治疗炎性肠病的方法和组合物与流程

炎性肠病(ibd)由两种独立的疾病：克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)组成，影响833000名美国人。

cd可以沿着消化道(口腔到肛门)的任何地方表现并经常影响消化道壁的整个厚度，而uc被限制在结肠和直肠，并且只影响壁的粘膜(内衬)。

医学治疗(包括使用可能具有重度副作用的消炎药)可能无法治疗uc的症状，并且当患者对于所有其他医学治疗都难治时，完全去除结肠(结肠切除术)是uc的唯一已知的“治愈方法”。结肠切除术是一种建立良好的大型手术，通常需要回肠造口以促进废物去除。

对于治疗和治愈ibd(包括uc)，需要对一线治疗(具有可能有害副作用的药物)和二线治疗(结肠切除术)的替代方案。

倾向微创外科手术程序的趋势促进了对组织再生有用的人工支架的发展。纯化的胶原蛋白、明胶、自体脂肪、透明质酸和合成材料已经在临床上用作再生医学中的可注射支架以用于尿失禁、反流疾病、喉部病变和新生儿心肌细胞的治疗。然而，过度纯化、化学修饰或合成的材料可导致宿主的不良免疫应答并限制细胞向基质中的迁移。

天然存在的胞外基质(ecm)衍生的支架具有许多生物活性特性，并已用于包括下泌尿道结构、食道、心脏组织和肌腱结构(musculotendonousstructures)的各种组织的修复。然而，这些支架中许多衍生自非人组织，并且没有被描述用于下肠道组织(例如结肠组织)的治疗或再生，并且没有特别用于治疗uc。

技术实现要素：

本发明涉及一种用于通过替代患病或受损的粘膜组织而无需结肠切除术来治疗uc的新的组织移植物和方法。

在一种实施方式中，本发明的方法包括通过以下步骤治疗受损或患病的下肠道组织：(1)任选地在患病或受损的结肠粘膜内衬上进行粘膜切除术，以及(2)在具有结肠粘膜内衬的疾病或损伤的症状或患有结肠粘膜内衬的疾病或损伤的患者中用干细胞或祖细胞接种结肠粘膜内衬，或刺激干细胞或祖细胞迁移到患病或受损的结肠组织。结肠粘膜内衬的疾病可以是炎性肠病(ibd)，并且该方法可以用于治疗、改善或治愈ibd。

因此，本发明可以包括通过干细胞或祖细胞直接递送到受损或患病的结肠组织来接种干细胞或祖细胞，例如，其中干细胞或祖细胞在流体组合物(例如溶液、悬浮液或凝胶)中被制备，用于通过注射或输注到结肠腔内而递送到结肠组织，使得干细胞或祖细胞接触并至少暂时停留在结肠的腔壁上，以便起始或刺激结肠粘膜内衬的重建组织重塑。因此，本发明的方法可以影响新的健康结肠组织对受损或患病的结肠组织的替代。

可供选择地，干细胞或祖细胞可以通过将胞外基质(ecm)组合物，例如固体(片或管)或流体(溶液、悬浮液或凝胶)形式的ecm移植物或支架引入到结肠腔壁上或与结肠腔壁接触而被刺激到受损或患病的结肠组织的部位。

在本发明的另一种实施方式中，干细胞或祖细胞可以被掺入到固体或流体ecm组合物中，并且包含干细胞或祖细胞的ecm组合物可以通过适合于如上所述的组合物的递送方式递送至结肠粘膜内衬。例如，可以将固体ecm通过内窥镜植入结肠内衬，或者可以将流体ecm输注、注射或喷雾到结肠中。

一旦接种或迁移到受损的结肠组织的部位，所述干细胞或祖细胞特化、原位发育，并替代结肠粘膜内衬。该方法还可以包括以下附加步骤中的一个或多个：(3)创建回肠造口，以及(4)通过静脉内喂养患者，绕过消化道向患者提供全胃肠外营养(tpn)，同时新粘膜形成并替代患病的粘膜内衬。

当用作本发明的方法的一部分时，在植入、移植或施用移植物之前去除患病或受损组织的粘膜切除术步骤可以通过组织切除或消融进行。

切除或消融方法包括内窥镜或外科粘膜切除术(切除)、内窥镜激光疗法、光动力疗法、使用氩等离子体凝固的内窥镜热凝、射频消融术、冷冻消融术、或使用edta或其它消融剂。本领域中充分记载了这些粘膜切除术程序。上述技术或程序中的任何一种或多种可用于采用切除或消融步骤的本发明的方法中。

本发明还包括用于使用来源于与待治疗组织相同的组织的组织移植物(例如胞外基质(ecm)支架)治疗患病或创伤损伤(trauma-damaged)的组织的方法和组合物。包含来自与待治疗组织相同的组织的ecm的组织移植物在本文中被称为“组织特异性胞外基质”(ts-ecm)。

优选的ts-ecm不仅来源于相同类型的组织(即用于结肠组织治疗的来源于结肠的ecm)，而且也来源于与待治疗的物种相同的物种。例如，人uc的治疗将使用人结肠粘膜组织作为ts-ecm支架组合物。组织移植物可以是同种异体移植物或异种移植物。ecm和细胞之间可以存在刺激和信息的相互交换(在本领域中称为“动态互惠(dynamicreciprocity)”)，这为使用ecm移植物提供了优势。通过使用ts-ecm移植物可以促进或改善这种动态互惠。

因此，本发明包括但不限于来源于大肠组织的用于替代患病或受损大肠组织的组织移植物组合物。来源于大肠组织的ecm可优选包含结肠粘膜，并且经处理的大肠或结肠组织可优选为结肠粘膜。

在一种实施方式中，该组织移植物组合物可以是形成为固体片或管的ecm支架，所述固体片材或管可以放置或固定在结肠黏膜上。固体片或管支架可以被植入或移植，或者如本领域所公认地通过机械或外科手段(包括但不限于缝合线、短钉(staples)、内支架(stents)或夹子)在期望的患者部位处贴附、施加或附接，或者可以通过包括生物粘合剂的可接受的粘合剂(例如药学上可接受的或治疗上可接受的粘合剂)粘附到粘膜上。将ecm组合物递送至结肠的一种优选方法可以使用内窥镜，其可以有利地使侵入性外科手术程序最少化。

可供选择地，ecm可以被制成粉末或消化，以及溶解或悬浮而以流体(例如凝胶、溶液或悬浮液)的形式呈现。通过将凝胶、溶液或悬浮液向待治疗的部位注射、输注、喷雾等，可有利地施用流体组合物。例如，流化的ecm可以通过注射、输注或喷雾到结肠腔中(例如作为灌肠疗法)来施用或应用，由此流体ecm包覆结肠粘膜内衬，或者在已切除粘膜的结肠的情况下，包覆在结肠外露的管腔壁上。这种施用可以重复几次，包括一天一次或多次并持续几天、几周或几个月，最多约一年，如治疗医师监测活的或健康组织的可接受的再生长或替代依照期望所确定的。

流化ecm的可喷雾凝胶、溶液或悬浮液的一种优选的实施方式是通过喷雾来雾化用于施用的组合物。雾化的喷雾可以从源储存器通过套管或其他导管泵送，所述插管或其他导管设置在制造或修改以将这种流化ecm到期望的部位或位置的内窥镜中或与这种内窥镜一起提供。

有利的是，已知干细胞或祖细胞迁移到ecm放置或施用的部位，并且随着时间，可以用具有那些细胞或组织的正常属性和功能的健康或无症状的细胞和组织来替代组织。因此，本发明的组合物的替代实施方式包括单独的固体ecm管或片支架；用干细胞或祖细胞包覆或包埋的固体ecm支架；单独的流化ecm(例如凝胶)；或另外包含流化ecm的固体ecm支架，所述固体ecm支架具有或不具有用固体或流体ecm包覆、包埋或与固体或流体ecm混合的干细胞或祖细胞。

还将理解的是，ecm组合物可以是杂交体(hybrid)，其部分地来源于天然组织并且与合成或天然聚合物混合或组合。优选但不要求的是，可生物降解的聚合物用于包含合成或天然聚合物的本发明的ecm组合物中。

