根除白血病细胞的方法和组合物与流程
本申请要求2016年6月2日提交的美国临时申请号62/344,959和2016年11月21日提交的美国临时申请号62/425,045的利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
政府支持
本发明在美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的资助号为r01hl097794的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术：
急性髓性白血病(aml)是一种在遗传上非均质的血液干细胞和髓系祖细胞疾病，其特征在于恶性胚细胞在骨髓中的积累，这严重损害正常的血液形成。尽管aml具有非均质本性，但各种不同的亚型似乎享有某些共同的导致白血病生成的途径，并且所述疾病的层级性通常是明确的(lane等，blood1150-1157(2009))。从遗传观点来看，aml是表征最完善的恶性肿瘤之一。大量引起白血病的遗传转化事件已被表征(marcucci等，j.clinicaloncology29,475-486(2011)；pui等，j.clinicaloncology29,551-65(2011)；和burnett等，j.clinicaloncology29,487-94(2011))。除了细胞自主性事件之外，也已报道了白血病细胞与微环境的双向互动(gillette等，naturecellbiology11,303-11(2009)；walkley等，cell129,1097-110(2007)；和wei等，cancercell13,483-95(2008))，说明了白血病细胞与微环境之间的随之而来的交互作用。然而，尽管对白血病生成中涉及的分子变化的分类取得进展，但对这些变化如何协同以引起耐药性的理解仍然薄弱。此外，关于总体来说以及具体在诱导化疗期间白血病细胞之间的交叉相互作用的完整层次，了解得非常少。
技术实现要素：
在某些情况下，本文公开的发明涉及根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些实施方式中，本文公开了在需要的对象中治疗急性髓性白血病的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)，从而在所述对象中治疗急性髓性白血病。本文还公开了提升患有急性髓性白血病的对象的存活的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)，并从而提升所述对象的存活。在某些实施方式中，本文公开的发明涉及促进白血病细胞分化成非白血病细胞的方法，所述方法包括将所述白血病细胞与有效量的药剂(例如18-β-甘草次酸、甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而促进所述白血病细胞分化成非白血病细胞。
在某些情况下，根据本文公开的发明使用的药剂包含甘草次酸衍生物。示例性的甘草次酸衍生物包括甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸、2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺及其类似物。在某些实施方式中，所述药剂是或包含18-β-甘草次酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述药剂是或包含甘珀酸或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述甘珀酸衍生物是聚乙二醇化甘珀酸。在某些情况下，所述药剂是或包含间隙连接阻断剂。在某些实施方式中，所述药剂是或包含半通道阻断剂。在其他实施方式中，所述药剂是或包含连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶中的一者或多者的阻断剂或抑制剂。
在某些实施方式中，还公开了选择性根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的在所述白血病细胞中选择性诱导氧化应激的药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些实施方式中，所述氧化应激通过确定所述细胞群体中活性氧物质(ros)的总水平来检测。在某些实施方式中，氧化应激通过确定所述细胞群体中线粒体活性氧物质(ros)的总水平来检测。
在某些实施方式中，本发明涉及选择性根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的在所述白血病细胞中选择性诱导脂质损伤的药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些实施方式中，脂质损伤通过确定所述细胞群体中氧化脂质与非氧化脂质的比率来检测。在某些实施方式中，脂质损伤通过用流式细胞术检测脂质过氧化来检测。
在某些情况下，本文还公开了选择性根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的在所述白血病细胞中选择性诱导dna损伤的药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些实施方式中，dna损伤通过确定所述细胞群体中的γh2ax磷酸化来检测。在某些实施方式中，γh2ax磷酸化通过流式细胞术(例如facs)检测。
在某些实施方式中，所述药剂是或包含选自以下的甘草次酸衍生物：甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些情况下，所述甘草次酸衍生物包含甘珀酸或其衍生物或类似物。
在某些情况下，所述根除白血病细胞的方法还包括诱导所述白血病细胞分化成粒细胞。在某些实施方式中，所述粒细胞包含嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，所述嗜中性粒细胞包含cd66b+/cd14-嗜中性粒细胞。
在某些实施方式中，根除白血病细胞还包括破坏涉及所述白血病细胞促进白血病细胞存活的细胞间通讯。在某些情况下，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞与基质细胞之间的异型相互作用。在其他实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞之间的同型相互作用。
在某些实施方式中，本文公开的方法引起所述细胞群体中白血病细胞的选择性根除，同时诱导正常白细胞的增殖。在其他实施方式中，所述细胞群体中的白血病细胞被选择性根除，而不根除正常白细胞。在某些情况下，所述细胞群体中至少约20％、约50％、约60％、约75％、约80％、约90％、约95％、约99％或约100％的白血病细胞被根除。
在某些实施方式中，按照本文公开的方法根除的白血病细胞包括选自以下的急性髓性白血病细胞系：mll-af9细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、nb-4细胞和thp1细胞。
在某些情况下，所述细胞群体包含选自骨髓白细胞和外周血白细胞的原代白细胞。
在某些实施方式中，有效量的药剂包含在体外在50μμ至400μμ的范围内或在体内在10mg/kg至100mg/kg范围内的浓度。
在本文公开的方法的某些实施方式中，将所述白血病细胞与所述药剂在体外或离体相接触。在本文公开的方法的某些实施方式中，将所述白血病细胞与所述药剂在体内相接触(例如接触是在对象中)。
在某些情况下，所述对象是小鼠。在某些情况下，所述对象是人类。在某些情况下，所述对象患有白血病(例如急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或慢性淋巴细胞性白血病(cll))。在某些实施方式中，本文公开的方法延长所述对象的存活期。在某些实施方式中，所述公开的方法和药剂与化学治疗剂共同给药。
在一种情况下，本公开提供了一种根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的间隙连接阻断剂相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些情况下，本公开提供了一种根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的半通道阻断剂相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选自下述式i至iii：
其中x、y和z各自独立地表示卤素特别是f、cl、i或br、c1-c6烷基、c5-c15芳基或c1-c6烷氧基，n表示从1至10、特别是从1至4的整数，l表示酰胺、胺、磺酰胺、酯、硫酯或酮基团，t、u、v和w各自独立地表示氧代、硫代、酮、硫酮、c1-c6烷基或c1-c6烷醇基团，ar表示芳香环系统，以及cyc表示环状环系统，
其中a表示c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，b和c各自独立地表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，m是1至10、特别是1至4的整数，并且d是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c6烷基，
其中e表示oh、c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚(c1-c10-o-)或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，f表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，并且g是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c20烃基、特别是c1-c6烷基。
在一种情况下，本公开提供了一种根除细胞群体中的白血病细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的药剂或间隙连接阻断剂相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂是18-β-甘草次酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂是18-β-甘草次酸的衍生物，选自甘草甜素、甘草酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂不是18-β-甘草次酸。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选自庚醇、辛醇、花生四烯乙醇胺、芬那酸化物、视黄酸、油酰胺、精胺、氨基硫酸酯、卤烷、安氟醚、异氟烷、丙泊酚、硫喷妥、甘草次酸、奎宁、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯或其可药用衍生物及其任何组合。在某些实施方式中，所述可药用衍生物包含：庚醇的可药用衍生物，其选自1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇及其组合；芬那酸化物的可药用衍生物，其选自甲氯芬那酸、尼氟灭酸、氟芬那酸及其组合；甘草次酸的可药用衍生物，其选自甘草次酸的氢酯、甘草次酸的氢酯的盐、甘珀酸及其组合；以及奎宁的可药用衍生物，其选自奎尼丁、甲氟喹及其组合。
在某些实施方式中，根除白血病细胞包括诱导所述白血病细胞分化成粒细胞。在某些实施方式中，所述粒细胞包含嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，所述嗜中性粒细胞包含cd66b+/cd14-嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括破坏涉及所述白血病细胞促进白血病细胞存活的细胞间通讯。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞与基质细胞(例如间质基质细胞)之间的异型相互作用。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞与任何其他细胞类型(例如骨系细胞、内皮细胞、周细胞、间质细胞或其他造血细胞)之间的异型相互作用。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞之间的同型相互作用。在某些实施方式中，所述细胞群体中的白血病细胞被选择性根除，同时诱导正常白细胞的增殖。在某些实施方式中，所述细胞群体中的白血病细胞被选择性根除，而没有根除正常白细胞。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少20％的白血病细胞被根除。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少50％的白血病细胞被根除。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少70％的白血病细胞被根除。在某些实施方式中，所述细胞群体中所有的白血病细胞被根除。
在某些实施方式中，所述细胞群体中的白血病细胞被选择性根除，同时最低限度地根除正常白细胞。在某些实施方式中，所述细胞群体中的白血病细胞被甘珀酸或其类似物或衍生物(例如在约5μμ、10μμ、25μμ、50μμ、100μμ、200μμ、250μμ或500μμ的甘珀酸浓度下)选择性根除，同时最低限度地根除正常白细胞。例如，在某些情况下，所述白血病细胞被选择性根除(例如在约50μμ的甘珀酸或其类似物或衍生物浓度下)，同时少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％或更少的正常细胞被根除。在某些情况下，相对于所述细胞群体中的非干细胞，甘珀酸或其类似物或衍生物选择性根除所述细胞群体中的干细胞(例如白血病干细胞)。
在某些实施方式中，所述白血病细胞包含选自mll-af9细胞、mll-enl细胞、nup98-hoxa9细胞、aml1-et09a细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、nb-4细胞、hoxa9/meis1细胞和thp1细胞的急性髓性白血病细胞系。
在某些实施方式中，所述细胞群体包含选自骨髓白细胞和外周血白细胞的原代白细胞。
在某些实施方式中，所述有效量包括在体外在50μμ至400μμ范围内或在体内在10mg/kg至100mg/kg范围内的浓度。
在某些实施方式中，所述接触在体外或离体发生。在某些实施方式中，所述接触在体内发生。在某些实施方式中，所述体内接触是在对象中。在某些实施方式中，所述对象是小鼠。在某些实施方式中，所述对象是人类。在某些实施方式中，所述对象患有白血病。在某些实施方式中，所述对象患有急性髓性白血病。
在一种情况下，本公开提供了一种促进白血病细胞分化成非白血病细胞的方法，所述方法包括将所述白血病细胞与有效量药剂或间隙连接阻断剂相接触，从而促进所述白血病细胞分化成非白血病细胞。
在某些实施方式中，所述白血病细胞包含白血病干细胞或祖细胞。在某些实施方式中，所述白血病干细胞或祖细胞包含急性髓性白血病细胞。在某些实施方式中，所述急性髓性白血病细胞包含选自mll-af9细胞、mll-enl细胞、nup98-hoxa9细胞、aml1-et09a细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、nb-4细胞、hoxa9/meisl细胞和thp1细胞的细胞系。
在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含成熟或终末分化细胞。在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含粒细胞。在某些实施方式中，所述粒细胞包含短寿命粒细胞。在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，所述嗜中性粒细胞包含cd66b+/cd14-嗜中性粒细胞。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选自下述式i至iii：
其中x、y和z各自独立地表示卤素特别是f、cl、i或br、c1-c6烷基、c5-c15芳基或c1-c6烷氧基，n表示从1至10、特别是从1至4的整数，l表示酰胺、胺、磺酰胺、酯、硫酯或酮基团，t、u、v和w各自独立地表示氧代、硫代、酮、硫酮、c1-c6烷基或c1-c6烷醇基团，ar表示芳香环系统，以及cyc表示环状环系统，
其中a表示c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，b和c各自独立地表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，m是1至10、特别是1至4的整数，并且d是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c6烷基，
其中e表示oh、c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚(c1-c10-o-)或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，f表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，并且g是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c20烃基、特别是c1-c6烷基。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂是18-β-甘草次酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂是18-β-甘草次酸的衍生物，选自甘草甜素、甘草酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选自庚醇、辛醇、花生四烯乙醇胺、芬那酸化物、视黄酸、油酰胺、精胺、氨基硫酸酯、卤烷、安氟醚、异氟烷、丙泊酚、硫喷妥、甘草次酸、奎宁、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯或其可药用衍生物及其任何组合。
在某些实施方式中，所述可药用衍生物包含：庚醇的可药用衍生物，其选自1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇及其组合；芬那酸化物的可药用衍生物，其选自甲氯芬那酸、尼氟灭酸、氟芬那酸及其组合；甘草次酸的可药用衍生物，其选自甘草次酸的氢酯、甘草次酸的氢酯的盐、甘珀酸及其组合；以及奎宁的可药用衍生物，其选自奎尼丁、甲氟喹及其组合。
