果显示于图5中。

图5显示了各组中tgf-β1和α1(i)前胶原mrna表达的rt-pcr定量结果。该图中的纵轴指示mrna表达的量。与阴性对照组(g1)相比，tgf-β1和α1(i)前胶原两者在阳性对照组(g2)中显示出极高的mrna表达水平。与阳性对照组相比，各自的奥贝胆酸单一疗法组(g3)和氯沙坦单一疗法组(g4)显示出适度的降低趋势。此外，在给予奥贝胆酸和氯沙坦的组合的组(g5)中，mrna表达显著且明显降低。该结果(如工作实例1(即抑制肝纤维化)的组织学分析的结果)以定量的和统计学显著的方式显示组合给予抑制了tgf-β1和α1(i)前胶原两者mrna表达的增加，这显示出与用各自的药物的单一疗法相比高度突出的协同作用。

此外，通过相同的方法对toll样受体4(tlr4)mrna表达进行定量。与工作实例1(即抑制肝纤维化)的组织学分析结果的情况一样，组合给予明显地抑制了tlr4mrna表达的增加(数据未在本说明书中显示)。已知肝脏tlr4介导的细胞内信号转导途径(内毒素lps信号转导)在肝纤维化进展机制中起主要作用。

工作实例3

(方法)

在体外细胞系统实验中证实了奥贝胆酸和三种类型的arb(氯沙坦、缬沙坦和坎地沙坦)的各种组合作用。具体地，使用人肝星状细胞(hhsc)(其与nash中肝纤维化进展的主要机制有关)，根据以下方法评估了奥贝胆酸与三种arb组合的给予对抑制hhsc增殖能力和纤维化标记的表达的影响。

[使用的细胞]

人肝星状细胞(hhsc)(也称为人肝星细胞)

[使用的药物]

将奥贝胆酸(获得自interceptpharmaceuticals有限公司，经由住友制药有限公司(sumitomodainipponpharmaco.,ltd.))用作fxr激动剂，并将商业氯沙坦(氯沙坦的钾盐；在该工作实例中简称为“氯沙坦”)以及缬沙坦和坎地沙坦(坎地沙坦的西来替昔酯；在该工作实例中简称为“坎地沙坦”)用作arb。

[使用的试剂]

使用血管紧张素ii(at-ii)和/或脂多糖(lps)(已知at1介导的at-ii信号传导和tlr4介导的lps信号传导两者在hsc活化和肝纤维化的进展中起主要作用)。

[实验方法]

(1)人肝星状细胞(hhsc)增殖抑制作用的研究

通过使用wst-1试剂的细胞增殖测定来评估抑制hhsc增殖能力的直接作用。

1)将hhsc以3000个细胞/200μl的量接种到96孔板上，并使其在1％fbsdmem培养基中增殖24小时。

2)24小时后，将这些细胞分成以下7组，并在添加以下药物和/或试剂后转移到培养基中。将氯沙坦用作arb。

阴性对照组(g1)：不添加药物(对照)

阳性对照组a(g2a)：at-ii(10^-6m)

阳性对照组l(g2l)：lps(10^-5m)

阳性对照组al(g2al)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)

奥贝胆酸给予(g3)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+奥贝胆酸(5x10^-6m)

arb给予(g4)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+arb(10^-6m)奥贝胆酸+arb组合给予(g5)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+奥贝胆酸(5x10^-6m)+arb(10^-6m)

3)将上述组(g1、g2a、g2l、g2al、g3、g4、g5)的细胞培养24小时后，各自进行wst-1细胞增殖测定，并且评估药物试剂对细胞增殖的抑制作用。

还根据上述步骤1)-3)评估了缬沙坦和坎地沙坦对hhsc增殖的抑制作用。在g1、g2al、g3、g4和g5这五个组中进行评估。

(2)纤维化标记基因表达抑制作用的研究

关于抑制纤维化标记基因表达的作用，通过rt-pcr方法来评估胶原生产能力和tgf-β生产能力。

1)将hhsc以300,000个细胞/2ml的量接种到6孔板上，并使其在1％fbsdmem培养基中增殖24小时。

2)24小时后，将这些细胞分成以下7组，并在添加以下药物和/或试剂后转移到培养基中。将氯沙坦用作arb。

阴性对照组(g1)：不添加药物(对照)

阳性对照组a(g2a)：at-ii(10^-6m)

阳性对照组l(g2l)：lps(10^-5m)

阳性对照组al(g2al)：at-ii(10-6m)+lps(10^-5m)

奥贝胆酸给予(g3)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+奥贝胆酸(5x10^-6m)

arb给予(g4)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+arb(10^-6m)