在本发明的另一种实施方式中，例如固体片或管的ecm组合物可以通过使用三维(3-d)打印机技术形成或生产。

该组合物可以进一步包含添加到ecm中用于实现特别期望的属性的添加剂。例如，ecm组合物可包含一种或多种药物或生物制品，例如抗生素、抗炎药、免疫抑制剂、单克隆抗体、生长因子等，提供所添加的药物或生物制品的所期望活性。这些添加剂可以使局部环境有利于有利的组织重塑。组合物的其他添加剂可包括例如粘度增强剂，或可引发或延迟凝胶形成的试剂。本领域普遍接受的是，较高粘度的凝胶可以提供凝胶的改善的粘附性和韧性。因此，粘度增强剂也可用于促进与靶组织的粘附。粘合促进剂是本领域中熟知的，但可以进一步包含血液成分(例如凝血剂或凝血因子)作为粘度增强剂或粘附增强剂。

作为本发明的一部分，还包括使用如本文所描述的ecm移植物或支架治疗患病或受损的结肠组织而无需事先切除或消融的方法。例如，在组织的疾病或损伤产生病变或组织伤害(例如组织表面暴露或出血)的情况下，在植入、移植、应用或施用ecm支架或移植物组合物之前进行的切除组织可以省略。因此，本发明的方法的一种实施方式包括以下步骤：

a)使用选自肠、生殖、皮肤、胰腺、肾、循环和呼吸组织的组织制备ecm支架、移植物或组合物，以及

b)将ecm移植物或支架组合物植入、移植、应用或施用于患者的组织上，所述患者患有影响下肠道组织的疾病或病症，所述患者患有影响肠道组织的疾病、损伤或病症，其中在植入、移植、应用或施用ecm组合物之前，肠组织不进行切除或消融。

在一种优选的实施方式中，该方法包括治疗表现出ibd(例如溃疡性结肠炎或克罗恩病；家族性腺瘤性息肉病；先天性巨结肠症；狭窄(stricture)；直肠炎；结肠癌；直肠粘膜炎或瘘管)的受损或患病的结肠组织，更优选地，治疗结肠粘膜组织的疾病或损伤。

本发明的另一种实施方式是使用如本文描述的组织特异性ecm(ts-ecm)支架治疗患病或受损的组织而事先进行或不进行切除或消融的方法。因此，本发明的方法的一种实施方式包括以下步骤：

a.任选地对受损或患病的组织进行粘膜切除术；

b.使用选自肠、生殖(除阴道外)、皮肤、胰腺、肾、循环和呼吸组织的组织制备ts-ecm移植物或支架组合物，以及

c.将ts-ecm支架或组合物植入、移植或施用在患有影响相同肠、生殖(除阴道外)、皮肤、胰腺、肾、循环和呼吸组织的疾病或病症的患者的组织上。

将理解的是，本发明的ecm或ts-ecm移植物、支架或组合物可以是生物相容的多孔、大孔或微孔基质，其中干细胞或ecm凝胶、溶液或悬浮液可以是分散的。此外，本发明的ecm或ts-ecm可以是凝胶化的。

本领域中描述了用于制备对于用作移植物的细胞生长基质或支架有用的管、片和凝胶化且溶解的ecm组合物的方法。凝胶ecm组合物可在植入前模塑或在组合物原位凝胶化的位置处凝胶化之前以非凝胶形式施用于患者。这些以及形成ecm移植物的其他方法描述于例如美国专利第8,361,503号中，其通过引用整体并入。

在优选的实施方式中，凝胶ecm组合物根据如描述的一个或多个过程来制备。例如，凝胶ecm可以通过包括以下的方法制备：

i)粉碎固体形式的ecm，

ii)通过在酸性溶液中用酸性蛋白酶消化来溶解完整的、未透析的或非交联的ecm，以产生消化溶液，

iii)将消化溶液的ph调节至7.2至7.8之间以产生中和的消化溶液，以及

iv)在高于25℃的温度下使溶液凝胶化。

在一种实施方式中，ecm组合物的制备可包括进一步处理通过步骤(ii)产生的溶解的ecm，其中将溶解的ecm干燥或冻干以形成可比液体形式的溶解的ecm储存时间更长的干粉。然后可以将干粉ecm在水溶液或缓冲液中重构，并使其达到如上文步骤(iii)的中性ph。

在另一种实施方式中，制备ecm移植物或支架组合物的方法进一步包括超声处理支架。本发明的进一步的方法包括将ts-ecm支架连接至患者的组织，其中支架的表面包含嵌入或包覆有患者细胞(例如干细胞)的凝胶化、溶解的ecm，其中在将支架植入、移植或施用于组织之前，嵌入或包覆的细胞被允许有足够的时间使患者的细胞向内生长进入支架。

在实施本发明的方法中，如本文所述或制备ecm的其它已知方法制备支架或移植物，然后将其植入、移植或施用于患病或受损的组织的至少一部分，并使其与患病或受损组织保持接触足够的时间，以使替代细胞生长并替代患病或受损的细胞。足够的时间可以是一天到大约六个月。

有利的是，ecm移植物的植入、移植或施用提供了使干细胞向ecm移植物的植入、移植或施用部位迁移的刺激。例如，在治疗uc时，ecm移植物被植入、移植或施用以与结肠的至少一部分接触，其中患病或受损的结肠粘膜曾保持(在粘膜切除术后的情况下)或保持(在没有进行粘膜切除术的情况下)与粘膜接触一段时间以使得结肠粘膜细胞生长和替代，导致患病或受损细胞被健康细胞替代。ecm移植物可以以同时或依次植入、移植或施用于结肠内壁的相对短的固体片段(约1至10厘米)提供。可供选择地，可以制备具有对应于整个结肠的多个部分或长度的ecm移植物。

在可以在接受放射或化疗的患者中出现的非自身免疫相关的疾病或病症(例如直肠粘膜炎)的治疗或预防中，胞外基质(ecm)，或胞外基质水凝胶(ecmh，即液体或流体、可胶凝形式的ecm)也可以是有用的。例如，ecmh治疗(例如在放射或化疗治疗启动之前通过灌肠施用ecmh，并且在这种放射或化学疗法的整个过程中持续施用ecmh)可以预防患者直肠粘膜炎的发作。

将理解的是，可以使用不同的施用方案施用ecmh，所述施用方案取决于患者的需要与由医师或其他看护者的确定。例如，ecmh施用可以在放射或化疗开始后启动，其中医师或护理人员可以监测对ecmh施用的需要并针对这种ecmh治疗的需要评估直肠粘膜的状况。

用于施用ecmh的给药方案还可以取决于患者的需要和状况。例如，患者可以每天接受一次或多次ecmh施用(例如每天多达四次)，或者可以接受每日使用ecmh灌肠。可供选择地，患者可以每周接受一至五次ecmh施用，优选每周三至五次，每隔一天或每两天接受一次。根据主治医师或专科医生的判断，可以向患者提供治疗或给药方案长达约8至12周或更长时间。

附图说明

图1示出了如本文所述的从小肠粘膜下层胞外基质(sis-ecm)治疗的狗中去除的结肠切片(下图)的结果。显微照片(上图a-d)示出了结肠切片的沿远端到近端的梯度的显微细胞检查，说明了沿梯度粘膜覆盖增加，也就是说，在远端吻合(a)处看到不完整的粘膜覆盖，而朝向近端(b)、(c)和(d)呈现，粘膜覆盖增加。

图2示出了如实施例3中描述的大鼠研究设计和测量的示意图。

图3示出了实施例3中描述的大鼠研究的标准确定表：表1示出了临床症状评分标准；表2示出了结肠样品的大体解剖学评分标准；表3示出了结肠样品的组织学评分标准。

图4示出了支持所用的dss模型的验证的数据，即在饮用水中使用5％dss诱导疾病状态。图4a是每天体重减轻的图；图4b是每天粪便血液评分的图；图3c是每天粪便稠度的图；图4d是dss处理的大鼠与无dss处理的大鼠相比的结肠长度的图；和图4e是dss处理的大鼠与无dss处理的大鼠相比的tritc浓度的图。

图5示出了如实施例3中描述的大鼠结肠的组织学结果，说明ecmh治疗降低了组织学评分：图5a-图5d示出了ecmh处理的大鼠与溶媒处理的假手术对照大鼠或健康大鼠相比的远端和近端结肠切片的炎症评分；图5e-图5h显示了ecmh处理的大鼠与溶媒处理的假手术对照大鼠或健康大鼠对比的远端和近端结肠切片的溃疡评分。

图6示出了结肠粘膜的组织再生，说明来自ecmh处理的大鼠与溶媒假手术对照或健康大鼠对比的结肠中的溃疡和炎症。

图7示出了疾病结果的临床症状，说明ecmh治疗降低了疾病活动性：图7a显示了每天的体重评分；图7b显示了每天的粪便血液评分；图7c显示了每天的粪便稠度评分；图7d显示了ecmh处理的大鼠与溶媒处理的假手术大鼠和健康大鼠的结肠对比的结肠长度；图7e显示了ecmh处理的大鼠结肠与溶媒处理的假手术大鼠的结肠对比的疾病状态总评分的图。