在一种情况下，本公开提供了一种在需要的对象中治疗急性髓性白血病的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的药剂或间隙连接阻断剂，从而在所述对象中治疗急性髓性白血病。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂不是18-β-甘草次酸。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选择性根除所述对象中的白血病细胞，而不根除所述对象中的正常白细胞。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选择性根除所述对象中的白血病细胞，并且最低限度地根除所述对象中的正常白细胞。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂选择性根除所述对象中的白血病细胞，同时在所述对象中诱导正常白细胞的增殖。
在某些实施方式中，所述方法还包括对所述对象实施诱导化疗治疗方案。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述抗代谢药剂包含阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述蒽环类药剂包含多柔比星。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述患者给药阿糖胞苷和多柔比星为期5天。在某些实施方式中，所述诱导化疗包含向所述患者给药阿糖胞苷和多柔比星为期3天，然后向所述患者单独给药阿糖胞苷为期2天。
在某些实施方式中，在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药所述药剂或间隙连接阻断剂至少一天。在某些实施方式中，将所述药剂或间隙连接阻断剂向所述对象给药至少一天，然后与所述药剂或间隙连接阻断剂同时对所述对象实施所述诱导化疗治疗方案。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括对所述对象进行高压氧疗法(hbot)。在某些实施方式中，所述对象被给药甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)并进行hbot。不受理论限制，据推测甘珀酸的选择性抗癌(例如抗白血病)效果由具有提高的氧消耗速率的癌细胞(例如白血病细胞)中改变的细胞代谢所介导。因此，通过hbot用氧饱和所述对象的血液和组织，可以增强甘珀酸的抗癌效果。hbot可以在甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)给药之前、期间或之后开始，只要所述对象在所述甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)存在于所述对象中的至少一部分时间内在血液和/或组织中表现出升高的氧水平即可。在某些实施方式中，hbot在约1.0ata至3.0ata、在另一个实施方式中约1.5ata至2.75ata、在另一个实施方式中约2.0ata至2.5ata的压力下进行。每次治疗的时间可以在约1至120分钟或更长时间内变化。
在某些实施方式中，所述对象患有难治性或复发性急性髓性白血病。在某些实施方式中，所述方法还包括评估所述对象以确定所述对象是否患有难治性或复发性急性髓性白血病。
在某些实施方式中，所述对象是从诱导化疗后急性髓性白血病的完全缓解再度复发的对象。
在某些实施方式中，治疗急性髓性白血病包括在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解。
在某些实施方式中，治疗急性髓性白血病包括在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解，并且不存在由所述对象的骨髓或外周血中的残留白血病细胞造成的复发风险。
在一种情况下，本公开提供了一种提升患有急性髓性白血病的对象的存活的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的药剂或间隙连接阻断剂，从而提升所述对象的存活。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。在某些实施方式中，所述方法还包括对所述对象实施诱导化疗治疗方案。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述抗代谢药剂包含阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述蒽环类药剂包含多柔比星。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述患者给药阿糖胞苷和多柔比星为期5天。在某些实施方式中，所述诱导化疗包含向所述患者给药阿糖胞苷和多柔比星为期3天，然后向所述患者单独给药阿糖胞苷为期2天。
在某些实施方式中，在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药所述药剂或间隙连接阻断剂至少一天。在某些实施方式中，将所述药剂或间隙连接阻断剂向所述对象给药至少一天，然后与所述药剂或间隙连接阻断剂同时对所述对象实施所述诱导化疗治疗方案。
在某些实施方式中，所述方法还包括选择患有或表现出急性髓性白血病的终末状态的对象。在某些实施方式中，所述对象具有晚期肿瘤转移。在某些实施方式中，所述对象具有高肿瘤负荷。
在某些实施方式中，与在没有接受所述药剂或间隙连接阻断剂的情况下所述对象的存活期相比，所述药剂或间隙连接阻断剂增加所述对象的存活期。在某些实施方式中，与在没有接受所述药剂或间隙连接阻断剂的情况下所述对象的存活可能性相比，所述药剂或间隙连接阻断剂提高所述对象的存活可能性。
在一种情况下，本公开提供了一种在患有复发性或难治性急性髓性白血病的对象中通过选择性根除所述对象中的白血病细胞而引起完全缓解的方法，所述方法包括(a)评估所述对象以确定所述对象是否患有复发性或难治性急性髓性白血病；(b)在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药药剂或间隙连接阻断剂至少一天；并且(c)对所述对象实施包含抗代谢药剂和蒽环类药剂的诱导化疗治疗方案历时规定的时间段，从而通过选择性根除所述对象中的白血病细胞而在所述对象中引起完全缓解。
在一种情况下，本公开提供了一种药物组合物，其包含：有效量的药剂或间隙连接阻断剂，有效量的至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂，和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含抗代谢药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含多柔比星。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含阿糖胞苷和多柔比星。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂不是18-β-甘草次酸。
在一种情况下，本公开提供了一种试剂盒，其包含药剂或间隙连接阻断剂、至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂和用于向患有急性髓性白血病的对象给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种化学治疗剂的使用说明书。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包含使用所述药剂或间隙连接阻断剂和/或所述至少一种化学治疗剂实施的预防性治疗，以及使用所述药剂或间隙连接阻断剂和/或所述至少一种化学治疗剂实施预防性治疗的使用说明书。在某些实施方式中，所述预防性治疗包括本文中描述的用于治疗或预防高血压、低钾血和水肿的药物活性。0051在某些实施方式中，所述使用说明书还包含作为用于所述对象的诱导化疗治疗方案的一部分而给药所述至少一种化学治疗剂的指导。在某些实施方式中，所述使用说明书还包含给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂以在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解的指导。在某些实施方式中，所述使用说明书还包含给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂，通过完全根除所述对象中的白血病细胞在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解而没有复发风险的指导。在某些实施方式中，所述使用说明书还包含给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂，通过诱导所述白血病细胞从增殖的、永生的白血病细胞分化成短寿命的非白血病细胞来完全根除所述对象中的白血病细胞，以在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解的指导。
在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含抗代谢药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含多柔比星。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包含阿糖胞苷，并且所述蒽环类药剂包含多柔比星。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。
本文还公开了用于筛选试验药剂以确定这种试验药剂是否可能是可用于选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法和测定法。在一个实施方式中，这些鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；并且(b)检测所述细胞群体中氧化应激的诱导；其中在所述白血病细胞中选择性诱导氧化应激的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，所述氧化应激通过确定所述细胞群体中活性氧物质(ros)的总水平来检测。在某些实施方式中，氧化应激通过确定所述细胞群体中线粒体活性氧物质(ros)的总水平来检测。
在某些情况下，还公开了鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法，所述方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；并且(b)检测所述细胞群体中脂质损伤的诱导；其中在所述白血病细胞中选择性诱导脂质损伤的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，脂质损伤通过确定所述细胞群体中氧化脂质与非氧化脂质的比率来检测。在某些实施方式中，脂质损伤通过经流式细胞术检测脂质过氧化来检测。
在其他实施方式中，本文公开了鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法，所述方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；并且(b)检测所述细胞群体中dna损伤的诱导；其中在所述白血病细胞中选择性诱导dna损伤的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，dna损伤通过确定所述细胞群体中的γh2ax磷酸化来检测。在某些实施方式中，γh2ax磷酸化通过流式细胞术(例如facs)来检测。
在某些情况下，本文公开的方法和测定法可用于鉴定包含甘草次酸衍生物的试验药剂是否能够从细胞群体选择性根除白血病细胞。在某些实施方式中，所述甘草次酸衍生物选自甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些实施方式中，所述甘草次酸衍生物包括甘珀酸或其类似物或衍生物。
在上述方法的某些实施方式中，可用于这些测定法和方法的白血病细胞包括选自mll-af9细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、nb-4细胞和thp1细胞的急性髓性白血病细胞系。
尽管本发明的某些方面涉及白血病细胞的选择性根除和治疗白血病(例如急性髓性白血病)的相关方法，但应该理解，本文公开的组合物和方法的效能不限于白血病细胞，而是广泛扩展到所有癌细胞类型(例如实体肿瘤和非实体肿瘤)。例如，在某些实施方式中，本文公开的发明涉及根除细胞群体中的癌细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的甘草次酸衍生物相接触，从而根除所述细胞群体中的癌细胞(例如白血病细胞)。同样地，在某些实施方式中，本文公开的发明涉及在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的甘草次酸衍生物，从而在所述对象中治疗癌症。
在任何上述实施方式中，所述甘草次酸衍生物选自甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些实施方式中，所述甘草次酸衍生物包括甘珀酸或其类似物或衍生物。
在任何上述实施方式中，所述癌细胞通过本文公开的组合物和方法被选择性根除(或所述癌症被治疗)，而不根除所述细胞群体中的非癌细胞。例如，在某些实施方式中，所述细胞群体中至少20％的癌细胞、所述细胞群体中至少50％的癌细胞、所述细胞群体中至少70％的癌细胞被根除，或者所述细胞群体中所有的癌细胞被根除。在某些实施方式中，所述细胞群体中的非癌细胞包括选自骨髓白细胞和外周血白细胞的原代白细胞。
在任何上述方法的某些情况下，所述甘草次酸衍生物的有效量包括在体外在50μμ至400μμ范围内或在体内在10mg/kg至100mg/kg范围内的浓度。
在某些情况下，所述癌细胞的接触在体外或离体发生。在某些情况下，所述接触在体内发生(例如其中所述体内接触是在对象例如患有急性髓性白血病的人类对象中)。
在某些实施方式中，所述癌细胞包括白血病细胞。在某些实施方式中，所述癌细胞包括乳腺癌细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括黑素瘤细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括前列腺癌细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括宫颈癌细胞。在某些情况下，所述癌细胞包括肺癌细胞。
在任何上述实施方式中，本文公开的方法还包括将所述细胞群体与化学治疗剂相接触，例如通过向需要的对象共同给药所述甘草次酸衍生物和所述化学治疗剂。
在某些情况下，本文公开的药剂(例如甘草次酸衍生物，例如甘珀酸或其类似物或衍生物)引起所述癌细胞中超氧化物水平的提高。在某些情况下，本文公开的药剂不引起非癌细胞中超氧化物水平的提高。
本发明的某些实施方式涉及一种根除细胞群体中的癌细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的甘草次酸衍生物相接触，从而根除所述细胞群体中的癌细胞。在某些情况下，所述甘草次酸衍生物选自甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸、甘珀酸衍生物、甘珀酸类似物或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。在某些情况下，所述甘珀酸衍生物是聚乙二醇化甘珀酸。
在某些情况下，所述癌细胞被选择性根除。在某些情况下，所述细胞群体中至少20％的癌细胞被根除。在某些情况下，所述细胞群体中至少50％的癌细胞被根除。在某些情况下，所述细胞群体中至少70％的癌细胞被根除。在某些情况下，所述细胞群体中所有的癌细胞被根除。
在本发明的某些情况下，所述甘草次酸衍生物的有效量包括在体外在50μμ至400μμ范围内或在体内在10mg/kg至100mg/kg范围内的浓度。
在本发明的有些情况下，所述接触在体外或离体发生(例如在对象中)。在某些情况下，所述对象是小鼠或人类。在某些情况下，所述对象患有白血病(例如急性白血病、急性髓性白血病)。在某些情况下，所述对象患有实体肿瘤。在某些情况下，所述对象患有选自黑素瘤、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌的癌症。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后测量所述细胞群体中的钙通量。在某些情况下，测量钙通量在与所述甘草次酸衍生物接触后约1、2、3、4、5或10分钟内进行。在某些实施方式中，在来自于用本文公开的治疗方法难治的对象的细胞群体中测量钙通量。在某些实施方式中，在来自于尚未经历本文公开的治疗方法的对象的细胞群体中测量钙通量，以协助确定这种治疗是否可能有效。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中的脂质损伤。在某些情况下，脂质损伤通过用流式细胞术(例如荧光活化细胞分拣(facs))检测脂质过氧化来检测。在某些情况下，脂质损伤通过所述细胞群体中氧化脂质与非氧化脂质的比率来检测。在某些实施方式中，脂质损伤通过用流式细胞术(例如facs)检测脂质过氧化来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中的dna损伤。在某些情况下，dna损伤通过检测双链dna断裂来检测。在某些情况下，dna损伤通过确定所述细胞群体中的γh2ax磷酸化来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中氧化应激的诱导。在某些情况下，氧化应激通过检测所述细胞群体中活性氧物质(ros)的总水平来检测。在某些情况下，氧化应激通过检测所述细胞群体中线粒体活性氧物质(ros)的总水平来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测代谢产物。在某些情况下，所述代谢产物是次黄嘌呤。
本发明的方法的某些情况还包括将所述细胞群体与本文所描述的一种或多种化学治疗剂相接触。在某些情况下，所述一种或多种包括抗代谢药剂和/或蒽环类药剂。在某些情况下，所述一种或多种化学治疗剂包括一种或多种去甲基化药剂。在某些情况下，所述一种或多种化学治疗剂包括阿糖胞苷和多柔比星。在某些情况下，所述一种或多种化学治疗剂包括被所述癌细胞耐药的化学治疗剂。
通过与下面的实施例相结合参考下面本发明的详细描述，本发明的上面讨论的和许多其他特点和伴随的优点将变得更好理解。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的拷贝，在提出要求并付出必要费用后由专利办公室提供。
图1a、1b、1c和1d演示了在急性髓性白血病(aml)的小鼠模型中实施的5天诱导化疗方案的动力学研究的结果。图1a是示出了用于aml的小鼠模型的实验设计的示意图。图1b是在第14天小鼠的ivis成像的实例，显示了骨骼中的萤光素酶活性。图1c和1d是示出了来自于血液(图1c)和骨髓(bm)(图1d)样品的gfp阳性mll-af9细胞的facs分析的结果的条形图。