奥贝胆酸+arb组合给予(g5)：at-ii(10^-6m)+lps(10^-5m)+奥贝胆酸(5x10^-6m)+arb(10^-6m)

3)将上述组(g1，g2a，g2l，g2al，g3，g4，g5)的细胞培养24小时后，从各组中提取mrna。通过逆转录从mrna获得cdna，并通过rt-pcr方法来评估纤维化标记基因(tgf-β1和α1(i)前胶原)的表达

还根据上述步骤1)-3)评估了缬沙坦和坎地沙坦对纤维化标记基因表达的抑制作用。在g1、g2al、g3、g4和g5这五个组中进行评估。

(结果)

对人肝星状细胞(hhsc)增殖的抑制作用的研究结果示于图6-图8中，并且对纤维化标记基因表达的抑制作用的结果示于图9-图14中。各组的图中所示的条状物指示平均值±标准偏差(n＝8)。星号指示所示研究组之间的统计学显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。

图6、图7和图8显示了使用氯沙坦、缬沙坦和坎地沙坦作为arb时，各组中对hhsc增殖能力的抑制作用的研究结果。这些图的纵轴指示吸光度(吸收，od)，其与活细胞计数强烈相关。通过测量吸光度，可以定量wst-1试剂在代谢活性细胞上产生的甲臜染料产物的量。由于甲臜与培养基中活性细胞数之间存在线性正相关，因此可以观察细胞增殖能力和细胞活力。

与各自的单一疗法组(g2a和g2l)相比，两种试剂at-ii和lps(g2al)的添加显示出活化的hhsc的增殖的统计学显著促进(图6)。

arb单一疗法组(氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦)(g4)以及奥贝胆酸和arb(氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦)组合给予组(g5)显示，与阳性对照组al(g2al)相比，通过两种试剂at-ii和lps对促进活化的hhsc增殖的统计学显著抑制(图6、图7和图8)。

图9、图10和图11显示了使用氯沙坦、缬沙坦和坎地沙坦作为arb，各组中抑制tgf-β1纤维化标记基因表达的作用的研究结果，并且图12、图13和图14显示了使用氯沙坦、缬沙坦和坎地沙坦作为arb，各组中抑制α1(i)前胶原纤维化标记基因表达的作用的研究结果。该图的纵轴显示mrna表达的相对量。

在阳性对照组al(g2al)中由at-ii和lps诱导的tgf-β1和α1(i)-前胶原(tlr4)mrna表达显示了奥贝胆酸单一疗法组(g3)和arb(氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦)单一疗法组两者的统计学显著抑制。此外，与单一疗法组(g3、g4)相比，在添加了奥贝胆酸和arb(氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦)两者的组(g5)中观察到抑制tgf-β1和α1(i)-前胶原mrna表达的作用非常突出并且是统计学显著的。

上述结果表明，奥贝胆酸和arb(氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦)的组合对nash具有出色的预防和治疗作用。具体地，可以预期在nash中预防、抑制和减轻肝纤维化的显著作用。此外，还可以预期，奥贝胆酸与arb的组合，或fxr激动剂与arb的组合对nash具有出色的预防和治疗作用。

工作实例4

使用与工作实例1中相同的方法(除了在向动物给予猪血清(ps)后开始给予药物等，并使肝纤维化进展一段特定的时间(例如4周))，在媒介物给予组(蒸馏水)、给予组和组合给予组中对治疗作用进行评估。

同样地在涉及更严重的纤维化进展的病理中，与工作实例1中的情况一样，预期预防和治疗nash的出色的作用。

工作实例5

使用与工作实例1中相同的方法，但是用胆碱缺乏的、l-氨基酸定义的(cdaa)饮食喂养的大鼠代替oletf大鼠作为nash模型动物，并且用胆碱补充的、l-氨基酸定义的(csaa)饮食喂养的大鼠代替leto大鼠作为阴性对照组，在媒介物给予组(蒸馏水)、给予组和组合给予组中评估治疗作用。

同样地在其他nash模型中，与工作实例1中的情况一样，预期预防和治疗nash的出色的作用。

工作实例6

(方法)

使用喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(mcd)饮食的小鼠作为鼠nash模型，通过以下方法评估0.5％羧甲基纤维素(cmc)溶液(媒介物给予组)，以及奥贝胆酸(fxr激动剂)和氯沙坦(arb)(给予组，组合给予组)的治疗作用。

[使用的动物]

雄性c57bl/6j小鼠(n＝50-70)

[使用的药物]