图8是说明ecmh处理的大鼠与溶媒处理的假手术大鼠和健康(未处理的)大鼠对比，ecmh处理减少了tnfα+巨噬细胞的图示。

图9示出了ecmh处理的大鼠与溶媒处理的大鼠和健康(未处理的)大鼠对比的巨噬细胞总数的图。

图10示出了来自免疫标记了来自ecmh处理的大鼠、载体处理的假手术大鼠与健康大鼠对比的巨噬细胞表型标记的组织切片的代表性图像。

图11示出了炎症测量的图示，说明ecmh介导炎症。图11a示出了ecmh处理与溶媒处理和nt(未处理)对比中固有层单核细胞(lpmc)分泌的tnfα浓度；图11b示出了ecmh处理与溶媒处理和nt对比中lpmc分泌的pge2浓度；图11c示出了来自用ecmh处理的大鼠结肠与溶媒处理的大鼠大肠和健康大鼠的器官型培养物的分泌的pge2水平。

图12以图表和照片的方式示出了ecmh的粘膜粘附，其中：图12a是胃蛋白酶处理的大鼠结肠与4mg/ml、8mg/ml和12mg/ml浓度的ecmh处理的大鼠结肠对比的拉伸粘附强度图；图12b示出了健康大鼠结肠与患病大鼠结肠的拉伸强度图；图12c示出了在施用¹⁴c-标记的ecmh后2小时、12小时和24小时保留的ecmh百分比；图12d是在施用ecmh后1小时、2小时、12小时和24小时存在于结肠中的fitc标记的ecmh的照片表示。

图13示出了屏障功能通过施用ecmh恢复：图13a是ecmh处理的大鼠与溶媒处理的假手术大鼠和健康大鼠对比的tritc浓度的图示。图13b是ecmh处理的细胞培养物与lps+ecmh处理的细胞培养物、仅lps处理的细胞培养物和nt细胞培养物对比的teer的相对变化的图示。图13c是lps+ecmh处理的大鼠与仅lps处理的大鼠和nt大鼠对比的e-cad细胞百分比的图示。图13d显示了健康的细胞培养物、lps损伤的细胞培养物与lps+ecmh处理的细胞培养物对比的细胞的照片表示。

具体实施方式

本发明涉及通过替代或刺激患病或受损粘膜细胞和组织的替代而不进行结肠切除术来治疗炎性肠病(ibd)，例如溃疡性结肠炎(uc)或克罗恩病(cd)等。

在一种实施方式中，本发明的方法包括通过以下步骤对受损或患病的下肠道组织的治疗：(1)任选地在患病或受损的结肠粘膜内衬上进行粘膜切除术，以及(2)在具有结肠粘膜内衬的疾病或损伤的症状或患有结肠粘膜内衬的疾病或损伤的患者中用干细胞或祖细胞接种结肠粘膜内衬，或刺激干细胞和祖细胞迁移到患病或受损的结肠组织。结肠粘膜内衬的疾病可以是炎性肠病(ibd)，并且该方法可以用于治疗、改善或治愈ibd。

因此，本发明可以包括通过将干细胞或祖细胞直接递送到受损或患病的结肠组织来接种干细胞或祖细胞，例如，其中干细胞或祖细胞在流体组合物(例如溶液、悬浮液或凝胶)中被制备，用于通过注射或输注到结肠腔内而递送到结肠组织，使得干细胞或祖细胞接触并至少暂时停留在结肠的腔壁上，以便起始或刺激结肠粘膜内衬的重建组织重塑。因此，本发明的方法可以影响新的健康结肠组织对受损或患病的结肠组织的替代。

可供选择地，干细胞或祖细胞可以通过将胞外基质(ecm)组合物，例如固体(片或管)或流体(溶液、悬浮液或凝胶)形式的ecm移植物或支架引入到结肠腔壁上或与结肠腔壁接触而被刺激到受损或患病的结肠组织的部位。

在本发明的另一种实施方式中，干细胞或祖细胞可以被掺入到固体或流体ecm组合物，并且包含干细胞或祖细胞的ecm组合物可以通过适合于如上所述的组合物的递送方式递送至结肠粘膜内衬。例如，可以将固体ecm通过内窥镜植入结肠内衬，或者可以将流体ecm输注、注射或喷雾到结肠中。

通过设计，ecm迅速原位分解，并且可以引起(encourage)炎性应答，包括巨噬细胞向该部位的迁移。ecm的一个独特特征是引起(encourage)这些巨噬细胞的表型从m1型(促炎性，例如在患有uc的患者中所见的)转变为m2型(促组织重塑，例如在没有潜在促炎症状的人中所见的)。这种m1至m2表型转换的重要分枝是使得原本易于发炎的组织保持健康。

在植入、移植或施用移植物之前进行以去除患病的或受损的组织(例如结肠的粘膜组织)的任选的粘膜切除术步骤可以使用任何通常接受的方法，例如组织切除或消融进行。已知的切除或消融方法包括内窥镜或外科粘膜切除术(切除)、内窥镜激光疗法、光动力疗法、使用氩等离子体凝固的内窥镜热凝、冷冻消融术、射频消融术或使用edta或其他消融剂的消融术。

用干细胞或祖细胞接种已切除粘膜的组织可以通过已知方法进行，例如在如在医学文献中描述的部位注射干细胞。参见，例如，lanzoni,g.,炎性肠病：向基于干细胞的疗法前行(inflammatoryboweldisease:movingtowardastemcell-basedtherapy),worldjgastroenterol.14(29):4616–4626(august7,2008)，其总结了造血干细胞和间充质干细胞在治疗ibd中的用途，但没有教导或暗示之前的粘膜切除术。

优选地，通过在所述部位处放置和/或固定(例如植入、移植或施用)胞外基质(ecm)材料或组合物作为ecm支架或移植物，可以将干细胞引导至已切除粘膜的组织。将ecm组合物引入至已切除粘膜的部位可以是固体片或管的形式，或者可以是流体的形式，例如溶液、悬浮液或凝胶。固体ecm材料的放置或固定可以通过缝合线、夹子、短钉、胶水或熟知的其他固定方式来实现。

可供选择地，流化ecm可以通过通常使用的流体施用或递送方法(例如注射、输注或弄湿(drench)(“喷射”到所述部位))或通过将流体喷雾到所述部位来施用。优选的喷雾技术使用雾化的ecm流体进行，例如通过内窥镜递送。

如本文所使用的，术语“组合物”、“材料”、“支架”和“移植物”是指ecm，可以互换使用，并且不意味着特定的配置，例如以固体、液体、液体或其他形式。例如，“ecm支架”可以是固体或流体。

优选地，流化ecm组合物形成为凝胶，使得其具有粘性的性质，并且具有足够使流体自粘附到身体内期望位置的粘度。在优选的实施方式中，流化的ecm是在应用或施用时具有相对非粘性液体性质的水凝胶，其有利地变稠或变得更粘，从而在施用或应用部位处接触身体时或接触身体之后不久形成粘性凝胶。在施用后可通过升高温度(例如体热)引发凝胶化。流体ecm还可以与单独的粘性剂(例如水凝胶或其他通常已知的胶凝剂)混合，以提供足够的粘度。可供选择地，可以施用两种流体，由此至少一种流体含有ecm材料，并且其中两种流体在彼此接触时或在混合时凝胶化。

公认的是，当存在足够的组织血管形成，并且血管为细胞提供迁移到所述部位的适当管道时，ecm组合物可引起干细胞迁移到所述部位。另外，ecm通过化学信号传导与相邻或其下的组织通信，并且相邻或其下的组织通过被称为“动态互换”的现象与ecm通信，该现象优化了使用ecm处的细胞和组织替代或再生。因此，ecm组合物可用作固体、液体或凝胶支架，以用于在放置、施用或应用部位的新细胞和组织生长。

在进一步的实施方式中，ecm来源的组合物可以是组织移植物，由此ecm组合物用作用于在植入物部位促进组织新生长的支架。支架可以是放置在所期望部位的ecm管或片。支架可以是生物相容的多孔、大孔或微孔基质，其中干细胞或ecm凝胶、溶液或悬浮液可以是分散的。随后在干细胞或ecm溶液或悬浮液分散后，ecm也可以是凝胶化的。