图2a、2b、2c和2d证实了间隙连接活性在维持白血病细胞的耐药性中发挥关键作用。将100,000个mll-af9细胞在含有或不含化疗药剂(50nm阿糖胞苷+20nm多柔比星)和含有或不含近合生ms-5层的情况下温育16小时(图2a)。将100,000个在含有或不含transwell插片(0.4μm)的情况下与近合生ms-5层共培养的mll-af9细胞，在含有或不含化疗药剂(50nm阿糖胞苷+20nm多柔比星)和含有或不含100μμcbx的情况下温育16小时(图2b和2c)。细胞存活率通过facs分析中7aad阴性细胞的百分数确定(*p<0.01)。图2d示出了在所指示的处理后1周的全身生物发光成像(ivis)。白色箭头指示最少的残留aml细胞。
图3a和3b证实了单独或与化疗相组合地向移植有mll-af9白血病的小鼠(人类白血病的已确立的小鼠模型)体内给药甘珀酸导致存活期延长。图3a示出了在骨骼中检测到白血病细胞后，留下来未处理的小鼠(红色线)或在第27天接受处理的小鼠(根据所指示的，绿色、蓝色、紫色或黑色线)的存活曲线。化疗(chemo)：向所述对象给药阿糖胞苷(100mg/kg)和多柔比星(3mg/kg)为期3天，然后向所述对象单独地给药阿糖胞苷(100mg/kg)为期2天。cbx：在存在或不存在化疗的情况下向所述对象给药甘珀酸(20mg/kg)为期3或6天。图3b示出了未处理的(红色线)或在第68天接受处理的(蓝色线)末期疾病小鼠的存活曲线，疾病的终末状态为白血病细胞扩散到全身和高的肿瘤负荷。cbx：向所述对象给药甘珀酸(10mg/kg)为期3天，然后暂停治疗3天，然后向所述对象给药甘珀酸(20mg/kg)2天，然后暂停治疗3天，然后向所述对象给药甘珀酸(30mg/kg)3天。
图4a、4b、4c和4d证实了在体外通过间隙连接阻断选择性根除不同的aml细胞类型。将甘珀酸(cbx)以所指示的浓度添加到100,000个mll-af9、原代骨髓白细胞或原代外周血白细胞16小时(图4a)。将100,000个mll-af9(克隆a)细胞(图4b)、100,000个mll-af9(克隆b)细胞(图4c)或100,000个hoxa9/meis1细胞(图4d)与100,000个原代bm白细胞混合并且正如所指示的暴露于cbx16小时。细胞通过cd45.1/cd45.2表达来区分，并在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定细胞存活率(*p<0.01)。
图5a、5b、5c和5d证实了甘珀酸选择性根除不同的鼠类aml细胞(蓝色条)，而不影响非白血病的正常对应物(红色条)。图5a是示出了mll-af9(克隆a)细胞与新鲜分离的原代白细胞1:1混合并且正如所指示的暴露于甘珀酸下16小时的结果的条形图。将mll-af9(克隆a)细胞(图5b)、mll-af9(克隆b)细胞(图5c)和hoxa9/meis1细胞(图5d)以1:1的比率与新鲜分离的骨髓白细胞混合，并且正如所指示的暴露于甘珀酸下16小时。细胞通过cd45.1/cd45.2表达来区分，并在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定细胞存活率(*p<0.01)。
图6a、6b、6c、6d、6e和6f证实了甘珀酸处理根除鼠类白血病癌干细胞，同时诱导正常干细胞的增殖。对暴露于正如所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸的mll-af9细胞(图6a)、骨髓原代白细胞(图6b)和mll-af9细胞与骨髓原代白细胞两者的1:1混合物(图6c)进行集落形成测定法，并确定每种浓度下每10,000个细胞的培养物中的集落形成单位cfu-c。图6d、6e和6f是示出了在暴露于0μμ(图6d)、50μμ(图6e)和200μμ或100μμ(图6f)甘珀酸后，白血病集落(绿色)和正常集落(蓝色)的形成的图像。
图7a、7b和7c证实了在体外间隙连接阻断促进aml细胞分化成短寿命粒细胞。将原代mll-af9细胞暴露于所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸，然后通过facs分析来分析gr1(图7a)、mac1(图7b)或gr1/mac1(图7c)的表达。细胞存活率在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定(*p<0.01)。
图8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g、8h、8i、8j、8k和8l证实了在人类aml细胞系u937中，甘珀酸诱导快速的(在16小时内)嗜中性粒细胞分化(cd66b+/cd14-)。将人类amlu937细胞暴露于所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸下16小时，然后通过facs分析来分析活细胞(图8a)、cd14+(图8b)、cd66b+(图8c)、mac1+(图8d)、cd66b+/mac1-(图8e)、cd66b+/mac1+(图8f)、cd66b-/mac1+(图8g)、cd66b-/mac1-(图8h)、cd66+/cd14-(图8i)、cd66b+/cd14+(图8j)、cd66b-/cd14+(图8k)和cd66b-/cd14-(图8l)的表达。细胞存活率在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定(*p<0.01)。
图9a、9b、9c、9d、9e、9f、9g、9h、9i、9j、9k和9l证实了在人类aml细胞系hl60中，甘珀酸诱导快速的(在16小时内)嗜中性粒细胞分化(cd66b+/cd14-)。将人类amlhl60细胞暴露于所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸下16小时，然后通过facs分析来分析活细胞(图9a)、cd14+(图9b)、cd66b+(图9c)、mac1+(图9d)、cd66b+/mac1-(图9e)、cd66b+/mac1+(图9f)、cd66b-/mac1+(图9g)、cd66b-/mac1-(图9h)、cd66+/cd14-(图9i)、cd66b+/cd14+(图9j)、cd66b-/cd14+(图9k)和cd66b-/cd14-(图9l)的表达。细胞存活率在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定(*p<0.01)。
图10a、10b、10c、10d、10e、10f、10g、10h、10i、10j、10k和10l证实了在新鲜分离的人类原代白细胞中，甘珀酸不诱导嗜中性粒细胞分化(cd66b+/cd14-)。新鲜分离人类原代白细胞并将其暴露于所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸下16小时，然后通过facs分析来分析活细胞(图10a)、cd14+(图10b)、cd66b+(图10c)、mac1+(图10d)、cd66b+/mac1-(图10e)、cd66b+/mac1+(图10f)、cd66b-/mac1+(图10g)、cd66b-/mac1-(图10h)、cd66+/cd14-(图10i)、cd66b+/cd14+(图10j)、cd66b-/cd14+(图10k)和cd66b-/cd14-(图10l)的表达。细胞存活率在facs分析中通过7aad阴性细胞的百分数来确定(*p<0.01)。
图11a、11b、11c和11d证实了甘珀酸处理根除人类白血病癌干细胞和祖细胞(11a-11c)，并同时诱导正常人类干细胞和祖细胞的增殖细胞(11d)。对暴露于所指示的浓度逐渐提高的甘珀酸下的thp1细胞(图11a)、hl60(图11b)、u937(图11c)和新鲜分离的人类原代非白血病正常白细胞(图11d)进行集落形成测定法，并确定每种浓度下每2,000个细胞的培养物中的集落形成单位cfu-c。
图12a、12b、12c、12d、12e、12f、12g、12h、12i、12j、12k、12l、12m、12n、12o、12p和12q是来自于已发表的阵列的基因表达情况图，其证实了11βhsd和连接蛋白间隙连接家族的成员在人类aml中过表达。图12a是示出了在恶性和正常血液中11βhsd表达的表达情况图。图12b是示出了在恶性和正常血液中cx40.1表达的表达情况图。图12c是示出了在恶性和正常血液中cx30.2表达的表达情况图。图12d是示出了在恶性和正常血液中cx31.1表达的表达情况图。图12e是示出了在恶性和正常血液中cx36表达的表达情况图。图12f是示出了在恶性和正常血液中cx45表达的表达情况图。图12g是示出了在恶性和正常血液中cx47表达的表达情况图。图12h是示出了在恶性和正常血液中cx32表达的表达情况图。图12i是示出了在恶性和正常血液中cx50表达的表达情况图。图12j是示出了在恶性和正常血液中cx30.3表达的表达情况图。图12k是示出了在恶性和正常血液中cx31表达的表达情况图。图12l是示出了在恶性和正常血液中cx26表达的表达情况图。图12m是示出了在恶性和正常血液中cx40表达的表达情况图。图12n是示出了在恶性和正常血液中cx37表达的表达情况图。图12o是示出了在恶性和正常血液中cx46表达的表达情况图。图12p是示出了在恶性和正常血液中cx43表达的表达情况图。图12q是示出了在恶性和正常血液中cx30表达的表达情况图。图12a-12q中描绘的每张表达情况图中的每个点代表不同的独立研究。
图13演示了用于实时分析诱导化疗期间白血病细胞的相互作用和通讯的实验设计，其能够进行活体显微术、疾病进程的监测、治疗的同步、复发的监测、不同癌基因的有效比较、病毒使用的最小化、体外活体视频显微术和体外筛选。
图14a、14b和14c证实了cbx克服由基质介导的耐药性。结果使用25nm阿糖胞苷和10nm多柔比星作为化疗剂来获得。星号指示在温育16小时后获得的结果。存活力通过gfp表达和7aad排除来检测。图14c中的结果使用transwell插片分离来实现。
图15证实了体外暴露于cbx(等于或高于100μμ)导致mll-af9白血病细胞的根除，但不根除正常血细胞。结果在与所指示的量的cbx温育16小时后通过流式细胞术存活性测定法获得，存活性通过gfp表达和7aad排除来检测。
图16a、16b、16c和16d证实了cbx选择性根除不同的鼠类aml细胞(蓝色条)而不影响非白血病正常对应物(红色条)——在1:1的细胞混合物中。图16a示出了与新鲜分离的血液白细胞1:1混合的mll-af9(部分a)细胞在所指示的浓度下的cbx处理的结果。图16b示出了与新鲜分离的骨髓白细胞1:1混合的mll-af9(部分a)细胞在所指示的浓度下的cbx处理的结果。图16c示出了与新鲜分离的骨髓白细胞1:1混合的mll-af9(部分b)细胞在所指示的浓度下的cbx处理的结果。图16d示出了与新鲜分离的骨髓白细胞1:1混合的hoxa9/meis1细胞在所指示的浓度下的cbx处理的结果。
图17a、17b、17c和17d证实了cbx(高于或等于50μμ)对恶性和正常的未成熟干细胞和祖细胞的差异影响(cfu-c测定法)。图17a是示出了对单独的mll-af9白血病细胞进行的所指示浓度的cbx处理的结果的条形图。图17b是示出了对单独的正常骨髓原代白细胞进行的所指示浓度的cbx处理的结果的条形图。图17c是示出了对mll-af9细胞与正常骨髓原代白细胞的1:1混合物进行的所指示浓度的cbx处理的结果的条形图。图17d示出了图17c中描述的对细胞混合物进行的cbx处理的结果的图像。
图18a、18b、18c和18d证实了人类apl细胞系hl60对cbx敏感。图18a是示出了通过流式细胞术评估的在暴露于所指示浓度的cbx后16小时hl60细胞的存活率的条形图。图18b是示出了通过流式细胞术评估的在暴露于所指示浓度的cbx后16小时新鲜分离的人类外周血白细胞的存活率的条形图。图18c是示出了通过用于癌症和正常干细胞和祖细胞的功能性定量的cfu-c测定法所评估的在暴露于所指示浓度的cbx后7天hl60细胞的集落形成的条形图。图18d是示出了通过用于癌症和正常干细胞和祖细胞的功能性定量的cfu-c测定法所评估的在暴露于所指示浓度的cbx后7天新鲜分离的人类外周血白细胞的集落形成的条形图。
图19a、19b、19c和19d证实了cbx处理(100μμ)根除人类白血病祖细胞，但诱导正常祖细胞的增殖。图19a是示出了通过cfu-c测定法所评估的用所指示浓度的cbx处理的thp1细胞的增殖的条形图。图19b是示出了通过cfu-c测定法所评估的用所指示浓度的cbx处理的hl60细胞的增殖的条形图。图19c是示出了通过cfu-c测定法所评估的用所指示浓度的cbx处理的u937细胞的增殖的条形图。图19d是示出了通过cfu-c测定法所评估的用所指示浓度的cbx处理的人类原代祖细胞的增殖的条形图。
图20a、20b和20c证实了cbx快速诱导mll-af9白血病细胞的凋亡。蓝色条和红色条示出了与对照相比，在用所指示浓度的cbx处理6小时(图20a)、12小时(图20b)和20小时(图20c)后mll-af9白血病细胞的存活率(正如通过7aad阴性细胞的频率所评估的)和凋亡(正如通过7aad阴性、膜联蛋白-v阳性细胞的频率所评估的)。
图21证实了cbx处理诱导白血病细胞的凋亡并增强正常健康细胞的补充。facs点图示出了与对照(pbs)相比，对irfp+mll-af9白血病细胞与正常骨髓单核细胞(bm-mnc)的1:1混合物进行cbx处理4h后的结果。
图22证实了cbx处理诱导白血病细胞的凋亡并增强正常健康细胞的补充。蓝色条和红色条分别示出了与pbs对照相比，用所指示浓度的cbx处理后凋亡的单核细胞(mnc)和凋亡的白血病细胞。
图23证实了mll-af9白血病细胞对mac1、gr1和ckit是双重阳性的。facs点图指示了正常成肌细胞是用于比较的最适合的对应物。
图24显示了facts点图，示出了与对照(pbs)相比，对irfp+mll-af9白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物进行cbx处理4h后的结果。
图25证实了cbx诱导的白血病细胞凋亡不是细胞周期依赖性的。图25是条形图，示出了对irfp+mll-af9白血病细胞(蓝色条)与高度增殖的正常成髓细胞(黑色条)或扩增的谱系-/ckit+/sca1+(lks)细胞(黑色条)的1:1混合物进行4h的cbx处理的结果。所使用的细胞群体的增殖速率如下：mll-af9：3次分裂/24小时；成髓细胞：3次分裂/24小时；elks：7次分裂/24小时。
图26a、26b、26c和26d。图26a和26b是示出了mll-af9irfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或醛固酮处理4h后的存活率(7aad阴性，irfp+/-；图26a)和凋亡(7aad阴性，irfp+，膜联蛋白-v阳性；图26b)的条形图。图26c和26d是示出了mll-af9irfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或醛固酮处理24h后的存活率(7aad阴性，irfp+/-；图26c)和凋亡(7aad阴性，irfp+，膜联蛋白-v阳性；图26d)的条形图。
图27a、27b、27c和27d。图27a和27b是示出了mll-af9gfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或醛固酮处理4h后的存活率(7aad阴性，gfp+/-；图27a)和凋亡(7aad阴性，gfp+/，膜联蛋白-v阳性；图27b)的条形图。图27c和27d是示出了mll-af9gfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或醛固酮处理24h后的存活率(7aad阴性，gfp+/-；图27c)和凋亡(7aad阴性，gfp+/，膜联蛋白-v阳性；图27d)的条形图。
图28a-n描述了具有与cbx(图28n)相似结构和/或相似的系统“甾类”效应的化合物。图28a、28b、28c和28d是盐皮质激素醛固酮(图28a)、螺内酯(图28b)、氟氢可的松(图28c)和去氧皮质甾酮(图28d)的结构式。图28e、28f、28g、28h、28i、28j、28k、28l和28m是糖皮质激素二丙酸倍氯米松(图28e)、皮质醇(图28f)、皮质酮(图28g)、地塞米松(图28h)、倍他米松(图28i)、泼尼松龙(图28j)、泼尼松(图28k)、甲基泼尼松龙(图28l)和曲安奈德(图28m)的结构式。
图29a和29b。图29a是示出了mll-af9irfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或所指示的盐皮质激素化合物处理24h后的存活率(7aad阴性，irfp+/-)的条形图。图29b是示出了图28a-28n中示出的化合物的比较性甾类效价的表。
图30a和30b。图30a是示出了mll-af9irfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或所指示的糖皮质激素化合物处理24h后的存活率(7aad阴性，irfp+/-)的条形图。图30b是示出了图28a-28n中示出的化合物的比较性甾类效价的表。
图31a和31b。图31a是示出了mll-af9irfp+白血病细胞与正常成髓细胞的1:1混合物在用200μμcbx或所指示的糖皮质激素化合物处理24h后的存活率(7aad阴性，irfp+/-)的条形图。图31b是示出了图28a-28n中示出的化合物的比较性甾类效价的表。
图32证实了在经历凋亡的cbx处理的小鼠白血病细胞(7aad阴性mll-af9细胞)中mac1(cd11b，整合蛋白αm)被下调。
图33是证实了人类骨髓标志物不同于小鼠的表。mac1由嗜中性粒细胞、nk细胞和巨噬细胞表达。cd66b专门在粒细胞上表达并被用作粒细胞标志物。cd14主要由巨噬细胞表达(并且由嗜中性粒细胞以低10倍的程度表达)。cd66b+cd14+只标志单核细胞。如图33中所示，cd14是小鼠中mac-1的人类等同物，并且cd66b是小鼠中gr-1的人类等同物。
图34a、34b、34c和34d证实了mac1在cbx处理的人类白血病细胞中被下调，但在cbx处理的正常人类血细胞中不被下调，正如通过与所指示浓度的cbx温浴16h的活的7aad人类细胞的流式细胞术分析所确定的。图34a-34d是与cbx处理的人类白血病细胞系u937、hl60和thp1相比，定量cbx处理的人类原代白细胞中的骨髓标志物cd11b(图34a)、cd14+(图34b)、cd66b+(图34c)和cd66+/cd14+(图34d)的条形图。
图35是演示了骨髓白血病细胞和它们的正常对应物中间隙连接分子的体内基因表达研究的结果的表。所评估的骨髓白血病细胞包括mll-af9+、gfp阳性、gr1/mac1阳性、高c-kit细胞。所评估的骨髓正常髓系祖细胞包括b220/cd8a/cd3e/cd4/ter119阴性gfp阴性、gr1/mac-1阳性、高c-kit细胞。
图36是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中连接蛋白分拣蛋白consortin的表达相对于hprt表达的条形图。
