生物合成装置的制作方法

本申请要求澳大利亚临时申请号2016904516的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。

本发明涉及伤口愈合；涉及基质、支架、模板、底物和用于基质、支架、模板、底物的其他装置和组合物；涉及细胞培养物并且涉及弹性纤维形成。

背景技术：

在说明书中对任何现有技术的引用并不是对该现有技术构成任何管辖区域中的公知常识的一部分或者该现有技术可合理地预期被理解、被认为是相关的和/或与本领域技术人员掌握的其他现有技术结合的承认或暗示。

弹性蛋白是脊椎动物组织(诸如血管、肺和皮肤)的细胞外基质的组成部分，它可提供正常功能期间机械拉伸这些组织所需的结构完整性和弹性[1]。弹性蛋白的三维架构反映了它的物理环境和生物学需求：弹性血管在脉管系统中携带血液，肺部每次呼吸都会膨胀和收缩，并且真皮中的纤维有助于皮肤伸展和畏缩。

在真皮中，弹性蛋白以纤维形式排列，其主要成分是弹性蛋白聚合物。对于从头弹性纤维合成存在强烈需求，特别是在深层真皮中，以保持活力弹性和皮肤功能。弹性蛋白主要存在于真皮的网状部分中，其中大直径弹性纤维位于组织内深处并且平行于皮肤表面[6]。

虽然弹性蛋白是持久性最持久的人类蛋白质之一，只要人类宿主[2，3]教条指出包括真皮在内的组织中的弹性纤维合成在儿童早期就会有效停止[4]。此后，全厚度伤口中弹性纤维的再生受到严重损害[5]。尽管真皮成纤维细胞能够分泌弹性蛋白，但其合成在皮肤和许多成体组织中受到转录后机制的抑制[7，8]。

鉴于以上，正在不断寻找可将弹性纤维定量递送到患者的深层真皮中的机制，特别是用于修复全厚度伤口。

rnjakj等人2009[45]提出了一种基于合成人弹性蛋白的弹性纤维人蛋白质和细胞相互作用真皮替代支架。它描述了成纤维细胞在由合成原弹性蛋白组成或涂有合成原弹性蛋白的预制结构或表面上的附着、扩散和增殖。

wo2013/044314涉及利用含原弹性蛋白的组合物在体内形成弹性纤维。

wo2015/021508涉及利用原弹性蛋白进行组织修复。

技术实现要素：

本发明试图解决一个或多个上述问题或限制，并且在一个实施方案中提供了一种用于制造其上布置有弹性纤维的装置的方法。该方法包括使包含细胞、细胞培养基和原弹性蛋白的细胞培养物维持在使细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，以及使装置与细胞培养物接触以使得由细胞形成的弹性纤维沉积到装置上，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

在另一个实施方案中，提供了一种用于制造装置的方法，该装置包括具有布置在其上的弹性纤维的胶原蛋白片或为具有布置在其上的弹性纤维的胶原蛋白片的形式。该方法包括使包含成纤维细胞、细胞培养基和原弹性蛋白的细胞培养物维持在使成纤维细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，以及使胶原蛋白片与细胞培养物接触以使得由成纤维细胞形成的弹性纤维能够沉积到片上，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

在另一个实施方案中，提供了一种用于制造装置的方法，该装置为其上布置有弹性纤维的胶原蛋白片的形式。该方法包括使包含成纤维细胞、细胞培养基和原弹性蛋白的细胞培养物维持在使成纤维细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，以及用细胞培养物覆盖胶原蛋白片以使由成纤维细胞形成的弹性纤维能够沉积到片上，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

在另一个实施方案中，提供了一种用于制造装置的方法，该装置为其上布置有弹性纤维的胶原蛋白片的形式。该方法包括使包含成纤维细胞、细胞培养基和原弹性蛋白的细胞培养物维持在使成纤维细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，以及用细胞培养物覆盖胶原蛋白片使得成纤维细胞接种到胶原蛋白片上，从而使由成纤维细胞形成的弹性纤维能够沉积到片上，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

在上述实施方案中的任何一个中，可在装置与细胞和细胞培养基接触后将原弹性蛋白加入细胞培养基中。

上述实施方案可包括另外的步骤：从细胞培养基中取出装置以形成包括装置和细胞的组合物，或从细胞培养物中取出装置以获得表面上无细胞的装置。

在另一个实施方案中，提供了一种通过上述方法中任一种制造的其上布置有弹性纤维的装置。

在另一个实施方案中，提供了一种在伤口部位处形成含有弹性纤维的组织的方法，该方法包括使伤口与如上所述的装置在使伤口能够愈合的条件下接触，从而在伤口部位处形成含有弹性纤维的组织。

根据以下通过示例并参考附图给出的描述，本发明的其他方面和前面段落中描述的方面的其他实施方案将变得明显。

附图说明

图1：模型体外弹性发生系统。在不存在外源原弹性蛋白(a)或在原弹性蛋白添加后1(b)、3(c)和7(d)天的情况下，人新生儿真皮成纤维细胞形成弹性纤维。弹性纤维(绿色)用ba4抗弹性蛋白抗体和抗小鼠fitc缀合的二抗染色。细胞核(蓝色)用dapi染色。在olympusfluoviewfv1000共聚焦显微镜上获得图像。比例尺＝50μm。

图2：不同年龄的弹性发生。在原弹性蛋白加入后7天形成的弹性蛋白网络与来源于不同年龄组-新生儿(a)、10(b)、31(c)、51(d)和92(e)岁的培养的真皮成纤维细胞的比较。对于弹性蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)染色的培养物拍摄共聚焦显微镜图像。比例尺＝50μm。