在一种实施方式中，ecm可以来源于本领域中通常使用的组织。例如，ecm来源于小肠粘膜下层(sis)或膀胱基质(ubm)组织。使用ubm的一种优选的实施方式是没有上皮基底膜层的ubm组织。

在更优选的实施方式中，已经发现，被称为“组织特异性胞外基质”或“ts-ecm”的来源于与待治疗的组织相同的组织类型的ecm可以提供有利的结果，例如可以通过动态互换发生的更有效或响应更敏捷的重建组织重塑。

因此，本发明还包括使用ts-ecm移植物治疗疾病损伤或创伤损伤的下肠道、生殖组织(除阴道外)、皮肤、胰腺、肾、循环或呼吸组织的方法和组合物。在一种实施方式中，ts-ecm来源于与待治疗物种相同的物种。例如，人体中uc的治疗将使用人结肠粘膜组织作为ts-ecm支架组合物。组织移植物可以是如上所述的自体移植物、同种异体移植物，或异种移植物。

在一种优选的实施方式中，本发明包括使用的方法和组合物，该组合物包含来源于大肠组织的用于替代患病或受损的大肠组织的组织移植物组合物。来源的大肠组织或治疗的大肠组织可以是结肠组织，并且可优选为结肠粘膜。

有利地，在引起开放或出血病变的组织疾病、损伤或病症中，例如在患有ibd(例如cd或uc)的患者中由结肠组织表现出来的那些，可以预期的是，可以通过包括植入、移植或施用ts-ecm的方法而无需之前的粘膜切除或消融步骤实现治疗或治愈。因此，在组织的疾病或损伤产生病变的情况下，例如组织表面暴露或出血，在此之前的组织切除可以省略。

如本文所使用的，术语植入(implanting/implantation)、移植(transplanting/transplantation)、应用(applying/application)、施用(administering/administration)、输注(infusing/infusion)、注射(injecting/injection)、递送(delivering/delivery)都是指方法或向治疗的部位提供ecm，并会被本领域普通技术人员理解为具有相同的含义，这取决于将ecm递送到所述部位所使用的组合物性质和程序。这些术语可以互换使用，并且决不限制本发明的方法。

因此，本发明的方法的一种实施方式包括以下步骤：

使用选自下肠道、生殖组织(除阴道外)、皮肤、胰腺、肾、循环和呼吸的组织制备ts-ecm支架，以及

将ts-ecm支架植入、移植或施用于患者的组织上，所述患者患有影响相同下肠道、生殖组织(除阴道外)、皮肤、胰腺、肾、下肠道、循环和呼吸组织的疾病或病症。

任选地，当治疗结肠时，该方法还可以包括以下附加步骤中的一个或多个：(3)创建回肠造口，以及(4)通过静脉内喂养患者，向患者提供全胃肠外营养(tpn)，同时新粘膜形成。

在一种优选的实施方式中，该方法包括治疗受损或患病的结肠组织。该方法可用于例如治疗由克罗恩病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病、先天性巨结肠症、狭窄、直肠炎、直肠粘膜炎或瘘管引起的结肠组织的损伤或疾病，更优选地，治疗结肠粘膜组织的疾病或损伤。

本领域中描述了制备作为细胞生长支架有用的管、片和凝胶化且溶解的ecm组合物的方法。凝胶ecm组合物可在植入前模塑或在组合物原位凝胶化的位置处凝胶化之前以非凝胶形式施用于患者。

这些以及形成ecm移植物的其他方法描述于例如美国专利第8,361,503号中，其通过引用整体并入。在优选的实施方式中，凝胶ecm组合物根据如描述的一种或多种方法来制备。例如，凝胶ecm可以通过包括以下的方法制备：

i.粉碎ecm，

ii.通过在酸性溶液中用酸性蛋白酶消化来溶解完整的、未透析的或非交联的ecm，以产生消化溶液，

iii.将消化溶液的ph调节至7.2至7.8之间以产生中和的消化溶液，以及

iv.在高于25℃的温度下使溶液凝胶化。

在另一种实施方式，制备ecm支架的方法还包括超声处理支架。在又另一种实施方式中，在步骤(ii)中使粉碎的ecm溶解之后，可以将溶解的ecm干燥成粉末形式。干燥可以通过本领域已知的冻干或其他干燥方法实现。与以液体、溶解形式储存相比，该干燥步骤可有利地为组合物提供更长的储存时间。当准备使用时，干燥的粉末形式可以用水溶液或缓冲液重构，并且可以在步骤(iii)中进行ph调节的过程(例如，ph的中和)并继续该过程。可供选择地，步骤(iii)的ph调节可在干燥过程之前进行。

本发明的进一步的方法包括将ts-ecm支架连接至患者的组织，其中支架表面包含嵌入或包覆有患者细胞(例如干细胞)的凝胶化且溶解的ecm，其中在将支架植入、移植或施用于组织之前，嵌入或涂覆的细胞被允许有足够的时间使患者的细胞向内生长进入支架。

在实施本发明的方法中，根据本文的描述制备支架移植物，然后将其植入、移植或施用于患病或受损的组织的至少一部分，并使其与患病或受损组织保持接触足够的时间，使得替代细胞生长并替代患病或受损的细胞。

根据患者对该治疗方法的反应，足够的时间可以是一天到数周或数月。一年治疗期而没有成功的组织重塑可以是继续这种治疗的上限。ecm材料在体内自然地生物降解，不需要去除。然而，ecmh意外且有利地在待治疗的病变上提供屏障层。该性质是出乎意料的，因为发现液体形式和所得凝胶的粘性或韧性或粘附特性中的一种或多种对抗从肠道中清除，即使待治疗的患者具有肠内蠕动运动或活动，或者摄入的液体通过肠道移动。

因此，ecmh在其停留在肠道内的过程中形成屏障层或保护层。ecmh的停留时间足够长以提供有效的组织愈合和修复，并且停留时间为约至少2小时，最多48小时。优选地，给药后ecmh的停留时间为约4至约24小时，更优选为约6小时至约12小时。

为了进行治疗uc的本发明的方法，ecm移植物被植入、移植或施用以与患病或受损的结肠的至少一部分接触，并且保持与粘膜接触一段时间以使得结肠粘膜细胞生长和替代，导致患病或受损细胞被替代为不表现出炎症或uc病变细胞的其他表现的健康粘膜细胞。

ecm移植物可被提供为被植入、移植或施用到结肠内壁的长度约为1-10厘米的相对短的管或片段。可供选择地，ecm移植物可包括对应于结肠整个长度的一种或多种长度。通过缝合、夹子、短钉、胶等可以将固体管或片ecm固定到待治疗的组织上。可供选择地，可以通过将液体溶液、悬浮液或凝胶组合物施用(例如喷雾)到待治疗的部位来治疗结肠组织。

在包括粘膜切除步骤的治疗uc的方法中，由于uc被限制在粘膜内，呈现uc症状的组织被去除。粘膜切除步骤可以在内窥镜下进行，避免了开腹或腹腔镜手术的需要。干细胞刺激步骤(通过引入ts-ecm移植物)使得在结肠腔中形成新的健康粘膜。可以对结肠的部分或较短段或更长长度的结肠进行粘膜切除术。

无论是在结肠的段或整个长度的结肠进行，本发明可提供消除了结肠切除术的需要并原位留下了自然直肠组织口(nativerectaltissuecuff)的益处，包括从增殖性(恶性)病变(例如uc或家族性息肉病)去除保留的直肠中的恶性可能性的益处；并使医疗保健专业人员留下更长的直肠乙状结肠段，其中具有以下功能性优势：

-减少伴随下解剖(lowerdissection)产生的括约肌破裂(尿失禁)或骶神经损伤(阳痿)的风险，以及

-改善存水功能，由于吸水增加和储存能力改善，使得排便习惯更正常；

-与结肠切除术或类似的程序例如ipaa(完全直肠结肠切除术伴随回肠吻合术)相比，提供相对简单和较少的侵入性；粘膜切除术是相当简单的程序，其可以从下面与穿透/回肠造口术同时进行或随后的任何时间进行。干细胞可以被“种植”并再生粘膜，而转移回肠造口术仍然存在。

-保留结肠避免了没有结肠的终生生活问题(例如，由于直肠储液容量减少导致的需要频繁排便而引起的结肠袋炎、肠梗阻、脱水、睡眠剥夺)；

-仅创建临时回肠造口(即直到新的粘膜可生存)；和

-它汇集了另外可能独立用于治疗ibd的各种学科(外科、医学、内窥镜和组织工程)。

要理解的是，各种方法和程序可以被用于通过基于导管的递送系统等在通过灌肠递送的肉汤中将干细胞递送至结肠，例如在支架上。有利地，ecm材料可以在与创建回肠造口时相同的外科手术过程中应用，并且可以允许粘膜在内部囊愈合时增殖或再生。