将奥贝胆酸(获得自interceptpharmaceuticals有限公司，经由住友制药有限公司(sumitomodainipponpharmaco.,ltd.))用作fxr激动剂，并将商业氯沙坦(氯沙坦的钾盐；在该工作实例中简称为“氯沙坦”)用作arb。

[给予剂量，给予期]

通过强制口服给予来给予奥贝胆酸(3-30mg/kg/天)和/或氯沙坦(0.1-30mg/kg/天)；所有情况的给予期均为1至6周。

[实验方法]

在对6周龄至12周龄的c57bl/6j小鼠喂食mcd饮食0至5周后，将它们随机分成4组(g2、g3、g4、g5)(每组n＝10)。以相同的方式，给予6周龄至12周龄的c57bl/6j小鼠(n＝10)普通饲料，并将其作为组g1。从mcd饮食开始当天、或在开始3-5周后开始，通过强制连续口服给予来向组g3小鼠和组g4小鼠每天分别给予奥贝胆酸(3-30mg/kg/天)和氯沙坦(0.1-30mg/kg/天)，持续1-3周。以相同的方式向组g5小鼠每天给予奥贝胆酸(3-30mg/kg/天)和氯沙坦(0.1-30mg/kg/天)的组合给予，持续1-6周。向g1组(普通饲料组)和g2组(mcd组)中的小鼠给予0.5％cmc溶液作为媒介物代替药物，并分别作为阴性对照组和阳性对照组(使用与药物组相同的给予方法)。

[组织学分析]

为了评估肝纤维化的进展，从完成上述测试并经天狼星红染色的小鼠中采集福尔马林固定的石蜡包埋的肝脏切片(宽度为5μm)。采集和收集这些经染色的切片的显微照片(在所有小鼠中，每个样品收集多个视野的显微图像)，并比较各组的显微照片。为了定量各组中纤维化的进展，使用分析软件对所收集的经染色的标本的图像的组织学特征进行半定量分析。此外，将肝脏样本(宽度为5μm)用油红o染色，以相同的方式采集和收集经染色的切片的显微照片，并比较这些组之间的图像。为了定量各组中脂肪组织变性进展的程度，使用分析软件对所收集的经染色的标本的图像的组织学特征进行半定量分析。可替代地，使用半定量逆转录酶聚合酶链反应(rt-pcr)方法，使用从肝脏提取的mrna来测量纤维化因子。同样地在其他nash模型中，与工作实例1、4和5中的情况一样，预期预防和治疗nash的出色的作用。

工作实例7

nash的公认的病理诊断标准是“观察到除大液滴肝脂肪变性外还伴有炎症的肝细胞气球样”。matteoni等人对患有nafld的患者进行了长期随访研究，根据病理结果将疾病分为4种类型(1型：单独脂肪肝，2型：脂肪堆积加炎性细胞浸润，3型：脂肪堆积加上气球样肝细胞变性，4型：脂肪堆积/气球样肝细胞变性加mallory-denk小体或纤维化)。它们的结果显示，与1型和2型相比，患有3型和4型的患者中进展至肝硬化和肝脏疾病相关的死亡的频率更显著，这指示病理分类具有重要的临床意义。为了降低个体观察者和机构之间的差异，非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络(nonalcoholicsteatohepatitisclinicalresearchnetwork)提出了一种病理诊断评分系统，其中对脂肪变性、炎症和肝细胞气球样的程度进行评分(nas：nafld活性评分)(matteonica,younossizm,gramlicht,boparain,liuyc,mcculloughaj:nonalcoholicfattyliverdisease:aspectrumofclinicalandpathologicalseverity.[非酒精性脂肪性肝脏疾病：一系列临床和病理严重程度]gastroenterology[胃肠病学],116；1413-1419,1999)。使用以下动物模型来评估构成nash评分的病理诊断标准，并研究fxr激动剂(奥贝胆酸)和arb(氯沙坦)的个体和组合作用。

(方法)

使用喂食具有减少的蛋氨酸的胆碱缺乏的、氨基酸定义的、高脂肪饮食(cdahfd)的小鼠作为鼠nash模型，通过以下方法评估0.5％甲基纤维素(mc)溶液(媒介物给予组)，以及奥贝胆酸(fxr激动剂)和氯沙坦(arb)(给予组，组合给予组)的治疗作用。

[使用的动物]

雄性c57bl/6j小鼠(n＝49)

[使用的药物]

将奥贝胆酸(获得自interceptpharmaceuticals有限公司，经由住友制药有限公司(sumitomodainipponpharmaco.,ltd.))用作fxr激动剂，并将商业氯沙坦(氯沙坦的钾盐；在该工作实例中简称为“氯沙坦”)用作arb。

[给予剂量，给予期]