图37a、37b、37c、37d、37e、37f、37g、37h和37i是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中间隙连接α分子的表达相对于hprt表达的条形图，包括间隙连接α分子a1(图37a)、a3v1(图37b)、a3v2(图37c)、a4(图37d)、a5v1(图37e)、a5v2(图37f)、a6(图37g)、a8(图37h)和a10(图37i)。
图38a、38b、38c、38d、38e、38f和38g是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中间隙连接β分子的表达相对于hprt表达的条形图，包括间隙连接β分子b1(图38a)、b2(图38b)、b3(图38c)、b4(图38d)、b5(图38e)、b6v3(图38f)和b6v2(图38g)。
图39a、39b和39c是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中间隙连接γ分子的表达相对于hprt表达的条形图，包括间隙连接γ分子c1(图39a)、c2(图39b)和c3(图39c)。
图40a、40b和40c是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中间隙连接δ分子的表达相对于hprt表达的条形图，包括间隙连接δ分子d2(图40a)、d3(图40b)和(图40c)。
图41是说明了在使用所指示的处理和对照规定的时间段后，与白血病相比在正常gmp中间隙连接ε分子的表达相对于hprt表达的条形图。
图42证实了cbx向mll-af9白血病小鼠的腹膜内(ip)给药引起存活期延长。通过在未被辐照的受体中静脉内注射1百万个活的mll-af9白血病细胞(表达gfp和萤光素酶)，在小鼠中诱导白血病。在所述模型中，在移植后～27天可以在骨髓中检测到白血病细胞，并且未治疗的小鼠在～第70天死于白血病。一旦在骨髓中检测到白血病后，在第27天开始以50mg/kg的剂量对小鼠腹膜内给药cbx6天。图42示出了未治疗(左侧)、用化疗治疗(中间)和用cbx加化疗治疗的小鼠(右侧)在第36天的全身化学发光信号(ivis)。
图43a和43b证实了cbx向mll-af9白血病小鼠的腹膜内(ip)给药引起存活期延长。对于图43a中描述的实验结果来说，一旦在骨骼中检测到白血病细胞后，治疗在第27天提供，给药包含阿糖胞苷(100mg/kg)和多柔比星(3mg/kg)的化疗药剂3天，然后给药单独的阿糖胞苷(100mg/kg)另外2天，并以20mg/kg的剂量向所述对象给药cbx6天。对于图43b中描述的实验结果来说，治疗在第68天，在疾病的终末阶段白血病细胞扩散到全身时提供，cbx以10mg/kg的剂量给药3天，然后暂停治疗3天，然后以20mg/kg的剂量给药2天，然后暂停治疗3天，然后以30mg/kg的剂量给药3天。
图44证实了每日皮下(sc)给药cbx2周(单独地以75mg/kg的剂量或与化疗相组合以50mg/kg的剂量)引起白血病小鼠的存活期延长。通过在亚致死剂量辐照的受体中静脉内注射5百万个活的mll-af9白血病细胞(表达红外荧光蛋白(irfp))，在小鼠中诱导白血病。在所述模型中，白血病细胞可以在移植后～7天在骨髓中检测到，并且未治疗的小鼠在～第34天死于白血病。使用下述治疗方案：第-1天：亚致死剂量辐照(4.5gy)；第1天：尾静脉注射5m个活的irfp+mll-af9白血病细胞；第7+8天：pbs或cbx治疗(皮下，如所描述的)；第9-11天：pbs或cbx治疗+化疗(100mg/kg阿糖胞苷+3mg/kg多柔比星)；第12+13天：pbs或cbx治疗+化疗(100mg/kg阿糖胞苷)；第14-21天：pbs或cbx治疗。如图44中所示，在没有预防性治疗的情况下cbx的长期系统性暴露(持续2周)在某些情况下引起急性致死性假性高醛甾酮症(例如高血压和胃水肿)。
图45a、45b和45c演示了用单独的或与诱导化疗相组合的25mg/kgcbx治疗的小鼠的存活曲线。40％-60％的cbx治疗的小鼠存活，并且早期死亡由急性致死性假性高醛甾酮症造成。值得注意的是，与pbs和化疗对照两者相比，用cbx与诱导化疗的组合治疗的小鼠的存活率没有统计学显著的差异。
图46a、46b和46c演示了用单独的或与诱导化疗相组合的50mg/kgcbx治疗的小鼠的存活曲线。单独的50mg/kgcbx引起没有统计学显著差异的早期死亡(20％的cbx治疗的小鼠存活)。然而，与化疗相组合，50mg/kg的cbx导致与pbs和化疗对照两者相比显著提高的存活率。
图47a、47b和47c演示了用单独的或与诱导化疗相组合的75mg/kgcbx治疗的小鼠的存活曲线。单独的75mg/kgcbx引起与pbs对照相比显著提高的存活率。然而，与化疗相组合，75mg/kg的cbx导致没有统计学显著差异的早期死亡(20％的cbx治疗的小鼠存活)。
图48演示了在图45a-c、图46a-c和图47a-c中描述的所有sc延长给药试验的存活曲线和p值。
图49a和49b证实了cbx的延长给药(sc，每天，14天)可能导致没有白血病征兆的致死性假性高醛甾酮症。图49a是健康对照小鼠的尸检图像。图49b是在50mg/mlcbx治疗后第28天死亡的小鼠的尸检图像(图49b)，其表现出胃水肿。
图50a、50b和50c证实了在cbx治疗的动物(sc，每天，共14天)中的早期死亡最可能由急性假性高醛甾酮症而不是由白血病引起。图50a是用pbs治疗的小鼠的尸检图像，显示出白血病的清楚征兆。图50b是用化疗治疗的小鼠的尸检图像，显示出白血病的征兆。图50c是用化疗加上50mg/kgcbx治疗的小鼠的尸检图像，没有显示出白血病的征兆。黑色箭头指示肿胀的淋巴结。红色箭头指示脾肿大。蓝色箭头指示胃水肿。
图51是用化疗治疗的对象小鼠的尸检图像，显示出白血病的征兆。黑色箭头指示肿胀的淋巴结。红色箭头指示脾肿大。蓝色箭头指示胃水肿。
图52是用化疗加上50mg/kgcbx治疗的对象小鼠的尸检图像，没有显示出白血病的征兆。黑色箭头指示肿胀的淋巴结。红色箭头指示脾肿大。蓝色箭头指示胃水肿。
图53演示了由18β-甘草次酸(甘草次酸)进行的选择性白血病细胞根除并描绘了它的结构。将原代mll-af9lks急性髓性白血病细胞(红色条)与正常bm单核细胞(蓝色条)共培养。将共培养物中的细胞暴露于甘草次酸20小时(在0、5、20、50、100和200μμ下)，然后通过流式细胞术分析细胞存活率(活的白血病细胞＝gfp+/7aad-；活的正常细胞＝gfp-/7aad-)。
图54示出了18β-甘草次酸(甘草次酸)对正常骨髓细胞(髓系细胞相比于非髓系细胞)的存活的影响。将共培养物中的细胞暴露于甘草次酸20小时(在0、5、20、50、100和200μμ下)。如图54中所示，甘草次酸在200μμ下对正常非髓系细胞有毒。
图55证实了甘珀酸(cbx)在白血病细胞中选择性诱导氧化应激。如图55中所示，用200μμcbx处理各种不同的持续时间(1、2、4或8小时)，引起相对于正常细胞在白血病细胞中对总的和线粒体活性氧物质(ros)水平两者的差异影响，从而对使用cbx观察到的选择性根除有贡献。
图56证实了甘珀酸(cbx)在白血病细胞中选择性诱导脂质损伤和双链dna断裂。如图56中所示，用200μμcbx处理各种不同的持续时间(1、2、4或8小时)引起对脂质损伤的差异影响，正如由在白血病细胞中观察到的氧化脂质与非氧化脂质的比率提高所证实的。同样地，用200μμcbx处理各种不同的持续时间(1、2、4或8小时)引起对dna损伤的差异影响，正如由在白血病细胞中观察到的γh2ax磷酸化的比率提高所证实的。
图57证实了被鉴定为cbx-1、cbx-2和cbx-3的甘珀酸衍生物化合物的变化的浓度，也证实了在离体测定法中相对于对照化合物的选择性抗白血病活性。
图58a-58b证实了cbx处理在白血病细胞中诱导凋亡，但在正常骨髓单核细胞(图58a)和正常髓系祖细胞(图58b)中不能诱导凋亡。
图59证实了cbx在小鼠中引起对引发白血病的细胞相对于正常集落形成细胞的差异影响。
图60a-60b说明了甘珀酸(cbx)选择性根除白血病细胞并延长存活期。图60a示出了用介质对照(第9-21天)、诱导化疗(ict，第9-13天)、单独的cbx(第9-21天)或组合治疗(ict+cbx)治疗的小鼠的存活百分率。*p<0.02。图60b示出了cbx杀死人类白血病细胞并同时放过正常pb-mnc。将细胞与cbx(0μμ-300μμ)温浴16h，并通过facs进行分析以确定存活率。数据概述了3个独立实验的三份平行样(n＝9/细胞系/浓度)。
图61a-61d说明了在人类和小鼠白血病细胞中甘珀酸(cbx)阻断线粒体呼吸。在人类细胞(图61a)和小鼠细胞(图61b)中稳态下的氧消耗速率的计算。超过4个样品的平均值。示出了在人类细胞(图61c)和小鼠细胞(图61d)中，在pbs或cbx注射之前和之后的氧消耗速率。箭头指示化合物注射的时间(正如所指示的)。在试验的所有人类和小鼠细胞系中记录到相似的结果。
图62a-62b比较了正常细胞(图62a)和白血病细胞(图62b)中的线粒体应激和甘珀酸(cbx)的效应。箭头指示自动化合物注入(由seahorse软件操作)的时间。绿色线和绿色图例描绘了线粒体应激测定法，蓝色线描绘了pbs注入，红色线描绘了cbx注入。超过4个样品的平均值。使用试验的所有人类和小鼠白血病细胞记录到相似的结果。寡霉素：atp合成酶(复合体v)抑制剂。用于测量多少氧气正被atp生产消耗，并且用于测量最大糖酵解能力。fccp：h+离子载体(解偶联试剂)。用于测量最大线粒体呼吸能力。抗霉素：复合体iii抑制剂。用于阻断线粒体呼吸。
图63a-63c说明了甘珀酸(cbx)处理在白血病细胞中但不在正常细胞中诱导氧化应激介导的细胞死亡。图63a示出了超氧化物水平(mitosoxred线粒体超氧化物指示物)的测量。图63b示出了过氧自由基水平的测量(bodipy581/591c11；传感器上的脂质过氧化物)。图63c描绘了γη2αx的磷酸化(双链dna断裂指示物)。
图64a-64b证实了甘珀酸(cbx)在人类白血病细胞中诱导ca2+内流(图64b)，但在正常人类pb-mnc细胞中不诱导ca2+内流(图64a)。线粒体应激(atp合成酶抑制剂、h+离子载体和复合体iii抑制剂)不诱导显著的ca2+内流。箭头指示化合物注入时间。绿色线和绿色图例描绘了线粒体应激测定法，蓝色线描绘了pbs注入，红色线描绘了cbx注入。使用试验的所有人类白血病细胞系记录到相似的结果。
图65a-65c证实了在体内由甘珀酸(cbx)诱导的选择性抗白血病活性。图65a描绘了诱导化疗(ict)方案，这是当前的标准治疗，而图65b在白血病细胞中比较了ict和cbx。图65c证实了cbx根除白血病细胞并支持正常髓系细胞的补充。
图66证实了cbx在实体肿瘤细胞系中的活性。与正常bm基质细胞系(hs-5)相比，试验的所有实体肿瘤细胞系都表现出对cbx处理更高的敏感性(24小时体外温浴)。具体来说，cbx在100μμ下高效根除黑素瘤细胞(a375，蓝色箭头)。将细胞与浓度逐渐提高的cbx(0μμ-400μμ)温浴24小时。通过流式细胞术分析为终点细胞存活率评分。
发明详述
本公开涉及下述发现，即某些药剂(例如甘草次酸衍生物)可有效地用于根除群体或对象中的白血病细胞，而不根除所述对象中的正常细胞或在某些情况下仅仅最低限度地根除所述对象中的正常细胞。因此，本公开涵盖了将一种或多种药剂(例如甘草次酸衍生物)使用在根除白血病细胞的方法、组合物和试剂盒中以及在用于治疗急性髓性白血病的相关方法、组合物和试剂盒中。
根除白血病细胞
在某些情况下，本文公开了用于根除细胞群体中的白血病细胞的方法。这些方法尤其可用于治疗白血病(例如急性髓性白血病)。在一个实施方式中，根除细胞群体中的白血病细胞包括将所述细胞群体与有效量的药剂或间隙连接阻断剂相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。
应该认识到，所述白血病细胞可以在暴露到本文描述的药剂或与所述药剂接触后通过各种不同机制被根除。在某些实施方式中，所述药剂选择性诱导白血病细胞的凋亡。在某些情况下，本文公开的药剂(例如甘珀酸及其类似物或衍生物)可以通过在白血病细胞中选择性诱导氧化应激、引起对脂质损伤的差异影响、和/或引起对dna损伤的差异影响，来根除这些白血病细胞。
在某些实施方式中，根除白血病细胞包括诱导程序化细胞死亡。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括诱导凋亡。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括如本文所述诱导所述白血病细胞分化成非白血病细胞。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括诱导所述白血病细胞分化成粒细胞。在某些实施方式中，所述粒细胞包括嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，白血病细胞在与本文描述的药剂或间隙连接阻断剂接触后，通过诱导所述白血病细胞(例如人类的)分化成cd66b+/cd14-嗜中性粒细胞而被根除。
在其他实施方式中，根除白血病细胞包括破坏涉及所述白细胞细胞的促进白血病细胞存活的细胞间通讯。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括破坏涉及所述白血病细胞为白血病细胞提供耐药性的细胞间通讯。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞之间的同型相互作用。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞与基质细胞之间的异型相互作用。在某些实施方式中，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯包括干扰白血病细胞与任何其他细胞类型(例如间质基质细胞、骨系细胞、内皮细胞、周细胞、间质细胞或其他造血细胞)之间的异型相互作用。在某些实施方式中，根除白血病细胞包括克服基质介导的耐药性(例如对癌症治疗例如诱导化疗的耐药性)。
在某些情况下，破坏涉及白血病细胞的细胞间通讯引起所述白血病细胞分化成非白血病细胞，从而根除所述细胞。
在某些实施方式中，白血病细胞被选择性根除，同时诱导所述细胞群体中正常白细胞的增殖。例如，将急性髓性白血病细胞群体与本文描述的间隙连接阻断剂相接触，选择性根除所述急性髓性白血病细胞，同时诱导所述群体中正常白细胞的增殖。
本领域技术人员应该认识到，本文描述的组合物和方法优选地选择性影响所述细胞群体中的白血病细胞而不影响正常细胞(例如白细胞)。在某些实施方式中，白血病细胞被选择性根除，而不根除或者在某些情况下最低限度地根除所述细胞群体中的正常白细胞。例如，所述白血病细胞被选择性根除，而不根除或者在某些实施方式中最低限度地根除正常骨髓白细胞或正常外周血白细胞，包括但不限于干细胞和祖细胞、骨髓单核细胞、成髓细胞、嗜中性粒细胞、nk细胞、巨噬细胞、粒细胞、单核细胞和谱系-/ckit+/sca1+(lks)细胞。在某些实施方式中，细胞群体中白血病细胞的量或活性被选择性降低，而不降低所述群体中正常白细胞的量或活性。在某些实施方式中，细胞群体中白血病细胞的增殖被选择性抑制，而不抑制所述群体中正常白细胞的增殖。在某些实施方式中，本文描述的组合物和方法可用于通过选择性降低细胞群体中白血病细胞的数目、活性和/或增殖，来提高所述细胞群体中正常白细胞的数目。不希望受到理论限制，预期在任何特定细胞群体中被根除、减少或抑制的白血病细胞的量与所述细胞群体暴露到的所述药剂或间隙连接阻断剂的浓度成正比。在某些情况下，通过暴露到间隙连接阻断剂或与间隙连接阻断剂相接触，所述细胞群体中至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或多达100％的白血病细胞被根除、减少或抑制。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少20％的白血病细胞被根除、减少或抑制。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少50％的白血病细胞被根除、减少或抑制。在某些实施方式中，所述细胞群体中至少70％的白血病细胞被根除、减少或抑制。在某些实施方式中，所述细胞群体中所有的白血病细胞被根除、减少或抑制。
本发明涵盖了通过将细胞群体与间隙连接阻断剂相接触或将所述细胞群体暴露到间隙连接阻断剂，来选择性根除任何白血病细胞。在某些实施方式中，所述白血病细胞包括来自于急性髓性白血病细胞系的白血病细胞。示例性的急性髓性白血病细胞系包括但不限于mll-af9细胞、mll-enl细胞、nup98-hoxa9细胞、aml1-et09a细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、thp1细胞、hl60细胞、hoxa9/meis1细胞和nb-4细胞。
应该认识到，细胞群体中白血病细胞的选择性根除意味着所述群体中的白血病细胞被根除，而不根除或不以其他方式影响所述群体中的其他正常细胞。在某些实施方式中，细胞群体中白血病细胞的选择性根除意味着所述群体中的白血病细胞被根除，并且对所述群体内的其他正常细胞具有最低限度的根除或具有有限的不利影响。在某些实施方式中，细胞群体中白血病细胞的选择性根除意味着所述群体中的白血病细胞被根除，同时正常细胞群体被扩增。在某些实施方式中，所述细胞群体包含原代白细胞，例如骨髓白细胞和外周血白细胞。这些原代白细胞的实例包括但不限于干细胞和祖细胞、单核细胞、成髓细胞、嗜中性粒细胞、nk细胞、巨噬细胞、粒细胞、单核细胞和谱系-/ckit+/sca1+(lks)细胞。
应该认识到，符合本发明的用途的药剂(例如甘草次酸衍生物或间隙连接阻断剂)的有效量可以随着例如所使用的药剂或间隙连接阻断剂及其使用位置而变，在某些实施方式中，在体外使用的所述药剂(例如甘草次酸衍生物或间隙连接阻断剂)的有效量包括在50μμ至400μμ范围内的浓度。在某些实施方式中，在体内使用的所述药剂或间隙连接阻断剂的有效量包括在10mg/kg至100mg/kg范围内的浓度。在某些实施方式中，所述有效量包括25mg/kg的浓度。在某些实施方式中，所述有效量包括50mg/kg的浓度。在某些实施方式中，所述有效量包括75mg/kg的浓度。
在某些实施方式中，所述接触在体外或离体进行。
在某些实施方式中，所述接触在体内进行。在某些实施方式中，所述体内接触是在本文所描述的对象中。
促进白血病细胞分化成非白血病细胞
本公开还提供了用于促进白血病细胞分化成非白血病细胞的方法。这些方法可用于治疗白血病，例如急性髓性白血病。
在一种情况下，促进白血病细胞分化成非白血病细胞的方法包括将白血病细胞与有效量的药剂(例如间隙连接阻断剂)相接触，从而促进所述白血病细胞分化成非白血病细胞。
本公开涵盖了按照本文中描述的方法将任何白血病细胞分化成非白血病细胞。在某些实施方式中，所述白血病细胞包含白血病干细胞或祖细胞。在某些实施方式中，所述白血病干细胞或祖细胞包含急性髓性白血病细胞。在某些实施方式中，所述急性髓性白血病细胞包含选自mll-af9细胞、mll-enl细胞、nup98-hoxa9细胞、aml1-et09a细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、thp1细胞、hoxa9/meis1细胞和nb-4细胞的细胞系。