图3：通过使用cm增强弹性发生。来源于51岁(a和b)或新生儿(c)并在fm(a和c)或cm(b)中培养17天的由真皮成纤维细胞形成的弹性纤维。在第10天加入原弹性蛋白。对于弹性蛋白(绿色；上图)和细胞核(蓝色；下图)染色的培养物拍摄共聚焦显微镜图像。比例尺＝50μm。每个实验10个视野的图像分析表明cm介质对原弹性蛋白在来自51岁并在第10天加入原弹性蛋白培养17天的细胞上的沉积(d；n＝6)和纤维数(e；n＝3)的增强作用。基于其组分(f)的分子量范围(<30kda，30kda-100kda和>100kda)划分的在cm中生长的相同细胞的图像分析。每种培养基分析十个视野，并使用在该培养基中看到的平均核数进行归一化。^*p<0.05；^**p<0.01。

图4：通过多种原弹性蛋白处理物增强弹性发生。共聚焦图像显示在重复的原弹性蛋白添加到来源于不同年龄组(新生儿、10岁、31岁和51岁)的培养的真皮成纤维细胞中的情况下，弹性蛋白网络形成增加。弹性纤维在未处理的培养物中不明显。将培养物染色为弹性蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)。比例尺＝20μm。

图5：重复的原弹性蛋白添加对培养31天的新生儿真皮成纤维细胞的细胞基质厚度(a)和弹性纤维含量(b)的影响。^*p<0.05；^**p<0.01；^***p<0.001；^****p<0.0001。

图6：含有弹性蛋白的分层细胞的真皮替代物。明视野和共聚焦图像显示在真皮替代物内形成广泛的弹性蛋白网络层的能力，该真皮替代物与真皮成纤维细胞和重复的原弹性蛋白处理物一起培养。仅用原弹性蛋白或细胞培养的对照idrt样品不显示弹性蛋白网络层。h&e横截面显示成纤维细胞(紫核)渗入idrt随时间增加。基于dab的弹性蛋白染色的横截面显示真皮替代物的上表面上发展的弹性蛋白层(褐色斑点)。该表面层的共聚焦图像显示出广泛的弹性纤维网络(橙色)。为了区分自发荧光胶原基质(黄色)和弹性蛋白网络，通过合并以下图像来产生共聚焦图像：通过在405nm处激发获得的图像以检测dapi染色的细胞核(蓝色)，通过在488nm处激发获得的图像以检测弹性蛋白染色的fitc荧光和通过在559nm处激发获得的图像以检测弹性蛋白自发荧光。在这些条件下，成熟的弹性纤维呈现橙色。h&e和弹性蛋白横截面图像比例尺＝100μm，共聚集表面图像比例尺＝50μm。

图7：全厚度伤口处理的建议应用。在真皮再生模板上培养患者真皮成纤维细胞，其中它们沉积弹性纤维蛋白，包括微原纤蛋白和赖氨酰氧化酶。通过重复施用原弹性蛋白进行处理导致在模板的上表面上形成广泛的弹性纤维网络。在它发展后，细胞基质可倒置并定位在疤痕组织部位内。

具体实施方式

本发明人惊奇地发现，在体外细胞培养系统中培养的细胞的细胞表面上或附近形成的弹性纤维可从细胞表面释放。此外，发明人已经发现释放的弹性纤维可仅通过在细胞培养物中提供装置而结合到装置上。此外，当从培养物中取出细胞时，弹性纤维仍然与装置结合。

基于这些发现，发明人设计了一种用弹性纤维涂覆装置的方法。这使得人们能够适应装置，尤其是指明用于治疗全厚度伤口的那些装置，以便在人真皮内深处递送密集的弹性纤维网络。因此，在一个实施方案中，提供了一种用于制造其上布置有弹性纤维的装置的方法，包括：

-使细胞培养容器中的细胞培养物维持在使细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，细胞培养物包含细胞、细胞培养基和原弹性蛋白；以及

-在容器中提供装置，从而使装置与细胞培养物接触，使培养物的一直生长的细胞能够将由细胞形成的弹性纤维沉积到装置上，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

“装置”通常是指旨在用于组织再生或组织修复或其他治疗应用的产品。“装置”可指支架、基质、模板、底物、或假体。

“基质”通常是合成和/或生物材料的三维网络，其可用于组织修复或再生应用，特别是水结合能力，或提供用于细胞或治疗化合物附着的基础。当结合水时，基质可形成水凝胶，其可以是多孔的，足以允许细胞或治疗化合物进入或排出。

“支架”通常是合成和/或生物材料的三维网络，其可用于组织修复或再生应用，特别是承载能力。支架还可提供基质的至少一些功能。

“模板”通常是指可用于组织修复或再生应用的合成和/或生物材料的片或层，特别是用于覆盖伤口表面。模板可由单层组成，或者它可以是多层的，其中特定层提供特定的功能，例如湿度控制。模板可由合成和/或生物分子的交联网络组成。网络可形成穿孔、孔或狭缝，或者，一旦形成，这些开口或孔可被给予模板。如本文所述，特别优选的模板是基于胶原蛋白的模板，尤其是其中胶原蛋白与gag结合的模板(如下所述)。

“底物”通常是指多面装置诸如假体或支架的表面。

本发明使得能够制造“其上布置有”弹性纤维的装置。应当理解，所谓的“其上布置有”，弹性纤维可通过细胞培养物与细胞培养物接触而布置在装置的任何所需表面上。因此，在相关表面限定孔或者连接孔或其他腺体的各种吻合或者室或连接装置内的室的通道的情况下，本发明使得弹性纤维能够布置在那些相关表面上，特别是那些不是直接面向外部的表面上。如下所述，这可在一个实施方案中通过将装置浸入细胞培养物中以使相关表面特别是装置的内表面与细胞培养物接触来实现。

在其他实施方案中，该装置可以包括在各个聚合物之间具有细小的间隙空间的聚合物网络的模板的形式提供，并且该弹性纤维布置在那些间隙空间中以便表面上成为散布的并且是模板的聚合物网络的一部分。