实施例1-外科手术放置固体ecm以替代结肠组织

将小肠粘膜下层胞外基质(sis-ecm)移植物移植到四(4)只活狗的结肠组织中。根据已知技术制备约3至4厘米长的sis-ecm移植物。制备具有不同层数的移植物，即2、4、6和8层的片或管，并在经肛周围粘膜切除术后进行测试。

将四(4)只健康成年杂种雌性狗(约20kg体重)进行周围结肠粘膜emr。在狗全身麻醉下，进行外科粘膜切除术。可供选择地，可以例如用治疗内窥镜(eg-3430，pentaxmedical，montvale，nj)和商业上可获得的试剂盒(emr试剂盒，olympusamerica，centervalley，pa)进行粘膜组织消融(例如emr)。顺序地进行逐个的粘膜切除，直至完成4cm的周围切除。

然后，将来源于猪小肠粘膜下层(sis)的管状ecm移植物或支架在内窥镜下经外科手术放置在四只狗体内。如前所述制备sis-ecm生物支架材料并配置成管状。简而言之，在死亡后立即从出售体重的猪(约110至130千克)收获猪sis。修剪残留的包括脂肪组织的外部结缔组织，并通过用自来水反复洗涤来去除所有残留的废物。将粘膜下层从小肠组织机械地脱层。然后将粘膜下层脱细胞并通过浸入0.1％(vol/vol)过氧乙酸、4％(vol/vol)乙醇和96％(vol/vol)去离子水中2小时进行消毒。

然后将sis-ecm材料用磷酸盐缓冲盐水溶液(ph7.4)洗涤两次各15分钟，并用去离子水洗涤两次各15分钟。制造管状支架以匹配犬结肠的解剖结构。简而言之，通过将水合的sis薄片缠绕在22mm的多孔管/心轴上来形成多层管，所述多孔管/心轴以总共几个完整的转数覆盖有脐带胶布带(umbilicaltape)(即多层管)。然后将构建体置于塑料袋中并连接至管线中带有冷凝阱的真空泵(型号d4b，leybold，export，pa)。

使构建体经受710至740mm汞柱的真空10至12小时，以去除水并形成紧密耦合的多层叠构造。在将每个ecm装置从心轴上取下后，用环氧乙烷对它们进行最终灭菌。

对于sis-ecm移植物的内窥镜放置，将管状支架在盐水溶液中水合5分钟，然后放置在30mm失弛缓症球(库克内窥镜失弛缓症球(cookendoscopyachalasiaballoon)，wilson-cookmedical，winston-salem，nc)。用两条4-0缝合丝线以可以在球囊充气时释放的外科结缝合sis-ecm装置。将0.035英寸的线(jagwire，bostonscientific，natick，ma)在内窥镜下放置在狗的结肠中。然后将球囊通过线并在内窥镜引导下定位，sis-ecm桥接粘膜切除的长度。

然后将1ml可降解的、赖氨酸衍生的尿烷(ldu)外科粘合剂(tissuglu，coheramedical，pittsburgh，pa)通过6f内窥镜引导导管注射到装置的两个对面上的两个独立条带中的结肠壁和sis-ecm之间以防止滑动。然后，将球手动充气至完全容量，使支架相对于结肠壁扩张。在放气和移除之前使球膨胀维持15分钟，将sis-ecm支架留在结肠内的适当位置。

手术后，使狗从麻醉中恢复、拔管，并在恢复室监视，直到它们处于胸骨位置舒适地休息。使狗保持在笼子中过夜并在术后第1天返回其较大的活动房屋。所有狗每天两次给予由头孢噻吩/头孢氨苄(35mg/kg)组成的口服预防性抗生素，持续7至9天。

根据镇痛的需要，在静脉内施用乙酰丙嗪(0.1mg/kg)和布托啡诺(0.05mg/kg)2天之后，每12小时候皮下或肌内施用丁丙诺啡(0.01至0.02mg/kg)。

所有的狗还每天给予奥美拉唑20mg。手术后36小时开始口服摄入。狗从提升/升高的平台喂养。计算每日营养需求并将其分成3份分开的饲料。在术后1周提供稀粥/软食，接着在随后的2周期间逐渐改变为固体食物。每周对狗进行称重并将其饲养在大约10-14英尺的活动中以允许其自由行走。

内窥镜检查是在术后1个月并在12周时进行安乐死前不久，以评估结肠粘膜的外观和狭窄。使用结肠镜检查和活组织检查收集来监测时间重塑响应。在第2、8、10或12周时处死动物。将外植体用苏木精和伊红(h&e)和阿尔新蓝染色，并对增殖细胞核抗原(pcna)进行免疫标记。外植体的大体分析表明，在仅进行粘膜切除术的狗中发生了狭窄形成，而ecm处理的狗没有发生狭窄。组织学显示ecm促进部位适当的杯状细胞和适当定位的pcna+增殖细胞的重塑。ecm处理的狗的粘膜几乎与天然组织无法区分，而仅进行粘膜切除术的狗没有显示出新的粘膜覆盖的迹象。

安乐死后，立即收获支架放置部位和支架放置部位近端和远端的自然结肠组织。将切下的片段纵向分开并检查暴露的粘膜表面并拍照以进行尺寸测量。在重塑部位的上缘附近3cm处和移植物的中间测量结肠的腔周长以确定狭窄的程度。结果表示为重塑部位和近端正常组织之间的周长减少的百分比(平均值+/-sd)。

将切下的组织在平坦位置中钉在软木板上并浸没在10％的中性缓冲福尔马林中。将样品(包括正常组织和重塑组织两者)纵向修剪、切片、并用苏木精-伊红和马松三色染色剂染色。检查的区域包括自然组织、重塑区域和自然组织之间的近端和远端界面、以及重塑区域的中间区域。在检查数据分布的基础上，数据似乎是正态分布的。因此，用于比较结果的统计方法是参数t检验(n＝4)。

所检验的假设是，与未治疗相比，缺少sis-ecm的emr治疗会导致周长较少地减少。认识到，来自各个测试动物的数据经历多重统计分析(即，周长减少和重量)。将狗的腔周长减少的比较作为主要统计分析，这不涉及多次测试。所有其他统计检验被认为是次要的，其p值未经重复测量的校正，应仅作为描述性的。

结果与结论。

在没有治疗的情况下，疤痕和狭窄形成是预期的结果。然而，ecm治疗导致在大体上和显微镜下显示正常的切除组织的粘膜覆盖。根据管状装置中ecm层的数量，结果略有不同-较高数量的ecm层通常与增加的粘膜覆盖率相关。用ecm支架治疗的任何狗中均不存在狭窄的迹象。

目前对狗模型的研究表明，周围emr后在内窥镜下部署的sis-ecm支架促进结肠粘膜重塑(图1)而没有狭窄形成。重塑的组织由完全上皮化的腔组成，该完全上皮化的腔具有致密、有组织的胶原粘膜下层和正常出现的肌层外膜。

因此，使用狗模型并采用sis-ecm移植物以使结肠粘膜内衬组织再生的这些研究证明ecm可以在治疗ibd例如uc或cd中使用。

已经描述了本发明，清楚的是，可以不脱离本发明的精神和范围的情况下而提供可能的不同实施方式。因此，意图将前述说明书解释为说明性的而不是限制性的。

实施例2-应用凝胶ecm替代结肠组织

根据本发明，可以在大鼠体内测试使用用于治疗炎性肠病(ibd)的ecm凝胶组合物的可行性。可以将大鼠建立为人ibd，例如溃疡性结肠炎(uc)的模型，由此通过随意地施用在饮用水中的葡聚糖硫酸钠(dss)数天，可以在大鼠结肠组织中诱导uc样炎症。

在大鼠中诱导急性uc样炎症可通过在饮用水中随意施用5％dss共7天，然后施用常规水来进行。在大鼠中诱导急性uc样炎症可通过在饮用水中随意提供5％dss一个或多个连续的7天周期，然后施用常规水来进行

uc的治疗可使用来源于小肠粘膜下层(sis)并通过灌肠引入结肠的凝胶胞外基质(ecm)进行。凝胶sis-ecm可以每天施用一次或多次，持续至少一周，优选多达约一个月的时间。sisecm的优选给药方案是每天一次，持续1至30天。