通过强制口服给予来给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和/或氯沙坦(30mg/kg/天)；总给予期为3周。

[实验方法]

在对6周龄的c57bl/6j小鼠喂食cdahfd持续0至2.5周后，将它们随机分成4组(g2、g3、g4、g5)(每组n＝10)。以相同的方式，给予6周龄的c57bl/6j小鼠(n＝13)普通饲料，并将其作为组g1。在cdahfd开始后2.5周开始，通过强制连续口服给予来向组g3小鼠和组g4小鼠每天分别给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)，持续3周。以相同的方式向组g5小鼠每天给予奥贝胆酸(30mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)的组合给予，持续3周。向g1组(普通饲料组)和g2组(cdahfd组)中的小鼠给予0.5％mc溶液作为媒介物代替药物，并分别作为阴性对照组和阳性对照组(使用与药物组相同的给予方法)。

[组织学分析]

为了评估肝纤维化的进展，从完成上述测试并经苏木精和伊红染色的小鼠中采集福尔马林固定的石蜡包埋的肝脏切片(宽度为3μm)。采集和收集这些经染色的切片的显微照片(在所有小鼠中，每个样品收集多个视野的显微图像)，并比较各组的显微照片。为了定量各组中nas的程度，使用分析软件对所收集的经染色的标本的图像的组织学特征进行半定量分析。关于肝细胞肿胀(肿胀至正常肝细胞直径的约1.5倍或更多倍)(类似于肝细胞脂肪变性和气球样的指示物)，对病变占据的面积比进行分级。关于炎症，对每单位面积的含有5个或更多个炎性细胞的凝聚灶的数量进行分级。这些等级的总数被定义为nas。

(结果)

图15显示了在喂食cdahfd的小鼠的nash模型中，给予对改善肝细胞肿胀的作用的研究结果。该图的纵轴显示不同给予组(g3、g4、g5)的肝细胞肿胀的阳性面积率(肝细胞肿胀改善率：％)，取阴性对照组(g1)和阳性对照组对照组(g2)的差异为100％。在奥贝胆酸单一疗法组(g3)中，阳性对照组(g2)中肝细胞肿胀显著增加趋于受到抑制。氯沙坦单一疗法组(g4)显示没有任何改善趋势。此外，出人意料的是，在给予奥贝胆酸和氯沙坦的组合的组(g5)中，肝细胞肿胀得到改善，其中观察到统计学显著的差异。与各自的单一疗法组(g3，g4)相比，组合给予组(g5)中的这种作用非常突出，并且这可以说是构成了意想不到的协同作用。肝细胞肿胀阳性面积率的改善仅在g5组中显示出统计学显著差异(p<0.01；非参数dunnett测试)。该结果表明，与用单独药剂的单一疗法相比，组合给予的改善肝细胞肿胀的作用是极其突出的和协同的，其中这种作用在数量上和统计学两者上都是显著的。

具体在g5组中的肝细胞脂肪变性和nash中观察到改善作用，这与肝细胞肿胀的评估的情况一样。

工作实例8

根据2015年的nash/nafld实践指南(japansocietyofhepatology[日本肝脏病学学会],nash/nafldpracticeguideline2015[nash/nafld实践指南2015].tokyo[东京]:bunkodo[文宏堂]；2015)，nash诊断筛查的重要因素是脂肪肝和异常alt(丙氨酸氨基转移酶)值的腹部超声诊断。通过肝活检证实了nash的诊断，其中控制肥胖症/高血压/脂质异常是基本标准之一，并且转氨酶(氨基转移酶)的持续高值也是显著的。此外，nash显示出具有高alt水平的患者进展迅速的趋势。另一方面，根据pivens研究，该研究检查了患有nash的患者中维生素e的功效和安全性，将其中alt减少至40iu/l或更低、或其中alt比基线降低30％或更多的情况作为alt应答者，与维生素e组中的alt无应答者相比，发现nash在alt应答者中显著改善，其中安慰剂组中的nash没有改善，并且还报道了纤维化中的显著改善(hoofnaglejh,vannattaml,kleinerde,clarkjm,kowdleykv,loombar,等人vitamineandchangesinserumalanineaminotransferaselevelsinpatientswithnon-alcoholicsteatohepatitis[维生素e与患有非酒精性脂肪性肝炎患者中血清丙氨酸氨基转移酶水平的变化].alimentpharmacolther.[营养药理学与治疗学]2013年7月；38(2):134-43)。基于上述发现，由于alt被认为是nash进展中的重要预后因素，因此预期改善alt水平的治疗可以减轻nash的病理。因此，使用下述alt降低的动物模型进行评估，并且研究了单一疗法、以及fxr激动剂(奥贝胆酸)与arb(氯沙坦)的组合给予的作用。