应该认识到，所述分化的白血病细胞可以分化成不同阶段的非白血病细胞。在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含成熟的或终末分化细胞。在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含粒细胞。在某些实施方式中，所述粒细胞包含短寿命粒细胞。在某些实施方式中，所述非白血病细胞包含嗜中性粒细胞。在某些实施方式中，所述嗜中性粒细胞包含cd66b+/cd14-嗜中性粒细胞。
治疗方法
本公开涵盖了利用包含本文中描述的间隙连接阻断剂和/或药剂的组合物和试剂盒的各种不同的治疗方法。本公开涵盖了其中通过间隙连接或半通道的细胞间通讯或相互作用在促进恶性或肿瘤细胞的存活中发挥作用或其中通过间隙连接或半通道的细胞间通讯或相互作用在疾病对治疗或疗法的耐受中发挥作用的任何疾病的治疗。本文描述的药剂和/或间隙连接阻断剂可用于治疗和/或预防这些疾病。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂选择性根除其中通过间隙连接或半通道的细胞间通讯或相互作用在疾病对治疗或疗法的耐受中发挥作用的恶性或肿瘤细胞(例如血细胞)。在某些情况下，本文公开的药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)可以通过在这些白血病细胞中选择性诱导氧化应激、引起对脂质损伤的差异效果、和/或引起对dna损伤的差异效果，来根除白血病细胞。
在某些情况下，本公开提供了一种在需要的对象中治疗白血病(例如急性髓性白血病)的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的本文描述的间隙连接阻断剂或药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)，从而在所述对象中治疗白血病(例如急性髓性白血病)。
在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂选择性根除白血病细胞，而不根除或最低限度地根除所述对象中的正常细胞。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在所述对象中选择性根除白血病细胞，而不根除或最低限度地根除所述对象中的正常白细胞。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在所述对象中选择性根除白血病细胞，同时在所述对象中诱导正常白细胞的增殖。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在所述对象中选择性根除白血病细胞，同时在所述对象中诱导正常白细胞的补充。当然，所述药剂和/或间隙连接阻断剂可以选择性根除白血病细胞而不根除或最低限度地根除正常白细胞，同时在所述对象中诱导正常白细胞的增殖和/或补充。
在某些实施方式中，所述方法还包括对所述对象实施诱导化疗治疗方案。本公开涵盖了实施可用于在对象中引起急性髓性白血病的完全缓解的任何诱导化疗治疗方案。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药抗代谢药剂(例如阿糖胞苷)和蒽环类药剂(例如多柔比星)。在某些实施方式中，所述抗代谢药剂包括阿糖胞苷。所述诱导化疗治疗方案可以在数小时、数天或数月的时间段中实施到所述对象。在所述诱导化疗治疗方案中使用的化学治疗剂可以在整个所述时间段中相同的时间给药，或者在所述时间段内以不同的时间间隔给药。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药阿糖胞苷和多柔比星为期5天。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药阿糖胞苷和多柔比星为期3天，然后向所述对象单独给药阿糖胞苷为期2天。
所述药剂和/或间隙连接阻断剂可以在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前、在对所述对象实施诱导化疗治疗方案的同时、在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之后给药到所述对象，或上述情况的任何组合。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药至少一天。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在与所述药剂和/或间隙连接阻断剂相伴地对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前，向所述对象给药至少一天。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或长达至少一周。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少2周、至少3周或至少一个月。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或长达至少一周，然后与所述间隙连接阻断剂相伴地对所述对象实施所述诱导化疗方案至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少2周、至少3周或至少一个月。在某些实施方式中，所述药剂和/或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或长达至少一周，然后与所述药剂和/或间隙连接阻断剂相伴地对所述对象实施所述诱导化疗方案至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少2周、至少3周或至少一个月，然后停止所述诱导化疗方案的实时并同时继续向所述对象给药所述药剂和/或间隙连接阻断剂至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少2周、至少3周或至少一个月。在某些实施方式中，将所述药剂和/或间隙连接阻断剂向所述对象给药至少2天，然后与或不与所述药剂和/或间隙连接阻断剂的给药相伴地对所述对象实施包含100mg/kg阿糖胞苷+3mg/kg多柔比星的诱导化疗治疗方案3天，然后与或不与所述间隙连接阻断剂相伴地在不存在多柔比星的情况下进行使用100mg/kg阿糖胞苷的化疗2天，然后向所述对象给药所述药剂和/或间隙连接阻断剂2周(14天)。在某些实施方式中，将cbx向所述对象给药至少2天，然后与或不与给药cbx相伴地对所述对象实施包含100mg/kg阿糖胞苷+3mg/kg多柔比星的诱导化疗治疗方案3天，然后与或不与cbx相伴地在不存在多柔比星的情况下进行使用100mg/kg阿糖胞苷的化疗2天，然后向所述对象给药cbx2周(14天)。在某些实施方式中，本文中描述的cbx或间隙连接阻断剂的给药包括在一段时间内向所述对象给药升高的和间歇的浓度或剂量的cbx或间隙连接阻断剂。例如，cbx或间隙连接阻断剂可以以10mg/kg给药至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少一周，然后在不存在cbx或所述间隙连接阻断剂给药的情况下至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少1周，然后给药20mg/kg至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少一周，然后在不存在cbx或所述间隙连接阻断剂给药的情况下至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天或至少1周，然后给药30mg/kg至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少一周。应该认识到，在一开始和在治疗间歇后以连续的时间间隔给药的cbx或间隙连接阻断剂的浓度或剂量可以变化，并且在治疗间隔之间所述浓度或剂量也可以升高。例如，cbx或间隙连接阻断剂的初始剂量或浓度可以为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg或更高，并且在间隔之间的浓度或剂量的升高可以是5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg,或25mg/kg。此外，逐渐升高的和间歇的浓度或剂量的cbx或间隙连接阻断剂可以在各种不同的治疗间隔内给药，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10天或需要的天数，直至所述对象进入缓解期，以保持所述对象缓解或进一步延长所述患者的存活期，例如通过使所述患者进入缓解期或阻止所述患者从缓解复发。在某些实施方式中，取决于所述对象中的疾病过程，所述治疗和来自于治疗间隔的间歇期可以超过一周，例如2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。当对象处于疾病的终末状态，例如当白血病细胞扩散到遍及对象整个身体时，可以使用上面提到的升高的和间歇的浓度或剂量日程表，以延长所述对象的存活时间。
当在本文中使用时，“治疗”或“改善”当用于指称疾病、障碍或医学病症时，是指病症的治疗性治疗，其中目标是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的发展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓解病症的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物降低，治疗通常是“有效的”。或者，如果病症的进展被减轻或停止，治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括在不存在治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止或至少减缓。有益或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、缺陷程度的降低、例如急性髓性白血病的状态稳定(即不恶化)、急性髓性白血病的进展的延迟或减缓，以及与在不存在治疗的情况下所预期的相比增加寿命。
在某些实施方式中，治疗急性髓性白血病包括在对象中引起急性髓性白血病的完全缓解。在某些实施方式中，在所述急性髓性白血病患者中引起完全缓解之后，向所述患者给药所述药剂和/或间隙连接阻断剂至少一天。在某些实施方式中，在所述急性髓性白血病患者中引起完全缓解之后，向所述患者给药所述药剂和/或间隙连接阻断剂至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少1个月、至少2个月、至少3个月或更长时间。
在某些实施方式中，治疗急性髓性白血病包括在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解，而不存在由所述对象的骨髓或外周血中残留的白血病细胞造成的复发风险。
在某些实施方式中，所述方法还包括评估所述对象以确定所述对象是否患有难治性或复发性急性髓性白血病。
在某些情况下，本发明提供了一种提升患有急性髓性白血病的对象的存活的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的药剂和/或间隙连接阻断剂，从而提升所述对象的存活。所述方法考虑到了本文中描述的任何间隙连接阻断剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包括11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂包括甘珀酸或其类似物。
在某些实施方式中，所述方法还包括对所述对象实施诱导化疗治疗方案。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述抗代谢药剂包括阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述蒽环类药剂包括多柔比星。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述对象给药阿糖胞苷和多柔比星为期5天。在某些实施方式中，所述诱导化疗包括向所述患者给药阿糖胞苷和多柔比星为期3天，然后向所述患者单独给药阿糖胞苷为期2天。应该认识到，本文中描述的任何给药或剂量日程表和/或治疗方案都可用于所述方法。
在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前给药到所述对象至少一天。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂在与所述药剂或间隙连接阻断剂相伴地对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前给药到所述对象至少一天。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括使所述对象经历高压氧疗法(hbot)。高压氧疗法(hbot)是提供处于高压(高于海平面，1ata)下的100％氧气。hbot提高血浆氧饱和度，不依赖于血红蛋白o2饱和度促进氧气向组织的递送(gill&bell(2004)，“高压氧：其用途、作用机制和结果”(hyperbaricoxygen:itsuses,mechanismsofactionandoutcomes)，qjm.2004jul；97(7):385-95)。在某些实施方式中，所述对象被给药甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)并经历hbot。不受理论限制，假设甘珀酸的选择性抗癌(例如抗白血病)效果由具有提高的氧消耗速率的癌细胞(例如白血病细胞)中改变的细胞代谢所介导。因此，通过hbot用氧气饱和对象的血液和组织可以增强甘珀酸的抗癌效果。hbot可以在甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)给药之前、期间或之后开始，只要所述对象在甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)存在于所述对象中的至少一部分时间内表现出血液和/或组织内升高的氧水平即可。在某些实施方式中，hbot在约1.0ata至3.0ata、在另一个实施方式中约1.5ata至2.75ata、在另一个实施方式中约2.0ata至2.5ata的压力下进行。每次治疗的时间可以在约1至120分钟、在另一个实施方式中约30至110分钟、在另一个实施方式中约45至100分钟之间变化。
在某些实施方式中，所述方法还包括选择患有或表现出急性髓性白血病的终末状态的对象。在某些实施方式中，所述对象具有晚期肿瘤转移。在某些实施方式中，所述对象具有高肿瘤负荷。
“存活”是指所述对象仍然活着，并包括总体存活以及无进展存活。“总体存活”是指所述对象从诊断或治疗之时起仍然活了一段确定的时间，例如1年、2年、3年、4年、5年等。
“无进展存活”是指所述对象在所述急性髓性白血病没有发展或变得更糟的情况下仍然活着。
“提升存活”是指相对于未治疗对象(即没有用间隙连接阻断剂例如甘珀酸治疗的对象)或相对于在没有给药间隙连接阻断剂(例如多柔比星)的情况下单独用批准的化学治疗剂治疗的对象，在治疗的对象中增强存活的一个或多个方面。在某些实施方式中，与没有接受所述间隙连接阻断剂的情况下所述对象的存活期相比，所述间隙连接阻断剂增加了所述对象的存活期。在某些实施方式中，与没有接受所述间隙连接阻断剂的情况下所述对象存活的可能性相比，所述间隙连接阻断剂提高了所述对象存活的可能性。在某些实施方式中，相对于没有给药所述间隙连接阻断剂的情况下对象的总体存活时间和/或与单独的化学治疗相比，向所述对象给药所述间隙连接阻断剂(例如cbx)将所述对象的总体存活时间提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高。在某些实施方式中，相对于没有给药所述药剂或间隙连接阻断剂的情况下对象的总体存活时间和/或与单独的化学治疗相比，向所述对象给药所述间隙连接阻断剂(例如cbx)将所述对象的总体存活时间增加至少1.1倍、至少1.2倍、1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍或更多倍。在某些实施方式中，相对于没有给药所述药剂或间隙连接阻断剂的情况下对象的总体存活时间和/或与单独的化学治疗相比，向所述对象给药所述间隙连接阻断剂(例如cbx)将所述对象的存活时间增加1天、5天、10天、30天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、30个月、3年、40个月、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年、25年、30年、35年、40年、50年、55年、60年、65年、70年或75年或更长时间。
一方面，本公开提供了一种在患有复发性或难治性急性髓性白血病的患者中通过选择性根除所述对象中的白血病细胞而引起完全缓解的方法，所述方法包括：(a)评估所述对象以确定所述对象是否患有复发性或难治性急性髓性白血病；(b)在对所述对象实施诱导化疗治疗方案之前向所述对象给药药剂或间隙连接阻断剂至少一天；以及(c)对所述对象实施包含抗代谢药剂和蒽环类药剂的诱导化疗治疗方案历时规定的时间长度，从而通过选择性根除所述对象中的白血病细胞在所述对象中引起完全缓解。
尽管本发明的某些情况涉及白血病细胞的选择性根除，但应该理解，本文公开的组合物和方法的效能不限于白血病细胞，而是广泛扩展到所有癌细胞类型。在某些情况下，所述癌症选自实体肿瘤和非实体肿瘤。例如，在某些实施方式中，本文公开的发明涉及根除细胞群体中的癌细胞的方法，所述方法包括将所述细胞群体与有效量的甘草次酸衍生物(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)相接触，从而根除所述细胞群体中的白血病细胞。
在某些实施方式中，所述癌细胞包括白血病细胞。在某些实施方式中，所述癌细胞包括乳腺癌细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括黑素瘤细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括前列腺癌细胞。在其他实施方式中，所述癌细胞包括宫颈癌细胞。