从ecm制备凝胶的方法

美国专利第4,902,508号、美国专利第5,275,826号和美国专利第5,514,533号中详细描述了从小肠的片段制备sis，其公开内容明确地通过引用并入本文。首先使用纵向擦拭运动对一段肠进行磨蚀，以去除外层(特别是浆膜和肌膜)和内层(粘膜层的腔部分)。通常，用盐水冲洗sis并将其任选地以水合或脱水状态储存，直至如下所述使用。

通过用蛋白酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)以一段足以溶解所述组织并形成基本上均匀的溶液的时间粉碎和/或消化粘膜下层，将本发明的流化组合物制备成肠粘膜下层的溶液或悬浮液。通过撕裂、切割、研磨、剪切等将肠粘膜下层起始材料粉碎。在冷冻或冻干状态下研磨粘膜下层是优选的，尽管通过使粘膜下层片段的悬浮液在高速(高剪切)混合器中经过处理以及脱水(如果需要，通过离心和倾析过多的水进行)，也可以获得获得良好的结果。可以将粉碎的肠粘膜下层干燥以形成粘膜下层粉末。此后，可以将其水合，即与水或缓冲盐水和任选地其它药学上可接受的赋形剂组合以形成组织移植物组合物，该组合物为在25℃下粘度为约2至约300,000cps的流体。较高粘度的移植物组合物可具有凝胶或糊状的稠度。本发明的组合物可以使用本领域公认的灭菌技术来灭菌，例如暴露于电离辐射。

本发明的流化粘膜下层还发现作为在需要修理或增强的以最典型地纠正创伤或疾病诱导的组织缺陷中用于组织(例如软组织)的可注射异种移植物的用途。

sis悬浮液

使用组织剪刀、单刃刀片或其他合适的切割工具将如上所述制备的sis样品切碎或剁碎成任意的小块。将样品置于平底不锈钢容器中，并将液氮引入容器中以冷冻样品以使其准备粉碎。

然后，将冷冻的sis样品粉碎以形成粗sis粉末。这种处理可以例如用wiley磨机或手动手扳压机进行，其中圆柱形黄铜锭放置在冷冻样品的顶部。锭用作样品和手扳压机之间的界面。可以定期向sis样品中添加液氮以使其冷冻。

粉碎sis样品的其它方法可以用于生产可根据本发明使用的sis粉末。例如，sis样品可以冷冻干燥，然后使用手扳压机或其他研磨方法研磨。可供选择地，sis可以在高剪切混合器中处理，以经脱水和干燥产生sis粉末。

使用预冷的研钵和研杵进一步研磨sis粉末可用于产生一致的，更微细的产物。同样，根据需要使用液氮以在最终研磨期间保持固体冷冻颗粒。粉末可以使用例如缓冲盐水容易地水合，以产生具有所期望粘度的本发明的流化组织移植物材料。

sis溶液

通过丝筛网将sis粉末筛分到任何方便的容器中。然后将粉末进行蛋白水解消化以形成基本上均匀的溶液。在一种实施方式中，在室温下于48小时内用0.1m乙酸中的1mg/ml胃蛋白酶(sigmachemicalco.，st.louis，mo)消化粉末，用hcl调节ph至2.5。用氢氧化钠中和反应介质以灭活消化活性。然后可以通过溶液的盐沉淀将溶解的粘膜下层浓缩，并将其分离用于进一步纯化和/或冷冻干燥以形成粉末形式的蛋白酶溶解的肠粘膜下层。

根据本发明的流化的粘膜下层组合物的粘度可以通过控制粘膜下层成分的浓度和水合程度来操纵。可以在25℃下将粘度调节至约2至约300,000cps的范围。低粘度粘膜下层组合物更适合于关节内应用或体腔内的应用。通过将这种溶液的ph从约6.0调节至约7.0，可以从sis消化溶液制备更高粘度的制剂，例如凝胶。凝胶形式的本发明组合物，如粘膜下层悬浮液或粘膜下层消化溶液，通常优选使用注射器或导管进行皮下或肌肉内应用。

sis凝胶也被描述为通过在4℃下以合适的量混合0.1n氢氧化钠(消化溶液的体积的1/10)和10×pbsph7.4(消化溶液的体积的1/9)以形成凝胶。使用冷(4℃)1×pbsph7.4将溶液调至所期望的体积和浓度，并置于37℃培养箱中进行凝胶化。

在40分钟后，ecm能够在溶液中以形成基质。ecm衍生的凝胶在低于20℃的温度下是液体。但当温度升至37℃时变成凝胶。

在从ecm制备凝胶中，所有的溶液应保持在冰上，下列变量必须按照美国专利第8,361,503号来确定，其全部内容通过引用并入本文：

cf＝最终凝胶的浓度(mg/ml)

cs＝ecm消化溶液的浓度(mg/ml)

vf＝实验所需的最终凝胶溶液的体积

vd＝ecm消化溶液所需的体积(ml)

v10×＝所需10×pbs的体积(ml)

v1×＝所需1×pbs的体积(ml)

vnaoh＝所需0.1nnaoh的体积(ml)

首先，确定所需ecm凝胶的最终浓度(cf)和体积(vf)。然后，通过将cf(mg/ml)*vf(ml)相乘计算所需ecm的质量。该值将提供ecm消化溶液所需的体积(vd)，其中vd＝[cf(mg/ml)*vf(ml)]/cs。

通过使vd除以9计算所需10×pbs的体积(v10x＝vd/9)。通过使计算的体积vd除以10计算所需0.1nnaoh的体积(vnaoh＝vd/10)。计算出所需的1xpbs的量以使溶液至适当的浓度/体积如下：v1x＝vf-vd-v10x-vnaoh。将所有试剂(v1x+vd+v10x+vnaoh)添加到合适的容器中(通常是15或50ml离心管)而没有ecm消化溶液(vd)。将溶液置于冰上并始终保持在冰上。

将适当体积的ecm消化溶液(vd)添加到上述制备的pbs/氢氧化钠混合物中，并用1ml微量移液器混匀，同时小心并避免在溶液中产生气泡。根据ecm消化溶液的粘度，在转移过程中可能存在一些显著的体积损失。监控总体积并添加适当的量，直到达到最终体积。测量预凝胶溶液的ph值，其ph值应为7.4左右。

将预凝胶溶液添加到模具中或添加到适当的孔中。将模具或孔放置在37℃培养箱中最少40分钟。避免使用co2控制的培养箱。如果需要注意水分蒸发，将模具放入塑料拉链袋中，然后放入培养箱中。胶凝后，可将凝胶从模具中取出并置于1×pbs上。如果凝胶是在组织培养板中制备的，可将1×pbs置于凝胶顶部直至用于保持凝胶水合。

sis-ecm施用程序

sis-ecm溶液或悬浮液可通过灌肠施用到uc诱导的大鼠的结肠内。在施用移植物后，预期宿主动物不会发生排斥、感染或异常生理反应。溶液或悬浮液也可以通过内窥镜和腹腔镜施用到结肠内。据信，本发明的意料之外的结果将是对适当的组织重塑的刺激使得可以用sis溶液或悬浮材料完成结肠粘膜的增强。

本发明的流化组合物可以导致组织替代和修复，并进一步导致包括uc的ibd的治疗或治愈。根据本方法使用流化的粘膜下层组合物来诱导天然结肠粘膜组织的再生。通过将有效量的流化ecm组合物注射到缺陷组织的位置，可以实现各向异性特性而无需更多侵入性外科技术。

实施例3-使用ecm水凝胶(ecmh)对大鼠结肠组织重塑的体内研究

uc疗法的非手术和非药理学方法可以通过促进局部固有免疫细胞群的替代激活来减轻炎性耀斑(inflammatoryflares)，并通过恢复黏膜上皮结构诱导快速替代结肠粘膜屏障功能。本研究证明了局部递送水凝胶形式的哺乳动物胞外基质(ecmh)治疗uc的功效。通过多种体内和体外结果测量来评估ecmh对临床症状、炎症和上皮屏障功能的影响。

在本实施例提供的该研究示出了由ecm组成的灌肠水凝胶有效地治疗uc的啮齿动物模型。根据由ecmh治疗正向指导的两个基本生理过程来确定有效治疗：1)恢复结肠上皮屏障功能，该功能保护宿主免受不间断的促炎腔内容物的攻击；2)通过释放炎性细胞因子来传播炎症的组织巨噬细胞的促炎状态的消退。该策略代表了一种主动的治疗方法，与目前用于治疗uc的免疫抑制(防御性)和手术(抢救)方法截然不同。