(方法)

使用与工作实例7中相同的方法。

[使用的动物]

雄性c57bl/6j小鼠(n＝50)

[使用的药物]

使用与工作实例7中相同的药物。

[给予剂量，给予期]

通过强制口服给予来给予奥贝胆酸(10mg/kg/天)和/或氯沙坦(30mg/kg/天)；总给予期为3周。

[实验方法]

在对6周龄的c57bl/6j小鼠喂食cdahfd持续0-6周后，将它们随机分成4组(g2、g3、g4、g5)(每组n＝10)。以相同的方式，给予6周龄的c57bl/6j小鼠(n＝10)普通饲料，并将其作为组g1。在cdahfd开始后6周开始，通过强制连续口服给予来向组g3小鼠和组g4小鼠每天分别给予奥贝胆酸(10mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)，持续3周。以相同的方式向组g5小鼠每天给予奥贝胆酸(10mg/kg/天)和氯沙坦(30mg/kg/天)的组合给予，持续3周。向g1组(普通饲料组)和g2组(cdahfd组)中的小鼠给予0.5％cmc溶液作为媒介物代替药物，并分别作为阴性对照组和阳性对照组(使用与药物组相同的给予方法)。

[生化测试]

为了评估血清丙氨酸氨基转移酶(alt)活性，从已经完成上述测试的小鼠中采集血液样品，并分离血清。使用药物产品进行体外诊断，对血清样品中的alt活性进行酶法测量。

(结果)

图16显示了在放置于cdahfd中的动物的nash模型中，药物给予对改善alt活性的作用的研究结果。

图16显示了基于阳性对照组(g2)中的平均alt活性，药物给予组(g3、g4、g5)中alt活性的变化(δu/l；负值指示改善)。与阴性对照组(g1)相比，在阳性对照组(g2)中alt活性显示出统计学显著的增加，而在奥贝胆酸单一疗法组(g3)和氯沙坦单一疗法组(g4)中，只有一种改善的趋势，其中没有观察到统计学显著的改善。出人意料的是，给予奥贝胆酸和氯沙坦两者的组合给予的组(g5)显示出alt活性改善的统计学显著差异。与各自的单一疗法组(g3，g4)相比，组合给予组(g5)中的这种作用非常突出，并且这可以说是构成了意想不到的协同作用。

为了改善alt活性，仅在g5组中观察到统计学显著的差异(p<0.01；非参数dunnett测试)。该结果表明，与用单独药剂的单一疗法相比，组合给予的减轻肝损伤的作用是极其突出的和协同的，其中这种作用在数量上和统计学两者上都是显著的。

工作实例9

使用奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦代替氯沙坦作为arb，根据与工作实例1、2和4-8中相同的方法，在媒介物给予组(蒸馏水)、给予组和组合给予组中评估治疗作用。此外，使用奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用替米沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦代替氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦作为arb，根据与工作实例3中相同的方法，证实fxr激动剂和arb的组合作用。

目前，预期奥贝胆酸和arb的组合(如奥贝胆酸和氯沙坦的组合)具有预防和治疗nash的出色的作用。

工作实例10

使用鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452代替奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用氯沙坦作为arb，并且根据与工作实例1、2和4-8中相同的方法，在媒介物给予组(蒸馏水)、给予组和组合给予组中评估治疗作用。此外，使用鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452代替奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用氯沙坦作为arb，根据与工作实例3中相同的方法，证实fxr激动剂和arb的组合作用。

预期其他fxr激动剂和氯沙坦的组合(如奥贝胆酸和氯沙坦的组合)也具有预防和治疗nash的出色的作用。

工作实例11

使用鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452代替奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用氯沙坦作为arb，根据与工作实例1、2、和4-8中相同的方法，在媒介物给予组(蒸馏水)、给予组和组合给予组中评估坎地沙坦、替米沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦的治疗作用。此外，使用鹅脱氧胆酸、int-767、ly-2562175、px-104或ljn-452代替奥贝胆酸作为fxr激动剂，并使用替米沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦代替氯沙坦、缬沙坦或坎地沙坦作为arb，根据与工作实例3中相同的方法，证实fxr激动剂和arb的组合作用。

预期其他fxr激动剂和arb的组合(如奥贝胆酸和氯沙坦的组合)也具有预防和治疗nash的出色的作用。

工业实用性

本发明的组合药物试剂可用于预防和/或治疗肝脏疾病，具体是nash。此外，它可用于所有肝脏疾病，具体是在nash中预防、抑制和/或减轻肝纤维化。