如下面进一步讨论的，本发明的一个重要发现是确定由细胞表面上的原弹性蛋白合成的弹性纤维的命运。根据本发明，已观察到该纤维以包含在细胞培养物中的含胶原蛋白的模板的形式布置在装置的表面上。所谓的“布置”在其上仅仅是指通过在装置上生长细胞最终沉积纤维，以便至少部分地涂覆装置的表面的一些部分。因此，应当理解，纤维可通过在细胞培养期间生长细胞而沉积在装置的表面上，或沉降在装置的表面上或沉淀在装置的表面上，以便至少部分地涂覆或覆盖或叠置表面。

虽然不希望受到假设的约束，但据信弹性纤维主要通过非共价相互作用与装置结合，尽管还认识到通过细胞衍生的氧化酶诸如赖氨酰氧化酶特别是当装置包括蛋白质(例如胶原蛋白)时的作用可在纤维和装置之间形成共价键。

无论是非共价或共价相互作用存在还是占优势，装置与弹性纤维的排列、或结合或涂覆需要细胞培养物与装置接触。在一个实施方案中，该装置可与细胞培养物叠置，从而使装置与细胞培养物接触。在一个示例中，将装置置于细胞培养容器中，并将细胞培养物加入容器中，使得装置的至少一个表面与细胞培养物接触。在另一个实施方案中，将装置部分或完全浸入细胞培养物中，使得装置的一些或所有表面与细胞培养物接触。当装置是多孔的并且需要将弹性纤维粘合在装置的孔内和周围时，这是特别理想的。

在与装置接触之前，细胞培养物不必完全配制。例如，不必首先形成细胞、培养基和原弹性蛋白的组合物，然后使组合物与装置接触。在实施本发明时，可在细胞培养基和细胞形式的组合物与装置接触之后加入原弹性蛋白。

通常，在弹性纤维已在细胞表面上形成之后，装置的涂覆开始。在细胞表面上形成弹性纤维的限速步骤是原弹性蛋白的存在。可通过本领域已知的各种技术检测细胞表面上弹性纤维的形成。如本文举例说明的，可用弹性纤维特异性抗体和免疫荧光在血清学上检测弹性纤维形成，并使用公众可获得的软件确定纤维产生的定量和定性测量。

诸如系统中提供的原弹性蛋白的量、其被提供的时间、装置的细胞数量和表面积以及装置上的排列或涂层的密度等因素是确定装置应与细胞培养物接触的时间的变量。鉴于细胞培养利用技术人员非常好理解的培养条件和用于测量本文的发明人所例示的装置上的弹性纤维沉积的测定系统进行，确定在装置上实现所需的弹性纤维的涂层或沉积所需的接触时间在技术人员的技能范围内。用于定性和定量测量本文示例的装置上的纤维沉积的测定系统包括使用抗弹性蛋白抗体和免疫荧光显微镜以及装置的石蜡截面的横截面成像。通常在测定前从装置中除去细胞培养物的细胞。如果细胞在装置上裂解，则包含在细胞上的纤维(其虽然用于测定，但可能最终沉积在装置上)被释放到装置上。该纤维不能与通过在测定前在培养基上生长细胞而沉积到装置上的纤维区分开，这意味着难以定量测定前在培养基中生长细胞而沉积的纤维量。

如上所述，通常细胞培养在约5％至10％范围内co2和约37℃的标准条件下进行。

在一个实施方案中，原纤维蛋白在细胞培养物中以约0.001mg/ml至10mg/ml，例如0.001mg/ml至0.01mg/ml、0.005mg/ml至0.05mg/ml、0.01mg/ml至0.1mg/ml、0.01mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml的量提供。

优选地，原弹性蛋白是shelδ26a的形式，如本文示例中所述。

通常将原弹性蛋白溶解在细胞培养基中。

如本文所述，原弹性蛋白可仅在细胞培养开始时在组合物中提供。或者，可在细胞培养期间的预定时间段将原弹性蛋白加入细胞培养物中。在一个示例中，每5至7天给予原弹性蛋白。后一种方法确保原弹性蛋白的过量供应驱使培养物中的细胞形成最大量的弹性纤维。

通过用含有原弹性蛋白的组合物掺入细胞培养物，或者通过除去细胞培养上清液并用包含原弹性蛋白的新鲜细胞培养基替换该上清液，可将原弹性蛋白重复加入细胞培养物中。

通常，细胞在细胞培养物中以约1×10³至1×10⁸个细胞/cm²表面积，优选地1×10⁴至1×10⁵个细胞/cm²表面积的浓度提供。

在某些实施方案中，如果细胞数超过最大量，则可能需要在本发明的方法期间使细胞通过。

对于装置与细胞培养物接触的时间，或换句话说，用弹性纤维涂覆装置所需的细胞培养时间，通常可为约5天至7天或更长。在本文所述的实施方案中，将细胞培养物维持31天的时间段。可能还需要更长或更短的时间段，这也取决于所需的涂覆量、原弹性蛋白添加的量和频率以及细胞培养物中的细胞数量。

细胞培养物中的培养基在培养期间可以是静止的，或者可使其流动，例如通过机械搅拌含有细胞培养物的培养容器。通过施加到细胞培养容器的滚动、往复运动或摇动动作可产生机械搅动。

根据对于由添加到细胞培养物中的原弹性蛋白形成弹性纤维所选择的细胞类型，可在细胞培养期间将细胞接种到装置表面上。在特别优选的实施方案中，细胞可在细胞培养期间粘附到装置上，例如以单层、菌落或簇的形式。

在其他实施方案中，细胞可以浮游状态存在，即它们可作为悬浮液培养，在这种情况下，细胞不会在更长的细胞培养期间与装置永久接触，但是它们可暂时接触装置，例如，在搅拌细胞培养物引起细胞运动的情况下。

在一个实施方案中，细胞培养物可包括细胞的喂料层。如本领域所知，喂料细胞用于支持作为细胞培养系统的目标的细胞。例如，在选择用于弹性纤维形成的细胞是干细胞的情况下，可提供另一种细胞类型作为干细胞的喂料层。