在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物可用于治疗下述一种或多种癌症：结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，前列腺癌；口腔和咽、食道、胃、小肠、大肠、结肠、直肠、肝和胆管的癌症；胰腺、骨骼、结缔组织、皮肤、宫颈、子宫、子宫内膜、睾丸、膀胱、肾和其他泌尿组织的癌症；眼、脑、脊髓和脑膜的癌症，包括成胶质细胞瘤；甲状腺和其他内分泌腺的癌症；霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤；腺癌，血管肉瘤，星形细胞瘤，听神经瘤，间变性星形细胞瘤，基底细胞癌，成胶质细胞瘤，软骨肉瘤，绒膜癌，脊索瘤，颅咽管瘤，皮肤黑素瘤，囊腺癌，内皮肉瘤，胚胎性癌，室管膜瘤，尤因瘤，上皮癌，纤维肉瘤，胃癌，泌尿生殖道癌症，多形性成胶质细胞瘤，头颈癌，成血管细胞瘤，肝细胞癌，肝细胞瘤，卡波斯肉瘤，大细胞癌，平滑肌肉瘤，白血病，脂肪肉瘤，淋巴系统癌症，淋巴瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，甲状腺髓样癌，成髓细胞瘤，脑膜瘤，间皮瘤，骨髓瘤，粘液肉瘤，成神经细胞瘤，神经纤维肉瘤，少突胶质细胞瘤，骨源性肉瘤，上皮性卵巢癌，乳头状瘤，乳头状腺癌，副神经节瘤，甲状旁腺肿瘤，嗜铬细胞瘤，松果体瘤，浆细胞瘤，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，皮脂腺癌，精原细胞瘤，皮肤癌，黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，鳞状细胞癌，汗腺癌，滑膜瘤，甲状腺癌，葡萄膜黑素瘤和肾母细胞瘤。
对象
当在本文中使用时，“对象”意味着人类或动物。通常，所述动物是脊椎动物例如灵长动物、啮齿动物、驯养动物或狩猎动物。灵长动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猿和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔和仓鼠。驯养和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物例如家猫、犬科动物例如狗、狐狸、狼、禽类例如鸡、鸸鹋、鸵鸟和鱼类例如例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或对象包括上述动物的任何子集，例如所有上述动物，但排除一个或多个组或物种例如人类、灵长动物或啮齿动物。在某些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如灵长动物，例如人类。术语“患者”和“对象”在本文中可互换使用。在某些实施方式中，所述对象患有癌症。在某些实施方式中，所述对象患有急性髓性白血病。
在某些实施方式中，所述对象是表现出白血病的患者，例如选自急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、急性成淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)的白血病。在某些实施方式中，所述白血病是急性髓性白血病。当在本文中使用时，“急性髓性白血病”涵盖了符合世界卫生组织(who)髓系肿瘤和急性白血病分类的所有形式的急性髓性白血病和相关肿瘤，包括处于复发或难治状态的所有下述子群：具有复发性遗传异常的急性髓性白血病，例如具有t(8；21)(q22；q22)的aml；runx1-runx1t1，具有inv(16)(p13.1q22)或t(16；16)(p13.1；q22)的aml；cbfb-myh11，具有t(9；11)(p22；q23)的aml；mllt3-mll，具有t(6；9)(p23；q34)的aml；dek-nup214，具有inv(3)(q21；q26.2)或t(3；3)(q21；q26.2)的aml；rpn1-evi1，具有t(1；22)(p13；q13)的aml(成巨核细胞性)；rbm15-mkl1，具有突变的npm1的aml，具有突变的cebpa的aml；具有与脊髓异常增生相关的变化的aml；与疗法相关的髓系肿瘤；未另行说明的aml，例如具有极小分化的aml，没有成熟的aml，成熟的aml，急性骨髓单核细胞性白血病，急性成单核细胞/单核细胞性白血病，急性红细胞性白血病(例如纯红细胞性白血病、红白血病、红细胞性/髓性)，急性成巨核细胞白血病，急性嗜碱性粒细胞白血病，具有骨髓纤维化的急性全骨髓增生；髓系肉瘤；与唐氏综合征相关的髓系增殖例如短暂异常骨髓形成或与唐氏综合征相关的髓性白血病；以及成浆细胞性树突状细胞肿瘤。
在某些实施方式中，本文描述的方法还包括在例如表现出的症状的基础上选择被诊断为患有急性髓性白血病的对象。与急性髓性白血病相关的症状对于专业从业人员来说是已知的。例如，如果对象在外周血或骨髓中表现出具有20％或更多胚细胞的髓系肿瘤，则所述患者可以被诊断为患有急性髓性白血病。
在某些实施方式中，本文描述的方法还包括选择具有发生急性髓性白血病的风险的对象。例如，对象可以在白血病家族史的基础上被选择为具有发生白血病的风险。
在某些实施方式中，在可用作髓系肿瘤的诊断或预后标志物的遗传突变的基础上选择被诊断为患有急性髓性白血病或具有发生急性髓性白血病的对象。示例性的这些标志物包括下述突变：mpn中的jak2、mpl和kit；mds/mpn中的nras、kras、nf1和ptpn11；aml中的npm1、cebpa、flt3、runx1、kit、wt1和mll；以及与唐氏综合征相关的髓系增殖中的gata1(参见vardiman等，“世界卫生组织髓系肿瘤和急性白血病分类2008年修订版：理论基础和重要变化”(the2008revisionoftheworldhealthorganization(who)classificationofmyeloidneoplasmsandacuteleukemia:rationaleandimportantchanges)，blood114(5),937-951(2009)，其整体通过参考并入本文)。
在某些实施方式中，本文描述的方法还包括选择怀疑患有急性髓性白血病的对象。怀疑患有急性髓性白血病的对象可以例如在家族史、诊断测试的基础上或在呈现的症状或其组合的基础上选择。
在某些实施方式中，本文描述的方法还包括选择患有难治性或复发性急性髓性白血病的对象。当在本文中使用时，“复发性急性髓性白血病”被定义为在完全缓解后不可归因于任何其他原因的血液中白血病胚细胞的重新出现或骨髓中超过5％的胚细胞。对于表现出复发性aml的对象来说，要求在基线骨髓评估时胚细胞超过5％。当在本文中使用时，“难治性急性髓性白血病”被定义为在以前的疗法后未能实现完全缓解或实现具有不完全血液恢复的完全缓解。允许使用任何现有的抗白血病计划表。当在本文中使用时，“完全缓解”被定义为在形态上无白血病的状态(即根据形态学判据骨髓具有少于5％的胚细胞并且没有棒状小体(auerrod)，没有髓外白血病的迹象)，绝对嗜中性粒细胞计数大于或等于1,000/μl，并且血小板超过100,000/μl。当在本文中使用时，“具有不完全血液恢复的完全缓解”被定义为在形态上无白血病的状态(即根据形态学判据骨髓具有少于5％的胚细胞并且没有棒状小体，没有髓外白血病的迹象)，并且血液中嗜中性粒细胞计数小于1,000/μl或血小板少于100,000/μl。
在某些实施方式中，本文描述的方法还包括选择从接受诱导化疗治疗方案后急性髓性白血病的完全缓解复发的对象。
在某些情况下，本文公开的方法和组合物可用于治疗患有白血病的对象，例如选自急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、急性成淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)的白血病。
药物组合物
本公开涵盖了包含本文中描述的间隙连接阻断剂和/或药剂(例如至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂)的组合物。
在某些情况下，本公开提供了一种药物组合物，其包含有效量的间隙连接阻断剂和有效量的本文中所描述的至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂。
在某些实施方式中，药物组合物包含有效量的药剂或间隙连接阻断剂、有效量的至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物包括有效量的用于高血压、低钾血和/或水肿的预防性治疗。
所述包含所述药剂或间隙连接阻断剂和至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂的组合物可用于治疗本文中所描述的急性髓性白血病。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对象中选择性根除白血病细胞而不根除所述对象中的正常白细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于在对象中选择性根除白血病细胞，并且最低限度地根除所述对象中的正常白细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于选择性根除对象中的白血病细胞，而不根除所述对象中的正常细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于选择性根除对象中的白血病细胞，并且最低限度地根除所述对象中的正常细胞。在某些实施方式中，所述组合物可用于选择性根除所述对象中的白血病细胞，同时在所述对象中引起正常白细胞的增殖。在某些实施方式中，所述组合物可用于在所述对象中引起白血病的完全缓解。在某些实施方式中，所述组合物可用于在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解。在某些实施方式中，所述组合物可用于在所述对象中引起急性白血病的完全缓解，而没有由所述对象的骨髓或外周血中残留的白血病细胞造成的复发风险。
配制物和给药
本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂可以单独地或与适合的药物载体一起给药，并且可以采取固体或液体形式例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬液或乳液。当在本文中使用时，术语“给药”是指通过引起药剂在所需位点处至少部分集中的方法或途径将所述药剂放置在对象中。本文中描述的间隙连接阻断剂或药剂可以通过在所述对象中引起有效治疗的任何适合的途径给药，即给药引起递送到所述对象中的所需位置，至少一部分所述组合物被递送到所述所需位置。对于药物递送策略的详尽综述，参见ho等，curr.opin.mol.ther.(1999),1:336-3443；groothuis等，j.neurovirol.(1997),3:387-400；以及jan，药物递送系统：技术和商业机会(drugdeliverysystems:technologiesandcommercialopportunities)，decisionresources，1998，其内容都通过参考并入本文。本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂(例如cbx)的示例性给药途径包括但不限于静脉内给药例如快速浓注或通过在一段时间内连续输注，肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入途径。所述间隙连接阻断剂和/或药剂可以配制在可药用组合物中，所述组合物包含与一种或多种可药用载体(添加剂)和/或稀释剂或赋形剂配配制在一起的治疗有效量的所述药剂。所述配制物可以方便地以单元剂型存在，并且可以通过药物学领域中公知的任何方法来制备。技术、赋形剂和配制物通常可以在例如《remington制药学》(remington'spharmaceuticalsciences)，mackpublishingco.,easton,pa.1985，第17版，nema等，pdaj.pharm.sci.tech.199751:166-171中找到。
在某些实施方式中，本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂可以被包封在纳米粒子(例如脂质纳米粒子)内给药。在某些实施方式中，本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂可以被包封在脂质体内给药。这些脂质体的制造和分子在这些脂质体中的插入在本领域中是公知的，例如在美国专利号4,522,811中所描述的。脂质体悬液(包括靶向特定细胞例如内皮细胞的脂质体)也可用作可药用载体。
间隙连接阻断剂和/或药剂可以与其他药物活性剂相组合给药到对象。示例性的药物活性剂包括但不限于在下述文献中找到的：《harrison内科学原理》(harrison'sprinciplesofinternalmedicine)，第13版，t.r.harrison等主编，mcgraw-hilln.y.,ny；《医生桌面参考》(physician'sdeskreference)，第50版，1997，oradellnewjersey，medicaleconomicsco.；《治疗剂的药理基础》(pharmacologicalbasisoftherapeutics)，第8版，goodmanandgilman，1990；《美国药典》(unitedstatespharmacopeia)，thenationalformulary，uspxiinfxvii，1990，它们的完整内容都通过参考并入本文。在某些实施方式中，所述药物活性剂是用于急性髓性白血病的常规治疗。在某些实施方式中，所述药物活性剂是用于自体免疫或炎性病症的常规治疗。本文描述的间隙连接阻断剂(例如cbx)的长期皮下给药，在不存在预防性治疗的情况下，可以提高有害副作用的频率，例如作为以高血压、低钾血和水肿(例如胃水肿)为特征的假性高醛甾酮症的结果。因此，在某些实施方式中，所述药物活性剂包含预防性治疗，以例如治疗或预防由间隙连接阻断剂(例如cbx)的给药引起的高血压、低钾血、水肿和其他有害副作用。在某些实施方式中，这些药物活性剂包括抗盐皮质激素或醛甾酮抑制剂例如醛甾酮受体拮抗剂，例如依普利酮或螺内酯。在某些实施方式中，这些药物活性剂包括血管紧张肽转化酶(ace)抑制剂或其他利尿药物，例如噻嗪类利尿药例如氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺、氢氯噻嗪、甲氯噻嗪、美托拉宗；环利尿药，例如布美他尼、呋塞米、依他尼酸盐和托拉塞米；保钾利尿药，例如盐酸阿米洛利、螺内酯和氨苯蝶啶；碳酸酐酶抑制剂，例如乙酰唑胺、醋甲唑胺；以及渗透压利尿药，例如甘油、异山梨醇、甘露糖醇iv和脲。专业技术人员能够在他们的专长、知识和经验的基础上，使用上面提到的参考文献，选择适合的常规药物活性剂用于治疗任何特定疾病或疾病亚型。
所述药剂和所述其他药物活性剂可以在相同药物组合物中或在不同药物组合物中(同时或不同时)被给药到所述对象。例如，可以将间隙连接阻断剂和至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂配制在同一组合物中或不同组合物中。
所述药物组合物可以与给药的用法指南一起被包含在容器、包装或施药器中。
当在本文中使用时，“有效量”或“治疗有效量”意味着所述药剂(例如间隙连接阻断剂)的有效地选择性根除细胞群体或对象中的大多数或所有白血病细胞(例如干细胞或祖细胞)而不根除或最低限度地根除所述群体或对象中的正常细胞(例如骨髓或外周血白细胞)的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内。通常，治疗有效量可以随着对象的病史、年龄、状况、性别、所述对象中医学病症的严重性和类型以及在急性髓性白血病或自体免疫或炎性障碍中抑制病理过程的其他药剂的给药而变。
试剂盒
本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂可以被提供在试剂盒中。所述试剂盒包含(a)所述药剂，例如包含所述药剂的组合物，和(b)信息资料。所述信息资料可以是与本文中描述的方法和/或所述药剂在本文描述的方法中的用途相关的描述性、指导性、销售或其他资料。例如，所述信息资料描述将所述间隙连接阻断剂和/或药剂给药到对象用于治疗急性髓性白血病的方法。
所述信息资料可以包括以适合的方式，例如以适合的剂量、剂型或给药方式给药本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂的说明书。例如，由于它的快速起效的动力学，间隙连接阻断剂例如cbx在将约200μμ暴露于白血病细胞的数小时内诱导选择性凋亡。在每天三次服用100mg片剂的溃疡患者中，报道了相近的血浆cbx水平。因此，在某些实施方式中，本公开涵盖了给药有效量的间隙连接阻断剂(例如cbx)以获得约200μμ的血浆水平。在某些实施方式中，所述说明书推荐给药有效量的间隙连接阻断剂(例如cbx)以获得约200μμ的血浆水平。在某些实施方式中，所述说明书推荐每天三次口服给药作为包含100mg间隙连接阻断剂(例如cbx)的片剂而配制的间隙连接阻断剂。所述信息资料可以包括用于选择适合的对象例如人类，例如患有复发性或难治性急性髓性白血病的人类的说明书。所述试剂盒的信息资料的形式不受限制。在许多情况下，所述信息资料例如使用说明书以印刷品例如印刷的文字、图和/或照片例如标签或印单的形式提供。然而，所述信息资料也可以以其他格式提供，例如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录。在另一个实施方式中，所述试剂盒的信息资料是链接或联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、超链接、网址或电话号码，所述试剂盒的用户可以从而获得关于所述调节剂和/或其在本文描述的方法中的用途的实质性信息。当然，所述信息资料也可以以所述格式的任何组合来提供。
除了所述药剂或组合物之外，所述试剂盒可以包括其他成分，例如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂，和/或用于治疗本文描述的病症或障碍例如急性髓性白血病的第二种药剂。或者，所述其他成分可以被包含在所述试剂盒中，但在与所述药剂不同的组合物或容器中。在这样的实施方式中，所述试剂盒可以包括用于将所述药剂与所述其他成分混合或与所述其他成分一起使用所述间隙连接阻断剂的说明书。
本文描述的间隙连接阻断剂和/或药剂可以以任何形式例如液体、干燥或冷冻干燥形式提供。优选地，所述间隙连接阻断剂和/或药剂是基本上纯的和/或无菌的。当所述间隙连接阻断剂和/或药剂以液体溶液提供时，所述液体溶液优选为水性溶液，其中无菌水性溶液是优选的。当所述间隙连接阻断剂和/或药剂作为干燥形式提供时，通常通过添加适合的溶剂进行重构。所述溶剂例如无菌水或缓冲液，可以任选地被提供在所述试剂盒中。
所述试剂盒可以包括用于包含所述药剂的组合物的一个或多个容器。在某些实施方式中，所述试剂盒含有分开的容器、分隔物或区室，用于所述药剂(例如在组合物中)和信息资料。例如，所述药剂(例如在组合物中)可以被包含在瓶、管或注射器中，并且所述信息资料可以被包含在塑料套管或袋中。在其他实施方式中，所述试剂盒的分开的组件被包含在单一的未分隔的容器内。例如，所述药剂(例如在组合物中)被包含在粘附有采取标签形式的信息资料的瓶、管或注射器中。在某些实施方式中，所述试剂盒包括多个(例如一包)单独的容器，每个容器含有所述药剂(例如在组合物中)的一个或多个单元剂型(例如本文中描述的剂型)。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、铝箔袋或泡罩包装，各自含有所述药剂的单一单元剂型。所述试剂盒的容器可以是气密和/或防水的。