不同于一些以前的报道，本研究的结果表明ecmh可以不通过直接促进m2样巨噬细胞的表型，而是通过减少m1样促炎巨噬细胞的数量，介导固有免疫炎症反应。ecmh处理的动物的结肠的巨噬细胞(其是组织修复的必需介质)没有减少，但是炎性巨噬细胞减少。ecmh(即便单独使用)的这种免疫调节性质可以如当前药理学疗法一样有效，而没有相关的负面副作用。另外，ecmh疗法可对结肠粘膜的上皮细胞具有保护作用。该研究通过恢复上皮屏障功能、减轻促炎巨噬细胞和建立粘膜组织再生环境，证明了用ecmh有效治疗结肠炎症。

方法

实验设计

为了确定在验证的uc啮齿动物模型中ecmh的功效和安全性，在雄性sd(spraguedawley)大鼠中诱导疾病并通过每日灌肠输注ecmh或模仿包含加工残余物的ecmh溶剂的对照溶液连续7天来治疗。在葡聚糖硫酸钠(dss)后第7天和第14天处死动物以评估时间响应(每次处理的每个时间点n＝14)。在第7天和第14天包括未接受dss或灌肠输注的健康大鼠用于比较(每个时间点n＝6)。主要研究终点包括临床反应、组织学评分、炎症反应和屏障功能。在固有层单核细胞(lpmc)和肠上皮细胞(iec)中分别体外测量ecmh对炎症和上皮屏障功能的影响。

ecm水凝胶制备和制剂

小肠粘膜下层(sis)ecm由猪小肠制备。在安乐死后立即收获肠，在去离子水中冲洗内容物并冷冻。将组织解冻并机械地去除粘膜的表层。同样地，机械地去除浆膜和外肌膜，留下粘膜下层和粘膜的基底部分。将剩余的sis材料在去离子水中漂洗24-72小时，然后用0.1％过氧乙酸/4％乙醇处理，随后用盐水和水漂洗。将sis-ecm冷冻、冻干、用wileymill，使用#60目筛网粉碎，并以10mg/ml干重用在0.01nhcl中的1mg/ml胃蛋白酶(sigma，st.louis，mo)消化，同时在21至23℃下搅拌20至26小时。将消化物以等分样品储存在-20℃下并在使用前中和。所有体内研究均使用ecmh浓度为8mg/ml，所有体外研究均使用ecmh浓度为500μg/ml。

如先前所描述的，用注射了¹⁴c-标记脯氨酸的猪肠制备如上所述的¹⁴c-标记的ecmh。根据制造商的说明书(thermopiercenet；#53027)，用蛋白质标记试剂盒制备fitc标记的ecmh。

ecm水凝胶的表征

通过h&e和dapi染色缺乏核来确定脱细胞效率。通过picogreen测定(invitrogen)测量残余dna，并使用凝胶电泳观察dna片段化。根据制造商的指南，使用blyscan硫酸化糖胺聚糖测定(biocolorltd.)来测量ecm中的硫酸化糖胺聚糖含量。使用以40mm平行板几何形状操作的流变仪(ar2000，tainstruments，newcastle，de)来测定ecmh的流变学特性，并通过在0.159hz的频率下施加1pa的应力来测量稳定剪切粘度，如前所述(参考)。所有表征测定均基于4个独立的ecm制剂完成(n＝4)。

ecmh粘附力测试

使用改进的剥离力测量来对ecmh的粘膜粘附进行测量。将配备有10n测力元件的单轴拉伸试验机(mtsinsight；mtssystemscorp.，edenprairie，mn)用于所有拉伸强度测量。将两个结肠部分粘合到钢垫圈(直径12.7mm)上，粘膜朝外，并将一个垫圈粘合到24孔板(直径15.6mm)的底部。通过用十分之一体积的0.1mnaoh和九分之一体积的10×pbs中和来制备ecmh，然后将0.5ml添加到底部洗涤器中，并添加顶部洗涤器并使顶部洗涤器渗透到凝胶中至预定的深度，然后在37℃下温育1小时。温育后，以5mm/分钟的恒定速度向上缓慢地抽出粘膜，直到表面之间发生分离。chickering&mathiowitz(1995)(kammer1983)。

动物和饲养

所有的程序和动物研究获得批准，并遵守匹兹堡大学辐射安全委员会和机构动物护理和使用委员会进行。从harlan获得8至12周龄的雄性sd大鼠，将其单独饲养并适应环境7至10天。将动物在标准条件下，温度为21-23℃，黑暗/光照循环12小时饲养。在整个研究期间允许大鼠随意获取食物和水。

疾病诱导和监测

每日在去离子水中制备5％葡聚糖硫酸钠(dss)的盐(36,000至50,000mw；mp生物医学)，并通过随意饮用施用于大鼠7天，每天对动物监测。对每只动物跟踪动物体重以及食物和水的消耗。每隔一天(即第1、3、5、7天等)测量疾病活动(即粪便稠度、粪便中血液存在和体重减轻)，并根据表1在0至4的范围内评分。通过稠度(0＝正常、2＝松散、4＝腹泻)和血液存在(0＝无、2＝潜血、4＝大出血)对粪便进行评分。使用coloscreeneslabpack粪便潜血测试来测试粪便中是否存在血液。与基线相比的体重减轻评分如下：0＝无，1＝1-5％，2＝5-10％，3＝10-20％，和4＝>20％。

灌肠输注剂施用

通过2-4％异氟醚吸入将大鼠麻醉，使用柔性surflo有翼输注导管(terumo,od＝2mm)来递送灌肠输注剂。使用连接到导管的注射器(每个部位约1.6ml)在结肠的3个部位施用灌肠剂(5ml)，从肛门近端8cm处以及5cm和3cm处开始，同时逐渐移除导管，大约总输注时间为60秒(即每个部位20秒)。

使用fitc-和¹⁴c-ecmh进行ecmh保留研究

为了确定水凝胶保留时间，在用dss诱导疾病之后向大鼠施用fitc-标记的或¹⁴c标记的。基于ecmh制剂(fitc-ecmh和¹⁴c-ecmh)将18只大鼠分成两组，并在灌肠后2小时、12小时和24小时处死(每个ecmh制剂在每个时间点n＝3)。将来自fitc-ecmh处理的大鼠的外植的结肠处理成光学透明的，使得通过荧光成像可以看到腔内容物。在处死后立即保护所有样品免受光照以防止fitc缀合物的光漂白。通过在dent's固定剂(1:4二甲基亚砜(dmso):丙酮)中温育2小时来开始结肠的光学透明处理。然后将结肠透化并在dent's漂白剂(1:4:1dmso:丙酮:h2o2)中漂白1小时。然后将光学透明的结肠在(凝胶成像仪)上成像。将暴露时间设定为fitc-ecmh的对照样品，并对所有后续图像保持恒定。

对于¹⁴c测量，将每只大鼠的整个结肠单独地快速冷冻并在液氮中进行均质化。用研钵和研杵研磨组织并混合至均匀。通过加速质谱(ams)分析大约40mg的组织样品。未处理的对照用于减去自然组织中的背景¹⁴c水平。

结肠组织的外植和评分

如之前描述地在确定的时间点处死动物。根据美国兽医协会(avma)，通过co2吸入和随后的颈椎脱位实现安乐死。在安乐死之后，通过中线切口切除结肠。收集从直肠到盲肠的连续的结肠段并拍照。测量结肠长度作为疾病活动的指标。纵向打开结肠并大体评估损伤情况。由对治疗组不知情的研究者确定评分。

将9厘米长的结肠的远端区域切成三部分，并且纵向打开。然后收集样品用于组织学、离体器官培养和髓过氧化物酶测量。将切片石蜡包埋，从远端至近端结肠的从2至8cm处获得的切片(5μm)用苏木精和伊红(h&e)染色，用于表示组织学评分。将远端和近端部分分成两个载玻片，并由六名不知情研究者进行组织学评分。

tritc-葡聚糖渗透性测定

通过tritc葡聚糖的肠内施用(分子质量4.4kda；sigma)来评估肠道通透性。在处死前4小时向大鼠施用tritc-葡聚糖(1ml，10mg/ml)。在处死时获得来自心脏交界处(cardiacjuncture)的全血并收集在血清管中。在spectramax酶标仪(moleculardevices)上一式三份地进行tritc-葡聚糖测量，使用tritc-葡聚糖的连续稀释液作为标准曲线。