优选地，本发明需要向细胞培养物中加入含原弹性蛋白的组合物-即加入无细胞的含原弹性蛋白的组合物。在本发明的另一个实施方案中，表达高原弹性蛋白的细胞系，例如原弹性蛋白转染子，可用作原弹性蛋白用于形成弹性纤维的来源。在该实施方案中，表达高原弹性蛋白的细胞系可另外将由其产生的原弹性蛋白组装在细胞膜上以形成最终沉积到装置上的弹性纤维。在一个优选的实施方案中，选择成纤维细胞作为细胞系用于从添加到细胞培养系统的原弹性蛋白形成弹性纤维。

但是，应当理解，任何能够发挥这种功能的细胞或细胞系都可用于此目的。示例包括但不限于来自弹性组织的细胞，诸如血管平滑肌细胞、弹性韧带细胞、肺间质成纤维细胞、膀胱平滑肌细胞、干细胞，干细胞包括但不限于间充质干细胞、脐带血干细胞、羊膜干细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。

在一个实施方案中，该方法包括从装置中除去细胞培养基的另外的步骤，从而制造出包括其上布置有弹性纤维的装置以及细胞培养物的细胞的组合物。在该实施方案中，细胞培养物的一些或所有细胞被保留，并且根据装置的用途，可与伤口部位接触，特别是在全厚度伤口处。在这些实施方案中，特别优选培养细胞，特别是选择用于弹性纤维形成的那些细胞是未被装置接受者认为是非自身的细胞。在一个实施方案中，装置中包含的细胞是自体细胞或同基因细胞，这意味着它们或者源自最终将接收该装置的个体，或者它们是组织匹配的，以便具有与接收者的细胞基本相同的同种异体抗原谱。

根据以上所述，在一个实施方案中，可提供一种用于制造其上布置有弹性纤维的装置的方法，该方法包括：

-使细胞培养容器中的细胞培养物维持在使细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，细胞培养物包含细胞、细胞培养基和原弹性蛋白；

-在容器中提供装置，从而使装置与细胞培养物接触，以使培养物的一直生长的细胞能够将由细胞形成的弹性纤维沉积到装置上；以及

-从装置中除去细胞培养基，从而产生包括其上布置有弹性纤维的装置和细胞培养物的细胞的组合物，从而制造出其上布置有弹性纤维的装置。

在一个单独的实施方案中，该方法可包括从细胞培养物的其他组分中或多或少地完全除去该装置的另外的步骤，从而产生其上布置有弹性纤维的表面上无细胞装置。

在一个实施方案中，从细胞培养物中取出装置，以便将培养物的细胞留在细胞培养物中，从而将细胞与装置分离。然后可重复使用培养物以将弹性纤维提供给单独的或不同的装置。

在另一个实施方案中，细胞不在装置上固定、或裂解或杀死。

涉及无细胞装置的上述实施方案的另一个优点是这种装置可普遍使用，因为它应不含有同种异体抗原。弹性纤维本身不被认为是同种异体抗原。然而，细胞培养物的细胞的其他组分可以是免疫原性的。通过从细胞培养物中取出装置以使细胞培养物的细胞留下或保留在培养物中，可使得使用细胞衍生的免疫原污染装置的可能性最小化。

根据以上所述，在一个实施方案中，可提供一种用于制造其上布置有弹性纤维的装置的方法，该方法包括：

-使细胞培养容器中的细胞培养物维持在使细胞能够从原弹性蛋白形成弹性纤维的条件下，细胞培养物包含细胞、细胞培养基和原弹性蛋白；

-在容器中提供装置，从而使装置与细胞培养物接触，以使培养物的一直生长的细胞能够将由细胞形成的弹性纤维沉积到装置上；以及

-从细胞培养物中取出装置，以便将培养物的细胞留在细胞培养物中，从而将细胞与装置分离，从而产生其上布置有弹性纤维的装置。

如上所述，本文描述的装置可采用生物或合成聚合物的支架、基质或网络的形式。它也可采用具有一个或多个不可渗透的惰性表面的结构的形式。这种装置可在体内或体外用作细胞或组织的结构支持物，使组织形成、分化或再生或作为治疗剂的递送系统。这种装置可在体内系统或设计用于体内系统的装置内承载、膨胀、填充或形成屏障或隔室。

在一个特别优选的实施方案中，该装置包括胶原蛋白，优选地1型胶原蛋白，但是该装置也可包括ii型和/或iii型。胶原蛋白可源自任何来源，包括不溶性胶原蛋白、可溶于酸性、中性或碱性水溶液的胶原蛋白、以及可商购的那些胶原蛋白。用于胶原蛋白的典型动物来源包括但不限于来自牛、猪、绵羊、cuprine和禽类来源的重组胶原蛋白、纤维状胶原蛋白以及来自诸如牛骨和鼠尾肌腱等来源的可溶性胶原蛋白。

在一个优选的实施方案中，该装置还包括糖胺聚糖或gag。gag是交替共聚物，其由己糖胺残基糖苷键合并以或多或少规则的方式与己糖醛酸或己糖部分交替组成。各种形式的糖胺聚糖(gag)可包括透明质酸、6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和硫酸皮肤素。

该装置还可包括可在制造过程中与胶原蛋白组合使用的分子，包括但不限于甲壳质、脱乙酰壳多糖、纤粘蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白聚糖等、或它们的组合。

优选地，含胶原蛋白的装置包括通过如上所述的gag交联和共价键合的胶原分子。交联度可确定装置的生物降解性。通常，交联密度越大，降解速率越低，反之亦然。戊二醛可用于交联胶原蛋白-gag复合材料，尽管用于交联的其他方法包括辐射和脱水热方法。