在某些情况下，试剂盒包含：间隙连接阻断剂，至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂，以及向患有急性髓性白血病的对象给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种化学治疗剂的说明书。
在某些实施方式中，所述说明书还包含用于给药作为所述对象的诱导化疗治疗方案的一部分的所述至少一种化学治疗剂的指导。
在某些实施方式中，所述说明书还包含用于给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂以在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解的指导。
在某些实施方式中，所述说明书还包含用于给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂，通过完全根除所述对象中的白血病细胞，以在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解而没有复发风险的指导。
在某些实施方式中，所述说明书还包含用于给药所述药剂或间隙连接阻断剂和所述至少一种治疗剂，通过诱导白血病细胞从增殖的、永生化的白血病细胞分化成短寿命的非白血病细胞以完全根除所述对象中的白血病细胞，在所述对象中引起急性髓性白血病的完全缓解的指导。
药剂
在某些情况下，并且不希望受到任何理论限制，本文公开的药剂(例如甘草次酸衍生物、甘珀酸或其类似物或衍生物)可以通过在白血病细胞中引起氧化应激、引起对脂质损伤的差异影响、和/或引起对dna损伤的差异影响，来根除这些白血病细胞。例如，如图55中所示，相对于正常细胞，在白血病细胞中甘珀酸处理引起对总活性氧物质水平和线粒体活性氧物质(ros)水平两者的差异影响，从而对在这些细胞与cbx接触后观察到的选择性根除有贡献。同样地，如图56中所证实的，甘珀酸处理引起对脂质损伤的差异影响(例如由在白血病细胞中观察到的氧化脂质与非氧化脂质的比率提高所证实的)并引起对dna损伤的差异影响(例如由在白血病细胞中观察到的γh2ax磷酸化的比率提高所证实的)。因此，在某些情况下，所述设想的药剂包括在白血病细胞中选择性引起氧化应激的任何药剂。在某些实施方式中，所述设想的药剂包括在白血病细胞中选择性引起脂质损伤的任何药剂。在其他实施方式中，所述设想的药剂包括在白血病细胞中选择性引起双链dna断裂的任何药剂。在某些实施方式中，所述药剂是甘珀酸或其类似物或衍生物。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后测量所述细胞群体中的钙通量。在某些情况下，测量钙通量在与所述甘草次酸衍生物接触后约1、2、3、4、5或10分钟内进行。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中的脂质损伤。在某些情况下，脂质损伤通过用流式细胞术(例如荧光活化细胞分拣(facs))检测脂质过氧化来检测。在某些情况下，脂质损伤通过所述细胞群体中的氧化脂质与非氧化脂质的比率来检测。在某些实施方式中，脂质损伤通过用流式细胞术(例如facs)检测脂质过氧化来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中的dna损伤。在某些情况下，dna损伤通过检测双链dna断裂来检测。在某些情况下，dna损伤通过确定所述细胞群体中的γh2ax磷酸化来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测所述细胞群体中氧化应激的诱导。在某些情况下，氧化应激通过检测所述细胞群体中活性氧物质(ros)的总水平来检测。在某些情况下，氧化应激通过检测所述细胞群体中线粒体活性氧物质(ros)的总水平来检测。
本发明的方法的某些情况还包括在与所述甘草次酸衍生物接触后检测代谢产物。在某些情况下，所述代谢产物是次黄嘌呤。
在某些情况下并且不希望受到理论限制，本文公开的药剂(例如甘草次酸衍生物)可以通过阻断或以其他方式干扰一种或多种半通道和/或间隙连接，或阻断或干扰作为半通道和间隙连接的建筑砌块的一种或多种连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶，来根除白血病细胞。因此，尽管本发明的某些情况涉及某些甘草次酸衍生物的使用，但应该理解，本发明不限于使用这些甘草次酸衍生物来例如根除白血病细胞。相反，本文中涵盖了干扰与白血病细胞或白血病细胞之间的相互作用并从而根除(例如选择性根除)白血病细胞或用于阻断或干扰半通道和/或间隙连接或连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶的任何手段。
例如，在某些情况下，本文公开的方法、试剂盒和组合物可以包含能够或可用于阻断或以其他方式干扰(例如选择性阻断或选择性干扰)一种或多种半通道、间隙连接、连接蛋白、泛连接蛋白或羟基甾类脱氢酶的任何药剂或组合物。这些药剂或组合物可以选自间隙连接和半通道抑制剂例如甘草酸、18α-甘草次酸、甘珀酸、甘珀酸衍生物、甘珀酸类似物、芬那酸化物、氟芬那酸、氟芬那酸衍生物、氟芬那酸类似物、庚醇、辛醇、花生四烯酸、奎宁、奎宁衍生物(包括甲氟喹)、连接蛋白(cx)片段(包括来自于连接蛋白例如连接蛋白43或连接蛋白30的细胞外结构域的片段)、连接蛋白模拟肽包括但不限于gap26和gap27、连接蛋白抑制剂、连接蛋白抗体、连接蛋白表达调控物例如成簇的规则间隔的短回文重复序列、crispr/cas系统、sirna,shrna、mirna和调控连接蛋白表达的其他寡核苷酸(例如
在某些实施方式中，本文公开的药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)相对于正常细胞优先性地结合到白血病细胞(例如白血病干细胞)的一种或多种半通道和/或间隙连接。例如，在某些实施方式中，甘珀酸优先性地结合到白血病细胞(例如白血病干细胞)的一种或多种半通道和/或间隙连接，其比与正常细胞的间隙连接或半通道的结合高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、12倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或更多倍。在某些实施方式中，甘珀酸对白血病细胞的半通道和/或间隙连接的结合亲和性比它结合到正常细胞的所述间隙连接或半通道的结合亲和性高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、12倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或更多倍。
在某些实施方式中，本文公开的药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)相对于正常细胞优先性地结合到白血病细胞(例如白血病干细胞)的一种或多种连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶。例如，在某些实施方式中，甘珀酸优先性地结合到白血病细胞(例如白血病干细胞)的一种或多种连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶，其比与正常细胞的连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶的结合高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、12倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或更多倍。在某些实施方式中，甘珀酸对白血病细胞(例如白血病干细胞)的连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶的结合亲和性比它结合到正常细胞的所述连接蛋白、泛连接蛋白和/或羟基甾类脱氢酶的结合亲和性高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、10倍、12倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或更多倍。
本公开涵盖了将药剂或间隙连接阻断剂单独地或与至少一种其他化学治疗剂例如被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂一起组合地使用在本文描述的方法、组合物和试剂盒中。本公开涵盖了使用能够选择性根除细胞群体或对象中的白血病细胞，而不根除或最低限度地根除所述群体或对象中的正常细胞(例如白细胞)的任何药剂或间隙连接阻断剂。可用作间隙连接阻断剂的药剂的示例性类型包括小的有机或无机分子，糖类，寡糖，多糖，选自肽、蛋白质、肽类似物和衍生物的生物大分子，肽模拟物，选自sirna、shrna、反义rna、核酶和适体的核酸，由选自细菌、植物、真菌、动物细胞和动物组织的生物材料制成的提取物，天然存在或合成的组合物，及其任何组合。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)的抑制剂。应该认识到，这些抑制剂可以是11β-hsd1的抑制剂、11β-hsd2的抑制剂、或11β-hsd1和11β-hsd2两者的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂选自下述式i至iii：
其中
x、y和z各自独立地表示卤素特别是f、cl、i或br、c1-c6烷基、c5-c15芳基或c1-c6烷氧基，
n表示从1至10、特别是从1至4的整数，
l表示酰胺、胺、磺酰胺、酯、硫酯或酮基团，
t、u、v和w各自独立地表示氧代、硫代、酮、硫酮、c1-c6烷基或c1-c6烷醇基团，
ar表示芳香环系统，并且
cyc表示环状环系统，
其中
a表示c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，
b和c各自独立地表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，
m是1至10、特别是1至4的整数，并且
d是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c6烷基，
其中
e表示oh、c1-c10酯(c1-c10烷基-co-o-)、c1-c10酰胺(c1-c10烷基-co-nh-)、c1-c10醚(c1-c10-o-)或c1-c10酮(c1-c10烷基-co-)基团，
f表示氧代、酮基、c1-c6烷醇基团或c1-c6烷基，并且
g是选自coor1或conr2r3的基团，其中r1、r2和r3各自独立地表示h或c1-c20烃基、特别是c1-c6烷基。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂是18-β-甘草次酸或其衍生物。18-β-甘草次酸的示例性衍生物包括但不限于甘草甜素、甘草酸、甘珀酸和2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包含甘珀酸或其类似物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂不是18-β-甘草次酸。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂选自庚醇、辛醇、花生四烯乙醇胺、芬那酸化物、视黄酸、油酰胺、精胺、氨基硫酸酯、卤烷、安氟醚、异氟烷、丙泊酚、硫喷妥、甘草次酸、奎宁、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯或其可药用衍生物及其任何组合。庚醇的示例性可药用衍生物包括但不限于1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇及其组合。芬那酸化物的示例性可药用衍生物包括但不限于甲氯芬那酸、尼氟灭酸、氟芬那酸及其组合。甘草次酸的示例性可药用衍生物包括但不限于甘草次酸的氢酯、甘草次酸的氢酯的盐、甘珀酸及其组合。制造甘草次酸的氢酯和甘草次酸的氢酯的盐的方法描述在美国专利号3,070,623中，其整体通过参考并入本文。奎宁的示例性可药用衍生物包括但不限于奎尼丁、甲氟喹及其组合。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括甘珀酸、甘珀酸或其类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述药剂或间隙连接阻断剂不是18-β-甘草次酸。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括甘珀酸的类似物或衍生物。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括由下述结构iv描绘的甘草次酸衍生物甘珀酸(cbx)。cbx，一种假定的间隙连接抑制剂，通过强力抑制11β-羟基甾类脱氢酶(11β-hsd)并可逆地催化皮质醇向无活性代谢物皮质酮的转化，影响内源糖皮质激素。cbx在口服给药时是高度可生物利用的，并且是安全且耐受良好的。在动物中的繁殖、致畸和致癌试验显示出没有显著副作用。cbx的副作用主要包括体液潴留，并且总的来说是可管控的。
在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白间隙连接家族成员的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx40.1的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx30.2的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx31.1的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx36的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx45的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx47的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx32的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx50的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx30.3的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx31的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx26的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx40的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx37的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx46的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx43的抑制剂。在某些实施方式中，所述间隙连接阻断剂包括连接蛋白cx30的抑制剂。上面列出的连接蛋白间隙连接家族成员的示例性抑制剂包括但不限于细胞外ca2+、甘珀酸、氟芬那酸和辛醇。上面列出的连接蛋白间隙连接家族成员的其他适合的抑制剂对于专业技术人员来说是显而易见的。
本公开涵盖了使用可用于治疗癌症(例如白血病)的任何化学治疗剂。可以与本发明的间隙连接阻断剂(例如破坏细胞间通讯的药剂)相组合给药的示例性化学治疗剂包括烷基化药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、亚硝基脲)，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、培美曲塞、6-巯基嘌呤、达卡巴嗪、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨、地西他滨)，植物生物碱和萜类化合物包括长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨)、鬼臼毒素(例如依托泊苷、替尼泊苷)、紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛)，拓扑异构酶抑制剂(例如诺替康(notecan)、拓扑替康、安吖啶、磷酸依托泊苷)，抗肿瘤抗生素(放线菌素d、多柔比星、表柔比星和博来霉素)，核糖核苷酸还原酶抑制剂，抗微管药剂，以及视黄酸类。(参见例如《癌症：肿瘤学原理与实践》(cancer:principlesandpracticeofoncology)，v.t.devita等主编，j.b.lippincottcompany，第9版，2011；brunton,l.等主编，goodmanandgilman's，《治疗剂的药理学基础》(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)，第12版，mcgrawhill，2010)。
本文描述的组合物、方法和试剂盒涵盖了使用至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂。所述至少一种化学治疗剂可能由于任何耐药机制而被急性髓性白血病耐受。在某些实施方式中，所述至少一种化学治疗剂发生由基质介导的耐药性。当在本文中使用时，由基质介导的耐药性是指急性髓性白血病表现出来的由白血病细胞与基质细胞之间的异型相互作用造成的化疗耐药性。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括抗代谢药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括阿糖胞苷。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括多柔比星。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括抗代谢药剂和蒽环类药剂。在某些实施方式中，所述至少一种被急性髓性白血病耐受的化学治疗剂包括阿糖胞苷，并且所述蒽环类药剂包括多柔比星。应该认识到，本文描述的间隙连接阻断剂(例如cbx)的给药通过部分地克服白血病细胞表现出的化疗耐药性例如由基质介导的化疗耐药性，选择性根除白血病细胞。
筛选测定法