器官培养

如之前描述的，在第7天与第14天施用从3mm真皮打孔机从每个实验动物和对照动物的结肠获得全厚度活组织检查样品。将组织样品在37℃，5％co2和95％o2下培养48小时。收获上清液并在-80℃下储存以用于tnf-α和pge2elisa测定。

lpmc分离和培养

如之前描述的，在用饮用水中的5％dss诱导结肠炎7天之后从大鼠分离lpmc。将结肠外植、清除肠系膜脂肪组织，切除派尔集合淋巴结(peyer’spatches)区域。然后将结肠纵向分成两半，切成碎片，并根据制造商的说明使用固有层解离试剂盒(miltenyi)解离成单细胞悬浮液。然后将悬浮液沿40/70％percoll梯度分离。将细胞悬浮在含有10％fbs和100u/ml青霉素和链霉素的rpmi1640中，并以每孔2×10⁵个细胞添加到添加或未添加500μg/mlecmh和对照缓冲液的96孔板中。温育48小时后，收集上清液并在-80℃下储存直至进行tnf-α和pge2的elisa测定。

肠上皮细胞(iec)的培养

对于体外屏障功能测定，在含有非必需氨基酸、1mm的丙酮酸钠和20％fbs的mem中培养iec(caco-2，24-28代，atcc)至80％汇合。根据制造商的说明，使用快速分化系统(corningbiocoathtscaco-2assay)评估iec对ecmh的功能反应。用100ng/mllps攻击汇合并分化的细胞单层2小时，然后用ecmh处理48小时。通过跨上皮电阻(teer)和上皮钙粘蛋白(e-钙粘蛋白)细胞粘附蛋白的存在来测量iec的功能反应。

跨上皮电阻(teer)测量

用上皮伏特欧姆计(evom2,worldprecisioninstruments)常规地测量caco-2单层的teer。在接种caco-2细胞之前，测量支持过滤器和缓冲介质的电阻，并将其从用单层测定的总电阻中减去以计算单层的teer。在该研究中仅使用teer值大于300ω×cm²的分化单层。

免疫标记

为了确定ecmh治疗后的巨噬细胞反应，将石蜡包埋的组织切片免疫标记上m1样和m2样巨噬细胞表型tnfα和cd206的指示物。使用二甲苯将组织切片脱石蜡，并使用乙醇系列梯度再水化。使用0.001m柠檬酸盐缓冲液(ph＝6)在95℃下进行热介导的抗原修复20分钟。将组织切片置于tris缓冲盐水吐温20(tbst)中15分钟，然后在封闭缓冲液(2％马血清/1％牛血清白蛋白/0.05％吐温20/0.05％triton-x-100)中温育1小时。在加湿室中在4℃下将在封闭缓冲液中稀释的一抗添加到载玻片上16小时。然后将载玻片在tbs中洗涤三次，然后在加湿室中在室温下添加二抗1小时。将载玻片用4'6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)复染以显现细胞核。使用的一抗是作为pan巨噬细胞标记的以1:150稀释的小鼠抗大鼠cd68(abdserotec，raleigh，nc)，作为m1样标记的以1:200稀释的兔抗tnfα多克隆抗体(abcam)，以及以1:100稀释的山羊抗cd206多克隆抗体(santacruzbiotech，santacruz，ca)。使用的二抗是alexafluor驴抗小鼠594(1:200，invitrogen)，alexafluor驴抗山羊488(1:200，invitrogen)和alexafluor驴抗兔546(1:200，invitrogen)。证实所有一抗与大鼠表位交叉反应。组织切片在每个组织切片的五个随机视野中成像。使用用cellprofiler图像分析软件开发的定制图像分析算法来实现标记的定量。

统计分析

使用先导研究数据结合之前公布的相关研究，基于把握度分析确定样品大小。对所有动物进行编号并随机分配到组中。所有负责评分的研究者都对实验组不知情。将定量结果与单因素或双因素方差分析(anova)和事后tukey检验进行比较，以确定组间差异。使用spss统计分析软件(spss，ibm)进行所有统计分析。除非另有说明，否则数据报告为平均值±标准误。

结果

ecmh粘附于结肠组织

ecmh具有反向热胶凝的独特性质，并且水凝胶性能取决于材料特性。灌肠通常作为靶向递送至发炎的结肠的基本形式而用于轻度至中度结肠炎。ecmh的治疗功效依赖于其粘附于结肠壁和与发炎细胞的相互作用的能力。粘附性测试的结果显示ecmh是粘膜粘附的，当在健康结肠上测试时，粘附强度呈剂量依赖性增加(图12a)。与健康组织相比，研究中使用的8mg/mlecmh剂量在结肠炎大鼠结肠中保持相等的粘附强度(图12b)。粘膜粘附性不是所有热可逆性凝胶的性质，因为嵌段式聚醚(pluronicf-127)(20％；sigma)未显示出比阴性对照更大的粘附强度(数据未显示)。当通过灌肠递送给结肠炎大鼠时，ecmh的停留时间大于24小时。施用灌肠剂后2小时，约50％的¹⁴c-ecmh保留下来，并且24小时后约10％的初始ecmh灌肠剂保留下来(图12c)。通过fitc-ecmh的可视化证实了这些结果(图12d)。总之，这些结果表明ecmh材料特性允许以液体形式输注，随后的凝胶化确保治疗保持局部化至少24小时。根据上述发现，使用每日灌肠治疗来测量ecmh的治疗功效。

ecmh治疗缓解疾病状态

该dss实验模型是被广泛接受的具有上皮屏障缺陷的uc样自限性结肠炎表型。在暴露于饮用水中的5％dss3天后出现结肠炎的临床症状(例如体重减轻、粪便血液和粪便粘稠)，并在6天后达到其峰值(图4)。ecmh治疗减少了uc的临床症状。与对照相比，动物体重减轻较少(第1天和第3天)并且粪便中的血液较少(第3天和第5天)。在第0天的结肠缩短(图4d)，但在所有组中第7天和第14天不再明显(图8d)。在第7天，与对照相比，ecmh治疗导致结肠大体解剖学评分降低(图8e)。组织形态学分析还显示在提供的模型中ecmh是治疗性的，如代表性图像中所示(图6)。在远端和近端组织切片中，ecmh治疗导致炎症迹象减弱并且在第7天和第14天降低溃疡程度(图5)。这些数据显示ecmh灌肠输注方案有效地减少了uc模型中的疾病的临床和组织学迹象。

ecmh恢复上皮屏障功能

结肠中的上皮屏障可在疾病进展中起重要作用。即使在存在完整的免疫系统的情况下，肠屏障功能的缺陷和渗透性增加也可导致炎性肠病。tritc-葡聚糖渗透性测定的结果显示，在第7天时，ecmh处理的动物的屏障功能与健康动物相似，而对照中的结肠上皮屏障与健康对照相比仍然是受损的(图13a)。如teer读数所示，分化的和lps损伤的iec单层通过功能性恢复而响应于ecmh治疗(图13b)。增加的屏障功能对应于e-钙粘蛋白存在的增加，e-钙粘蛋白是肠道中最重要的细胞-细胞粘附蛋白之一。与阴性对照相比，ecmh处理导致e-钙粘蛋白阳性细胞增加约50％(图13c至图13d)。这些数据显示ecmh促进上皮屏障功能的功能改善，并且ecmh可通过限制上皮细胞损伤或通过积极地挽救粘膜完整性而在治疗上起作用。

ecmh在炎症中的作用

由于炎症可以是uc发病机制的一部分，所述有效的疗法介导炎症反应。ibd的炎症介质(即tnf-α和pge2)用于评估ecmh对炎症的影响。将从结肠炎大鼠中分离的lpmc铺板并暴露于ecmh。ecmh处理导致lpmc产生tnf-α(图11a)显著减少，但对pge2产生没有影响(图11b)。然而，从进行1周ecmh或对照灌肠方案后的大鼠收集的器官培养物显示在ecmh处理的动物中分泌的pge2与健康对照相似，而溶媒对照具有显著升高的粘膜pge2水平(图11c)。无论在所研究的时间点的实验条件如何，器官培养物中分泌的tnf-α水平都低于可检测水平。

通过对共表达tnf-α或cd206的结肠中cd68+巨噬细胞的数量定量来评价ecmh对巨噬细胞表型的影响(参照图10中的代表图)。有趣的是，所有治疗组的cd68+、cd206+和tnf-α+细胞数相同(图9)，但ecmh治疗导致第7天cd68+/tnf-α+炎性巨噬细胞数量减少(图8)。由于ecmh不影响总体tnf-α+细胞的数量，但确实减少了cd68+/tnf-α+细胞的数量，ecmh可具有通过减少结肠组织中存在的炎性巨噬细胞的数量来调节巨噬细胞反应的直接作用。

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