优选地，该装置是可生物降解的。在该实施方案中，弹性纤维可在装置退化后在组织中持久存在。

在一个实施方案中，含胶原蛋白的装置是模板，优选地是可生物降解的材料，其孔径为约9μm至630μm，孔体积分数大于约80％，并且生物降解速率足以显著延迟或阻止伤口收缩率使得伤口收缩到其原始区域的一半所需的时间大于约15天。优选地，可生物降解材料包含平均尺寸在约20μm至约125μm范围内的孔。优选地，可生物降解材料在体外胶原酶测定中的降解速率低于约140个酶单位，优选地低于约120个酶单位。优选地，模板中的胶原分子被交联并与糖胺聚糖共价键合。这种模板及其制造方法公开在美国专利4,987,840，其全部内容通过引用并入本文。

本领域技术人员将能够容易地确定合适的生物材料或生物材料的混合物，其可用于本发明的装置的组合物中。生物材料可来自这些装置中使用的任何典型材料，包括但不限于陶瓷、合成聚合物和天然聚合物。陶瓷可包括但不限于羟基磷灰石(ha)和磷酸三钙(tcp)。合成聚合物包括但不限于聚苯乙烯、聚-1-乳酸(plla)、聚乙醇酸(pga)、聚-dl-乳酸-共-乙醇酸(plga)和聚甲基丙烯酸酯(pma)。天然聚合物包括但不限于细胞外基质组分，诸如胶原蛋白和gag。另外，该装置可包括脱细胞尸体或动物组织，包括但不限于脱细胞真皮。

优选地，该装置不是玻璃。

在一个实施方案中，该装置可采用片、层或管的形式。

该装置可以是多层的，其中第一层是合成或生物聚合物(诸如胶原蛋白和gag)的复合物，作为第一层的一侧上的第二层形成屏障或隔室(例如湿度控制层)，并且第三层为在第一层的相对侧上沉积的弹性纤维形式。第一层可以是穿孔的，或者它可包含使得物质、水或气体能够控制穿过装置的孔或狭缝。形成第一层的聚合物的示例包括合成聚合物材料，诸如有机硅聚合物。

通常，根据本发明的装置(即其中将弹性纤维布置或沉积在其上的装置)不是细胞培养容器或其部分。

在一个实施方案中，装置的表面不包含原弹性蛋白，或不包含合成交联的原弹性蛋白或合成的弹性蛋白。

在一个特别令人惊讶的发现中，本发明人进一步发现，从成熟老年个体获得的成纤维细胞在原弹性蛋白存在下具有显著降低的形成弹性纤维的能力。此外，已经发现，通过培养基中新生儿成纤维细胞的生长来调节的细胞培养基可用于加强、或加速或以其他方式通常增加细胞表面上的弹性纤维产生。最后，还发现从培养物中生长的新生儿成纤维细胞获得的条件培养基可用于增加成熟老年个体的成纤维细胞在原弹性蛋白存在下在细胞表面上产生弹性纤维的能力。在通过本发明的方法制造的装置中，后者是特别有用的优点，因为它使得在全厚度伤口中缺乏弹性纤维形成的老年个体能够利用其自身的成纤维细胞。

因此，在本发明的一个实施方案中，细胞培养基是条件细胞培养基。在另一个实施方案中，细胞培养基补充有条件细胞培养基。

在特别优选的实施方案中，条件细胞培养基由成纤维细胞，优选地新生儿成纤维细胞调节。

条件细胞培养基可包含如本文所述的表1中的蛋白质中的一种或多种。

在另一个实施方案中，提供了通过成纤维细胞增加弹性纤维产生的方法，该方法包括在包含原弹性蛋白的细胞培养基中培养成纤维细胞的步骤，其中培养基包括从培养基中的新生儿成纤维细胞的培养物中获得的条件培养基。优选地，其中要增加弹性纤维产生的成纤维细胞是青春期后成纤维细胞，优选地成人或成熟年龄成纤维细胞。

本发明还提供了一种通过上述方法中任一种制造的其上布置有弹性纤维的装置。

令人惊讶的是，本发明人发现，当将多孔装置与原弹性蛋白和能够形成弹性纤维的细胞一起培养时，形成三维的弹性纤维网络。不受理论束缚，发明人认为细胞培养物的细胞能够穿透装置的多孔结构，然后合成弹性纤维，从而形成在整个装置中互连的纤维网络。鉴于常规认为培养中的细胞通常以二维单层生长，即使细胞培养皿中存在三维结构，这一发现也是出乎意料的。因此，不仅令人惊讶的是细胞能够在多孔结构内迁移，而且更令人惊讶的是它们能够以足够的数量进行这种操作以能够在多孔装置内一起生长，以凝聚原弹性蛋白单体，然后产生可在整个多孔装置中互连的弹性纤维。这项工作被理解为在体外产生三维弹性纤维网络的第一个描述，

在三维装置中由成纤维细胞迁移和原弹性蛋白凝聚产生的弹性纤维的三维网络在结构上不同于在培养皿中以单层生长纤维生成细胞处产生的纤维网络。

在一个实施方案中，提供了一种用于制备多孔装置的方法，该多孔装置具有布置在该装置的表面上的弹性纤维，弹性纤维限定该装置的孔，该方法包括以下步骤：将包含细胞、细胞培养基、原弹性蛋白和多孔装置的细胞培养物维持在使细胞能够迁移到装置的孔中并在限定装置的孔的表面上形成弹性纤维的条件下；从而制造出具有布置在其上的弹性纤维的多孔装置。在整个装置中连接孔的情况下，弹性纤维可连接整个装置。在该实施方案中，弹性纤维可通过生长细胞沉积到装置上，或者，弹性纤维可通过在细胞培养完成时去除已经迁移到装置中或装置上的细胞的作用而沉积到装置上。可在本发明的该实施方案中使用的细胞、装置的组成和三维结构、以及培养条件通常可如上所述。可导出装置的截面的横截面图像，以评估细胞培养物中弹性纤维的三维结构的发展。