本文还公开了用于筛选试验药剂以确定这种试验药剂是否可能是可用于选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法和测定法。当在本文中使用时，短语“试验药剂”意味着正被评估从包含正常细胞的群体中选择性根除白血病细胞的能力的任何化合物或分子(例如小分子有机化合物、寡核苷酸、多核苷酸、sirna、shrna、基因、基因产物、多肽、抗体或其他药理化合物)。在某些实施方式中，本文公开的测定法和方法可用于鉴定作为候选药物的试验药剂。当在本文中使用时，短语“候选药物”意味着具有或被怀疑具有从包含正常细胞的群体中选择性根除白血病细胞的能力的任何化合物或分子(例如小分子有机化合物、寡核苷酸、多核苷酸、sirna、shrna、基因、基因产物、多肽、抗体或其他药理化合物)。在某些情况下，本文公开的或按照本文公开的测定法和方法鉴定的药剂或候选药剂(例如甘珀酸或其类似物或衍生物)可用于例如在对象(例如人类)中治疗和/或治愈白血病(例如aml、cll、mds和all)或提升所述对象的存活。这种治疗可以改善诊断到的病症或使它更易管理，或改善疾病症状或延长存活期。治疗也可以包括延迟或阻止缓解的发生或阻止白血病的重现或复发。
在一个实施方式中，这种鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法，所述方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；以及(b)检测所述细胞群体中氧化应激的诱导，其中在所述白血病细胞中选择性诱导氧化应激的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，所述氧化应激通过确定所述细胞群体中活性氧物质(ros)的总水平来检测。在某些实施方式中，氧化应激通过确定所述细胞群体中线粒体活性氧物质(ros)的总水平来检测。
在某些情况下，还公开了鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法，所述方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；以及(b)检测所述细胞群体中脂质损伤的诱导，其中在所述白血病细胞中选择性诱导脂质损伤的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，脂质损伤通过确定所述细胞群体中氧化脂质与非氧化脂质的比率来检测。在某些实施方式中，脂质损伤通过用流式细胞术检测脂质过氧化来检测。
在其他实施方式中，还公开了鉴定选择性根除细胞群体中的白血病细胞的候选药剂的方法，所述方法包括：(a)将包含白血病细胞和正常细胞的细胞群体与试验药剂相接触；以及(b)检测所述细胞群体中dna损伤的诱导，其中在所述白血病细胞中选择性诱导dna损伤的试验药剂是候选药剂。在某些实施方式中，dna损伤通过确定所述细胞群体中的γh2ax磷酸化来检测。在某些实施方式中，γh2ax磷酸化通过流式细胞术(例如facs)来检测。
在某些情况下，本文公开的方法和测定法可用于鉴定包含甘草次酸衍生物的试验药剂是否能够从细胞群体选择性根除白血病细胞。在一个实施方式中，示例性的药剂或候选药剂是甘草次酸衍生物，例如选自甘草甜素、甘草酸、18-β-甘草次酸、甘珀酸或2-羟乙基-18β-甘草次酸酰胺的甘草次酸衍生物。在某些实施方式中，所述甘草次酸衍生物包括甘珀酸或其类似物或衍生物。
在上述方法的某些实施方式中，可以与上述方法和测定法相结合使用的白血病细胞包括选自mll-af9细胞、kg-1细胞、kg-1a细胞、u937细胞、hl60细胞、nb-4细胞和thp1细胞的急性髓性白血病细胞系。
一些定义
除非在本文中另有定义，否则与本申请相结合使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的意义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数形式并且复数术语将包括单数形式。
当在本文中使用时，术语“包含”被用于指称本发明必需的组合物、方法、试剂盒及其相应组分，也开放地包括未指明的要素，不论其是否必需。
当在本文中使用时，术语“基本上由……构成”指称给定实施方式所需的那些要素。所述术语允许存在不实质性影响本发明的该实施方式的基本和新颖或功能性特征的其他要素。
术语“由……构成”指称本文中所描述的组合物、方法、试剂盒及其相应组分，其不包含在该实施方式的描述中未叙述的任何要素。
除了在操作实例中或另有指明之外，本文中使用的表示成分的量或反应条件的所有数字都应该被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。术语“约”当与百分率相结合使用时可以意味着±1％。
没有具体数目的指称包括复数形式，除非上下文明确指示不是如此。同样地，词语“或”打算包括“和”，除非上下文明确指示不是如此。还应该理解，为核酸或多肽提供的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值都是近似值，并且为了描述而提供。尽管与本文中所描述的相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但适合的方法和材料在下文描述。术语“包含”意味着“包括”。术语“例如”在本文中用于指示非限制性实例。
指明的所有专利和其他出版物为描述和披露的目的明确地通过参考并入本文，例如在这些出版物中描述的可以与本公开相结合使用的方法。这些出版物仅仅因为它们的公开先于本申请的提交日期而提供。就此而言，绝不应该被解释为承认本发明人无权凭借先有发明或出于任何其他原因而在时间上早于这些公开。所有关于日期的陈述或关于这些文献的内容的表述是基于本申请人可以获得的信息，并不对所述日期或这些文献的内容的正确性构成承认。
在尚未指明的范围内，本领域普通技术人员应该理解，本文中描述和说明的各种不同实施方式中的任一者可以被进一步修改，以并入在本文公开的任何其他实施方式中示出的特点。
下面的实施例说明了本发明的某些实施方式和情况。对于相关领域的技术人员来说，显然可以进行各种不同的修改、添加、替换等而不改变本发明的精神或范围，并且这些修改和变动被涵盖在权利要求书中所定义的本发明的范围之内。下面的实施例不以任何方式限制本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1：间隙连接细胞间通讯调控白血病细胞存活和耐药性
已报道由人类白血病中的遗传易位、包括涉及混合谱系白血病(mll)基因的易位所编码的某些融合蛋白，为专能造血祖细胞提供了白血病干细胞性质(huntly等，cancercell6,587-96(2004)；cozzio等，genes&development17,3029-35(2003)；和so等，cancercell3,161-71(2003))。此外，这些改变的等位基因在正常骨髓细胞中的引入，在疾病的小鼠模型中引起aml。这些aml模型重演了人类疾病表型并表现出干细胞样性质，证实了在体外连续移植的能力和提供可以在体内连续移植的aml表型的能力(huntly等，(2004)，和krivtsov等，nature442,818-22(2006))。
我们首先在人类mll-af9白血病的小鼠模型中研究了aml细胞对诱导化疗的即时响应。mll-af9是由t(9；11)(p22；q23)易位编码的融合蛋白(krivtsov等，2006，和sykes等，cell146,697-708(2011))，在源自于aml患者的白血病胚细胞中出现，并与不良预后相关(schoch等，blood102,2395-402(2003))。为了产生用于我们的实验的原代mll-af9白血病细胞，我们将mll-af9癌基因通过反转录病毒转导引入到来自于b6.sjl小鼠的谱系剥夺的骨髓细胞中，如图1a中所示。然后将分拣的gfp阳性细胞静脉内注射到亚致死剂量辐照的c57b16受体中，并在3个月后，在疾病的终末阶段收获mll-af9gfp阳性白血病细胞。为了同步治疗的时间并观察疾病进展，我们用萤光素酶慢病毒转导原代mll-af9gfp阳性细胞。然后，我们用抗生素选择表达萤光素酶的细胞，并将1百万个双阳性白血病细胞移植到未辐照的受体中，并通过全身生物发光成像监测疾病进展(图1a和1b)。在临床上，新诊断的aml患者用诱导化疗(与蒽环霉素相组合的阿糖胞苷)治疗以达到完全缓解(pui等，2011，和burnett等，2011)，并且类似的结果已在人类aml的小鼠模型中描述，其使用5天的治疗方案，包括组合的阿糖胞苷和多柔比星3天，然后用单独的阿糖胞苷另外2天(zuber等，genes&development23,877-89(2009))。在移植到未辐照的受体后14天，在受体的骨骼中检测到mll-af9细胞(图1b)，并将小鼠通过治疗前循环gfp阳性的百分数进一步分层。我们的动力学实验揭示出对诱导化疗的非常快速的响应，并且在第一剂后1小时，通过流式细胞术在循环中没有检测到gfp阳性mll-af9细胞(图1c)。在第一剂后24小时，我们可以检测到gfp阳性循环mll-af9细胞，但它们在第二剂后1小时再次消失。使用第三、第四和第五剂记录到类似的模式(图1c)。令人吃惊的是，在5天的治疗过程中，在每一剂后1小时骨髓mll-af9细胞的水平急剧降低(图1d)。我们推测这可能反映出超出细胞死亡之外的功能性变化。事实上我们发现，在体外用有效剂量的组合化疗处理原代aml细胞不引起细胞死亡。
我们推测化疗治疗可能引起不同的细胞体内定位。如果真的如此，细胞-细胞连接可能发生，并可能对aml细胞存活有贡献。为了试验这种推测，我们使用延时视频显微术与流式细胞术相组合，在体外评估了在含有和不含支持骨髓的基质细胞的情况下mll-af9白血病细胞对化疗的响应。只有高剂量的50nm阿糖胞苷与20nm多柔比星一起(pardee等，experimentalhematology39,473-485(2011))引起低耐药性，并且在诱导后16小时引起～85％细胞死亡(图2a)。ms-5是鼠类骨髓基质细胞，其以前被显示支持造血干细胞和祖细胞(itoh等，experimentalhematology21,145-153(1989)，和schajnovitz等，natureimmunology12,391-8(2011))。正如预期的，mll-af9细胞与支持bm的ms-5基质细胞的共培养物引起对组合疗法的耐药性提高(～70％)，仅有～30％的细胞死亡(图2a)。这表明白血病细胞与基质细胞之间的直接相互作用促进耐药性。为了区分基质-白血病(异型)相互作用和白血病-白血病(同型)相互作用，我们通过transwell插片将mll-af9与基质分离，以限制异型相互作用并同时允许同型相互作用。我们发现异型相互作用是耐药性的主要原因但不是全部原因，因为～30％(相比于没有基质情况下的～15％耐药)的mll-af9细胞仍然耐药，尽管与基质物理分离开(图2c)。
由于造血细胞的粘附相互作用通常伴有细胞间通讯，因此我们随后试验了间隙连接活性在耐药性中的潜在作用。间隙连接细胞间通道是连接蛋白的同和异六聚体，通过第二信使例如钙和camp的通过来促进接触的细胞之间的细胞间通讯17。甘珀酸(cbx)是强效广范围间隙连接抑制剂，在100μμ下高效阻断细胞-细胞通讯而不影响细胞存活率(schajnovitz等，2011)。在诱导化疗之前20分钟用100μμcbx阻断共培养物系统中的间隙连接活性，逆转了所述耐药性并根除了几乎90％的ml-af9细胞(图2b)。用transwell插片分开的共培养物中的间隙连接阻断导致超过90％的根除(图2c)，表面同型细胞间通讯也对获得的耐药性有贡献。
在这些鼓舞人心的结果之后，我们在小鼠中试验了与化疗相组合的系统性间隙连接抑制的效果。在诱导化疗之前24小时和整个5天的治疗中，向患病小鼠给药25mg/kgcbx。治疗后1周，将小鼠成像然后处死，以评估治疗结果。如图2d中所示，用单独的化疗治疗的小鼠进入完全缓解，但在骨骼中可以检测到极少量残留细胞(白色箭头)。引人注目的是，用化疗和间隙连接阻断剂治疗的小鼠完全没有白血病，并且通过萤光素酶成像或通过流式细胞术没有可检测的白血病细胞。
然后我们想知道在没有其他治疗的情况下间隙连接细胞间通讯的阻断如何影响aml细胞。令我们吃惊的是，发现原代mll-af9细胞对间隙连接阻断敏感，～20％的所述细胞被16小时的100μμcbx根除(图4a)。重要的是这是白血病特异性效应，因为从bm或外周血(pb)新鲜分离的非白血病的野生型原代白细胞对cbx暴露不敏感，即使是在200μμ的高浓度下，而在200μμ下mll-af9细胞死亡提高～70％(图4a)。我们通过将原代mll-af9细胞(表达cd45.1抗原)与新鲜分离的正常bm白细胞(表达cd45.2抗原)以1:1的比例混合，并将所述混合物暴露于浓度逐渐提高的cbx下16小时，进一步验证了这些结果。这些实验证实了cbx选择性根除mllaf9细胞而不影响正常细胞，即使在高达400μμ的浓度下(图4b)。为了排除克隆特异性效应的可能性，我们使用独立产生的不同的mll-af9克隆，还包括代表不同aml类型的hoxa9/meis1aml细胞，重复了所述实验。如图4c和4d中所示，cbx选择性根除试验的所有aml细胞，而不影响正常细胞。
这些结果揭示出细胞间通讯在维持白血病细胞存活中出人意料的选择性作用。由于cbx对正常细胞没有细胞毒性效应，因此我们力图理解在试验的白血病细胞中观察到的死亡原因。mll-af9aml细胞是表达gr-1和mac-1抗原两者的未分化的髓系祖细胞，而成熟的髓系细胞表达gr-1(粒细胞)或mac-1(巨噬细胞)。我们通过在将原代mll-af9细胞暴露于0μμ-200μμcbx16小时后测试它们中的gr-1和mac-1表达，进行了分化测定法。我们发现事实上cbx对所述细胞没有毒性，而是诱导它们分化成作为短寿命细胞的成熟粒细胞。
实施例2：使用甘珀酸选择性根除白血病细胞
急性髓性白血病(aml)是一种致死且不好治疗的恶性疾病，每年在美国影响大约20,000名个体。当前的疗法自从1980年代起就未变过，并且在大约75％的患者中失败，尽管初始缓解率高。对aml的基础的遗传理解现在相当复杂，定向治疗到目前为止仍然令人失望；idh定向疗法可能是一个例外，但仅仅适合于17％的患者。
本发明人发现，甘珀酸(cbx)这种推测对细胞之间的通讯有影响的小分子引起人类和小鼠白血病细胞的选择性根除，而对邻近的正常血液细胞没有负面影响。cbx介导的白血病细胞死亡不限于特定的致癌核型或突变，表明所述药物影响白血病细胞中的共同途径。本发明人发现，cbx与线粒体酶琥珀酸脱氢酶(sdh)相互作用，并诱导铁依赖性脂质过氧化和白血病细胞死亡。在带有明确验证的人类aml的小鼠模型(mll-af9)的小鼠中，cbx治疗显著降低白血病负担并延长存活期。cbx治疗的小鼠比用标准诱导化疗治疗的小鼠存活更长，并且在将两种疗法组合时记录到协同效应。
在带有明确验证的人类aml的小鼠模型(mll-af9)的小鼠中，cbx治疗显著降低白血病负担并延长存活期。cbx治疗的小鼠比用标准诱导化疗(ict)治疗的小鼠存活更长，并且在将两种疗法组合时记录到协同效应(图60a)。本发明人报道了cbx介导的白血病细胞死亡不限于特定的致癌核型或突变，表明它影响白血病细胞中的共同基础途径(图60b)。
比较性分析揭示，白血病细胞比它们的正常对应物消耗更多的氧用于atp产生(图61a和61b)。此外，快速分裂的cbx耐药性白血病细胞(eas12r)与cbx敏感的原代白血病细胞(eas12)相比消耗明显更少的氧(图61b)。这表明白血病细胞产生过量atp为快速细胞分裂之外的其他细胞过程(例如atp依赖性有机阴离子泵、mdr活性等)提供“燃料”。引人注目的是，cbx处理在白血病细胞中但不在正常细胞中诱导即时线粒体呼吸停止(图61c和图61d)。在白血病细胞中cbx的效应与抗霉素a这种复合体iii的强力抑制剂的效应相当(图62b，棕色圆圈)。然而，与cbx不同，抗霉素a处理不引起白血病细胞死亡，证实了白血病细胞可以克服线粒体atp剥夺的可塑性。这也表明异常的细胞氧化还原生理学可能是白血病细胞的“阿克琉斯之踵”，其促进cbx的选择性效应。
实施例3：cbx对线粒体呼吸的活性
cbx的引人注目的呼吸停止效应将我们的注意力吸引到它的结构琥珀酸侧链。琥珀酸是参与tca循环和电子传递链两者的琥珀酸脱氢酶(sdh)的底物。正如预期的，与正常细胞裂解物相比，在白血病细胞裂解物中sdh活性更高。cbx在白血病细胞裂解物中的温育引起sdh活性降低，表明在体外cbx可以直接结合到sdh并抑制它的活性，而抗霉素a没有效果。然后，本发明人试验了特异性sdh抑制剂对白血病细胞存活的影响。强力sdh抑制剂草酰乙酸和抗癣青霉素a5两者不诱导白血病细胞死亡。因此，需要另外的刺激来诱导白血病细胞死亡。
约1-3％的消耗的线粒体氧不完全被还原；那些“泄漏的”电子与分子氧快速相互作用以形成超氧化物自由基，其是线粒体中的主要活性氧物质(ros)。本发明人提出“琥珀酸-甾类”cbx紧邻铁-硫簇锚定线粒体呼吸复合体，因此破坏电子传递流并增加ros的产生。因此，本发明人在cbx处理的细胞中评估了不同时间点的ros水平。cbx刺激在白血病细胞中但不在正常的循环bm单核细胞中引起超氧化物水平的快速提高(图63a)。线粒体中超氧化物的积累先于自由基链反应、脂质过氧化和双链dna断裂，正如分别由过氧化自由基(图63b)和γη2αx磷酸化(图63c)水平的提高所证实的。在正常bm单核细胞中cbx对ros没有影响(参见图63a、63b和63c，蓝色线)。除了完全停止氧化磷酸化之外，cbx刺激在白血病细胞中但不在正常细胞中引起即时和急性的ca2+内流。寡霉素、fccp和抗霉素a不引起ca2+内流，这表明对ca2+的影响不被电子传递链的干扰介导。
在表型上，cbx处理的白血病细胞表现出最近描述的被称为铁死亡的受调控的细胞死亡程序的标志。然后，本发明人试验了用铁死亡抑制剂预处理细胞是否可以挽救cbx介导的细胞死亡。本发明人利用使用铁螯合剂(去铁胺，dfo)的直接方法和使用liproxstatin-1(lxn1，gpx4介导的铁死亡的抑制剂)和α-生育酚(αtoc，一种亲脂性抗氧化剂)的间接方法。在用铁螯合剂dfo预处理的白血病细胞中cbx活性显著降低，而liproxstatin-1和α-生育酚预处理引起cbx活性的更温和的抑制。
这支持了“cbx-自由基化”理论，根据所述理论，在具有极度活跃的线粒体和高的细胞内铁代谢速率的细胞中，cbx在与铁氧还蛋白sdh相互作用后可以被代谢成有毒实体。
实施例4：cbx在实体肿瘤中的活性
接下来，本发明人力图确定cbx在实体肿瘤细胞系中的活性。将细胞与浓度逐渐提高的cbx(0μμ-400μμ)温育24小时。终点细胞存活率通过流式细胞术分析来评分。
如图66中所示，cbx在实体肿瘤细胞系中表现出活性。与正常bm基质细胞系(hs-5)相比，试验的所有实体肿瘤细胞系表现出对cbx处理(在体外24小时温育)的更高敏感性。具体来说，cbx在100μμ下高效根除黑素瘤细胞(a375，蓝色箭头)。
讨论
上述结果证实了甘珀酸(cbx)选择性杀死癌细胞和白血病细胞，正如在小鼠和人类细胞两者中所证实的。同时，cbx可以支持正常骨髓单核细胞和髓系祖细胞的扩增。用单独的cbx治疗显著延长具有aml的小鼠的存活期，并且使用cbx和化疗的治疗优于单独的化疗。
上述结果还证实了白血病细胞对粘附性同型相互作用的依赖性，并标明异常的细胞氧化还原生理学是白血病细胞的“阿克琉斯之踵”，其促进cbx的选择性效应。用cbx治疗诱导白血病细胞集群分离和氧化应激介导的细胞死亡。本发明人目前正在确认我们的代谢靶的过程中，所述代谢靶介导化疗耐药性并与cbx相互作用以产生过氧化自由基。
本文提供的结果还证实了观察到的cbx活性不限于白血病细胞，而是也扩展到非白血病癌细胞类型(例如乳腺癌细胞、黑素瘤细胞、前列腺癌细胞和宫颈癌)。此外，本发明人目前正在确认一种模型，通过这种模型，白血病细胞通过特定代谢物的直接细胞内传导聚集成功能集群，以保护它们自身免受有毒的ros副产物影响。
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