本发明还提供了一种旨在用于组织再生或修复或其他治疗应用的装置，其具有通过细胞布置在装置上的弹性纤维。在另一个实施方案中，本发明提供了旨在用于组织再生或修复或其他治疗应用的装置，该装置具有布置在其上的细胞合成弹性纤维，优选地成纤维细胞合成的弹性纤维。在这些实施方案中，弹性纤维非共价连接到装置上。弹性纤维可在装置的表面上以分支或非分支纤维网的形式提供。优选地，弹性纤维在装置的表面上以分支纤维网络的形式提供。该设备可包含或可不包含细胞。该装置可被构造成使得被组织再吸收。在一个实施方案中，该装置由胶原蛋白构成。

本发明还提供了一种在伤口部位形成含弹性纤维的组织的方法，包括使伤口与上述装置在使得伤口愈合的条件下接触，从而在伤口部位形成含有弹性纤维的组织。优选地，伤口是全厚度真皮伤口。在其他实施方案中，伤口部位可位于弹性组织中，诸如韧带、动脉或肌腱，并且提供该装置以便将弹性纤维网络递送到伤口部位以使得弹性纤维能够放置在伤口部位中，因此，当伤口愈合时，为组织提供弹性并恢复弹性功能。

在另一个实施方案中，在伤口修复方法中，提供了将其上布置有弹性纤维的装置提供给伤口的步骤。伤口可以是真皮的全厚度伤口。通常，将该装置提供给伤口，目的是将细胞合成的弹性纤维提供给伤口的深层真皮，优选地提供给真皮的网状区域。在该实施方案中，该装置可被构造成被组织再吸收，或者以便与组织相容。例如，该装置可由胶原蛋白构成。在该实施方案中，伤口可提供有其他化合物以促进伤口修复和/或闭合。

在另一个实施方案中，提供了一种装置，其上布置有弹性纤维，优选地根据上述方法制备，用于伤口修复，优选地真皮伤口的伤口修复，更优选地用于全厚度真皮伤口的伤口修复，更优选地用于向全厚度真皮伤口的深层网状区域提供弹性纤维。在另外的实施方案中，提供了一种装置，其上布置有弹性纤维，优选地根据上述方法制备，用于伤口修复，包括用于修复血管，或用于修复器官和组织诸如肺部或其他需要弹性纤维进行伤口修复的器官中的伤口。

应当理解，在本说明书中公开和限定的本发明扩展到所提到的或从文本或附图中显而易见的两个或更多个单独特征的所有可选组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种替代方面。

实施例

1.材料和方法

1.1人类真皮成纤维细胞

本研究中使用的人真皮成纤维细胞来源于雄性新生儿(nhf45cthermofisher；澳大利亚昆士兰大学x.q.wang的nhf8909赠品)，一名10岁男性(gm03348coriell医学研究所)，一名31岁男性(来自澳大利亚新南威尔士州康科德遣返总医院烧伤科的同意烧伤患者，按照医院研究和伦理委员会批准)，一名51岁男性(142brsigma)和一名92岁男性(ag04064coriell医学研究所)。

1.2原弹性蛋白

如前所述[26，27](elastagenptyltd)从细菌培养物中纯化对应于genbank登录号aac98394(gi182020)的氨基酸残基27-724的重组人原弹性蛋白同种型shelδ26a(不含结构域26a的合成人弹性蛋白)。

1.3细胞培养

1.3.1弹性发生模型

将人真皮成纤维细胞(5×10⁴个细胞)接种在含有dmem(lifetechnologies)和10％(v/v)胎牛血清(fbs；lifetechnologies)和1％(v/v)pen/strep(sigma)的新鲜培养基(fm)的12孔组织培养板的孔中的玻璃盖玻片上。将细胞在37℃、5％co2下培养，每2-3天更换培养基。在培养的第10天，向每个孔中加入1mg原弹性蛋白(过滤灭菌；10mg/ml磷酸盐缓冲盐水(pbs))，并将细胞再培养七天，在第13天和第15天更换培养基。将没有添加原弹性蛋白的对照细胞样品培养17天。在添加原弹性蛋白后1、3或7天，将培养的细胞在pbs中洗涤两次，然后用4％(w/v)多聚甲醛固定20分钟，并用0.2m甘氨酸猝灭。将细胞与0.2％(v/v)tritonx-100一起温育6分钟，用5％(w/v)牛血清白蛋白在4℃下封闭过夜，并用1:500稀释的ba4小鼠抗弹性蛋白抗体(sigma)染色1.5小时和1:100稀释的抗小鼠igg-fitc抗体(sigma)染色1小时。使用具有dapi(invitrogen)的prolonggold抗褪色试剂将盖玻片固定在载玻片上。将载玻片放置24小时，然后使用共聚焦显微镜进行分析。

1.3.2条件培养基

通过从fm中新生儿真皮成纤维细胞的3天培养物收集培养基，过滤灭菌并以1:1的比例与含有20％(v/v)fbs和1％(v/v)的pen/strep的dmem混合来制备条件培养基(cm)。将含有20％fbs的培养基加入以考虑从新生儿成纤维细胞的3天fm培养物中收集的培养基中去除的血清成分。cm中的最终fbs浓度高达15％。为了控制这种可能性，还测试了含有具有15％(v/v)fbs和1％(v/v)pen/strep的dmem的培养基。来源于51岁男性(142br)的成纤维细胞在fm、cm或对照培养基中用在第10天加入的1mg原弹性蛋白(过滤除菌；10mg/ml的pbs溶液)培养17天。如上所述固定样品并染色。

对于大小分级实验，cm通过amiconultra-15离心过滤装置(millipore；100kda和30kdamwco)。将浓度>100kda和30kda-100kda的溶液在含有10％(v/v)fbs的dmem中重新稀释，并如上所述在每种培养基中培养细胞。

1.3.3rna提取

将一式三份的成纤维细胞样品(1×10⁵个细胞)接种到6孔组织培养板的孔中，并在fm(新生儿和142br)或cm(142br)中培养11天，每2-3天更换培养基。收获细胞并使用rneasyminikit(qiagen)提取rna。

1.3.4重复原弹性蛋白补充

如上所述，将人真皮成纤维细胞在fm中培养31天。在第10天、第17天和第24天向孔中加入原弹性蛋白(1mg过滤灭菌；10mg/ml的pbs溶液)，使培养物补充1次、2次或3次原弹性蛋白添加。还培养了未补充的细胞。如上所述固定样品并染色。

1.3.5含有患者细胞和弹性纤维的真皮替代物的制备

将idrt(integralifesciencescorporation，plainsboro，nj)；1.5×1.5cm正方形置于12孔细胞培养板的孔中，并接种新生儿真皮成纤维细胞(2×10⁵个细胞，200μlfm)。在37℃、5％co2下1小时后，向每个孔中再加入3ml的fm。将细胞在idrt上培养长达33天，每2-3天更换培养基。在第12天、第19天和第26天向孔中加入原弹性蛋白(1mg过滤灭菌；10mg/ml的pbs溶液)。在第19天、第26天和第33天，将样品固定并在1次、2次或3次添加原弹性蛋白后染色。还制备了用细胞培养33天的idrt样品，以及没有补充原弹性蛋白的idrt样品或没有细胞和3次添加原弹性蛋白的idrt样品。将样品固定在10％福尔马林中。对于横截面成像，将样品嵌入石蜡中，切片并用苏木精和曙红或ba4小鼠抗弹性蛋白抗体和hrp缀合的抗小鼠二抗(dakoenvision系统hrp标记的聚合物抗小鼠)染色并使用液体dab+底物色原体系(dako)显色。使用如上所述染色的样品的共聚焦显微镜获得表面视图。

1.4rna分析

对于每种条件，使用affymetrixhumanprimeview(u219)阵列在theramaciotticenterforgenefunctionanalysisnswaustralia探测并通过微阵列分析来分析一式三份rna样品。使用expressionconsole1.0软件(affymetrix)以使用rma-sketch对数据进行标准化，然后使用hugene1.0stv1库和注释文件进行注释。在三次重复之间平均信号强度并确定sd。为了检测差异表达的基因，将小于0.05的p值与高于2.0的倍数变化截止值和高于背景(即200)水平的信号强度组合使用。当对于同一基因的多个探针组显示差异表达时，具有最大信号强度的探针组被报告为代表性的。

1.5共聚焦显微镜

用olympusfluoviewfv1000共聚焦显微镜观察荧光免疫染色的样品，使用405nm激光激发以检测dapi荧光，488nm激光激发以检测fitc荧光，559nm激光激发以检测弹性蛋白自发荧光。使用imagej软件分析图像[28]。从每个样品的10个视场(fov)中取出z-堆叠，转换成最大投影图像并分析弹性纤维的总面积和相对纤维数量。在所有情况下，对10个fov的结果进行平均以得到每个样品的结果。对于原弹性蛋白染色分析的百分比面积，使用自动软件生成的阈值来排除每个图像上的背景像素。测量绿色像素的数量并将其转换为每个总面积的％。为了比较相对光纤数，绘制三条平行线并均匀分布在每个fov上。计算穿过每条线的纤维数，加在一起并除以三。还计算每个fov的细胞核数。

1.6统计

使用graphpadprism6.07版软件进行学生的非配对t检验(rna分析，相对纤维数分析)或使用bonferroni多重比较检验(所有其他分析)的单向anova。在p<0.05的值下接收统计学显著性。数据表示为cm和多个原弹性蛋白加成实验的平均值±sem和rna分析的平均值±sd。在附图中，显著性用星号表示(^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，^****p<0.0001)。

2.结果和讨论

2.1人真皮成纤维细胞的弹性发生

我们和其他人[20，29-31]已经使用体外细胞培养模型加入重组原弹性蛋白来研究细胞的弹性发生。在我们的模型系统中，在加入纯化的重组人原弹性蛋白之前培养人真皮成纤维细胞10-12天，然后再培养多达7天。在没有外源性原弹性蛋白的情况下，没有明显的弹性纤维合成(图1a)。添加原弹性蛋白后，蛋白质以小球的形式沉积到细胞外基质中(图1b)，如正常的弹性发生过程中也可见[32，33]。在产生广泛分支的弹性纤维网络(图1d)之前，随后的纤维形成最初在细胞方向上对准(图1c)。使用该模型，我们发现来源于广泛供体年龄(新生儿、10岁、31岁、51岁和92岁)的人真皮成纤维细胞在对其供应原弹性蛋白时可制造弹性纤维(图2)。然而，纤维架构随着年龄而变化；源自较老年龄组的细胞产生较少、较粗和较小分枝的纤维。这表明需要修复或更换老年个体中受损弹性纤维网络的真皮治疗可能效果较差。

2.2用cm增强弹性发生

鉴于新生儿细胞产生广泛的弹性纤维网络的能力，我们探索了新生儿真皮成纤维细胞cm对弹性发生的影响。成纤维细胞来自51岁并用新生儿cm治疗。然后加入原弹性蛋白以引发弹性发生。与fm中的生长相比(图3a)，cm(图3b)导致原弹性蛋白沉积到细胞外基质中增加2.5倍(图3d)，这是由于与弹性纤维的数量相关增加2.5倍(图3e)有关。当fm与对照培养基(15％fbs；图3d)相比时，没有看到原弹性蛋白沉积的差异。随着cm的加入，这些老年人细胞显示出与新生儿细胞的那些弹性网络相当的弹性网络(图3c)。在所有情况下，无论较老的细胞是在fm中还是在cm中生长，每个视野的细胞核数量都难以区分。

对在fm(新生儿和51岁)或cm(51岁)中培养11天的成纤维细胞的一式三份样品进行微阵列分析，以研究cm增强老年人细胞中弹性发生的机制。源自51岁的细胞显示相当(2倍以内)的基因表达水平，无论它们是在cm中或fm中，并且证实原弹性蛋白表达没有显著变化(信号强度1746±228(cm)，2060±144(fm)；p＝0.113)。这些发现支持一种模型，其中cm中的可溶性因子直接影响老年人细胞的弹性基质的发展，而不是基因表达。在此基础上，我们比较了新生儿细胞的表达数据与老年人细胞的表达数据，两者都在fm中生长。鉴于老年人细胞能够制造弹性纤维，所得数据被过滤为仅包括由新生儿细胞和老年人细胞表达的细胞外基质相关蛋白，其中信号强度>200，并且显示出统计学显著性(p<0.05)的新生儿细胞表达水平增加(>2倍)。这导致7种差异表达基因的鉴定(表1)。

大多数鉴定的目标(原纤蛋白2、腓骨蛋白1、微原纤维相关蛋白4和潜在tgfβ结合蛋白1)是已知的弹性纤维组分。原纤蛋白-2(315kda)主要调节弹性纤维组装的早期过程[34]。它在早期发育期间表达，在出生后不久表达关闭。在胎儿表达期间，原纤维蛋白2有助于微原纤维核心结构，然后由原纤蛋白1在出生后覆盖[35]。腓骨蛋白1(70kda-100kda)与原弹性蛋白结合[36，37]。微纤维相关蛋白4(mfap4；36kda单体)结合原弹性蛋白，desmosine，原纤蛋白1和原纤蛋白2。mfap4促进原弹性蛋白的凝聚，并已定位于弹性蛋白-微纤维界面[38]。为了支持这些发现，将mfap4添加到真皮成纤维细胞培养物中增强了弹性纤维的形成，其通过与原纤蛋白1的拟议相互作用来组装微纤维中发挥作用[39]。潜在的tgfβ结合蛋白1(187kda)与原纤蛋白1相互作用[5，40]。在其余的三个差异表达基因中，血小板反应蛋白2(150kda-160kda)参与皮肤胶原纤维形成[41]，而periostin(80kda-90kda)和生腱蛋白c(250kda-300kda)参与弹性纤维瘤的发病机制，弹性纤维瘤是一种良性纤维性软组织疾病，其特征是过多的异常弹性纤维数目[42]。

可能许多这些因素共同作用以增强弹性发生。为了验证这一假设，老年人成纤维细胞在fm中培养并补充有基于分子量分级的cm。将级分分成含有<30kda的因子的那些、30kda-100kda的因子的那些和>100kda的因子的那些。当30kda-100kda级分独立地用于补充fm时(图3f)，但未达到完整cm所见的水平，这表明多个因子的参与，获得了增加的弹性发生。

2.3通过多种原弹性蛋白处理增强弹性发生

真皮成纤维细胞对添加的原弹性蛋白的弹性原性依赖性用多轮原弹性蛋白补充进行测试。在31天培养期内另外三种原弹性蛋白处理表明，来自各个年龄组(0岁、10岁、31岁和51岁的供体)的成纤维细胞具有将重复剂量的原弹性蛋白掺入生长的弹性蛋白网络中的能力(图4)。无论原弹性蛋白添加量如何(0-3)，所有样品的总温育时间为31天。在没有外源性原弹性蛋白补充的情况下，没有弹性纤维合成的证据证明在纤维形成中需要添加原弹性蛋白。该过程伴随着细胞基质厚度的增加，其与每次添加蛋白质相关。与没有原弹性蛋白补充的培养物相比，三种处理使新生儿真皮成纤维细胞培养物的厚度增加1.5倍(图5a)。此外，含有弹性纤维的细胞基质的比例相应地从一次原弹性蛋白处理的59％增加到三次原弹性蛋白处理后的78％(图5b)。

2.4弹性纤维富集真皮替代物

弹性纤维产生不足的主要原因是在受伤的出生后组织中未能上调原弹性蛋白基因表达。在成人中的大多数弹性组织中仅发现原弹性蛋白mrna的低维持水平[43]，这意味着在修复全厚度伤口时存在长期缺乏弹性蛋白。

我们使用此处描述的技术通过在idrt上预温育供体成纤维细胞和外源原弹性蛋白来避免这种缺陷，idrt是主要的商业基于胶原蛋白的真皮替代物。这种方法在上层中递送弹性纤维，其随着原弹性蛋白剂量的增加而增加(图6)。弹性蛋白染色的横截面图像证实在表面上和支架内存在弹性蛋白。只有当细胞利用补充的原弹性蛋白时，我们才能看到显示ba4染色和弹性蛋白内在自发荧光特征的纤维[21]。在与细胞一起培养并且没有原弹性蛋白或者有原弹性蛋白但没有细胞的idrt样品中，弹性纤维不明显。原弹性蛋白的重复应用在idrt的顶表面处产生了厚的含弹性纤维的层。荧光弹性蛋白染色和共聚焦成像证实在idrt的上层中存在广泛的弹性纤维网络，提供两个有效层：较低的idrt区域，其顶部具有富含患者弹性纤维的改良基质。

这种设计很有吸引力，因为它有助于在手术治疗期间将预制的弹性纤维网络递送到深层真皮中(图7)。这种方法很有吸引力，因为这种弹性纤维网络是使用自体真皮成纤维细胞制成的，因此含有自体蛋白质成分。我们先前已经证明重组人原弹性蛋白具有良好的耐受性[44]。该系统被设计成与人类临床应用相容，诸如修正手术，因为它强调人类供体细胞和合成的人类细胞外基质。

3.结论

我们描述了一种旨在将可调节水平的组织学可检测的患者弹性蛋白递送到全厚度伤口部位的方法和混合生物材料。这种方法解决了持续的尚未满足的需求，因为修复伤口缺乏这种弹性基质。先前，教条断言弹性蛋白合成在童年早期就会减弱，但在此表明，无论真皮成纤维细胞供体的年龄如何，我们都可通过添加外源性原弹性蛋白来克服这种限制。我们描述了如何使用cm进一步增强老年人细胞的合成。该方法将弹性蛋白作为主要真皮修复模板上的层递送，用于与深层真皮接触，以便在手术期间将预制弹性纤维递送到生理上适当的部位以修复愈合全厚度伤口部位处的疤痕组织。

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表1