本发明具体涉及一种菱角壳提取物的制备方法及其在糖尿病治疗方面的应用。
背景技术：
菱属于菱科（trapaceae）、菱属（trapal.）植物，为一年生水生草本植物，在我国湖泊、河湾等淡水水域有广泛分布或栽培[1]。菱角，又名水栗、沙角、芰实，为菱的果实。菱角采收后除少量以鲜果食用直接上市外，大部分去壳以菱角仁加工成各种产品。加工过程中产生的菱角果壳由于缺乏利用价值而被大量丢弃，既浪费了资源又会产生环境污染。目前有报道菱角壳提取物具有α-糖苷酶抑制作用，可以改善链脲佐菌素和四氧嘧啶造成的1型糖尿病小鼠的高血糖症状。但是尚未有对2型糖尿病治疗的报道。
本发明提供了一种菱角壳提取物的制备方法及其对2型糖尿病的治疗作用。
技术实现要素：
本发明提供了一种菱角壳提取物的制备方法及其在2型糖尿病治疗方面的作用。
本发明提供的菱角壳提取物的制备方法包括以下步骤：
（1）将菱角壳干燥粉碎；
（2）用乙醇、甲醇或丙酮为溶剂提取步骤（1）中得到的菱角壳干燥粉末，将提取液减压浓缩成浸膏；
（3）将步骤（2）中得到的浸膏分别用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取；所述二氯甲烷、乙酸乙酯的重量为浸膏重量的10-40倍；
（4）将步骤（3）得到的乙酸乙酯提取物减压浓缩干燥，得菱角壳提取物。
由本发明提供的菱角壳提取物的制备方法得到的菱角壳提取物，对由高糖高酯加stz诱导的二型糖尿病小鼠有显著的治疗作用，可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高糖耐量，并可以显著改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗症状。
本发明可以通过口服给药方式施用于2型糖尿病治疗的患者，也可以制成各种剂型的药品、食品或健康功能性食品。
表示模型组与空白组相比，显著性（p＜0.05），**表示模型组与空白组相比，显著性（p＜0.01），#表示给药组与模型组相比，显著性（p＜0.05），##表示给药组与模型组相比，显著性（p＜0.01）。
具体实施方式
总酚含量的测定：
标准曲线建立：
精密称取没食子酸标准品至棕色容量瓶中，用水溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的标准溶液。精密移取0、5、10、20、30、40、50μl没食子酸标准溶液于96孔板中，依次加入50μl10%folin-ciocalteu’s试剂，振荡3min后加入50μl10%na2co3溶液充分混匀，以水溶液补足至150μl，在室温下放置1h。将96孔板放入酶标仪中测定760nm处的吸光值，重复3次，取平均值。以吸光值（y）和没食子酸含量（x）绘制总酚含量标准曲线。
样品含量测定：
精密称取样品粉末，用dmso溶解，配制成1.0mg/ml的溶液。分别精密移取5μl溶液于96孔平板中，按标准曲线项下方法依次加入显色剂，以不加显示剂为空白，测定吸光值，根据标准曲线求得各样品的总多酚含量（总多酚以没食子酸计）。
实施例1
取干燥菱角壳0.5kg粉碎成粗粉，依次用30%乙醇4l、4l冷浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏。以二氯甲烷萃取2次每次250ml，再以乙酸乙酯萃取3次每次250ml，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥，得菱角壳提取物。提取物经紫外分光光度法检测其总多酚含量为78%。
实施例2
取干燥菱角壳0.5kg粉碎成粗粉，依次用50%丙酮4l、4l冷浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏。以二氯甲烷萃取2次每次250ml，再以乙酸乙酯萃取3次每次250ml，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥，得菱角壳提取物。提取物经紫外分光光度法检测其总多酚含量为91%。
产品实施例3
取干燥菱角壳0.5kg粉碎成粗粉，依次用80%甲醇4l、4l加热回流提取两次，每次1小时，合并提取，减压浓缩呈稠膏。以二氯甲烷萃取2次每次250ml，再以乙酸乙酯萃取4次每次500ml，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥，得菱角壳提取物。提取物经紫外分光光度法检测其总多酚含量为81%。
产品实施例4
取干燥菱角壳1.0kg粉碎成粗粉，依次用50%乙醇10l、10l加热回流提取两次，每次1小时，合并提取，减压浓缩呈稠膏。以二氯甲烷萃取2次每次500ml，再以乙酸乙酯萃取4次每次500ml，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥，得菱角壳提取物。提取物经紫外分光光度法检测其总多酚含量为95%。
实验例1
2型糖尿病小鼠模型建立：
取18~22gspf级icr小鼠，自由饮食三天适应动物房环境后，正常组喂食小鼠全价营养颗粒饲料，其余小鼠喂食高糖高脂饲料，4周后喂食高糖高脂饲料的小鼠过夜禁食12小时，腹腔注射新配置的stz100mg/kg，自由饮食三天后禁食过夜小鼠眼内眦取血测定血糖值分组。
动物分组：
选取小鼠血糖值≥7.8mmol/l为造模成功小鼠。选取造模成功icr小鼠40只，随机分为4组，分别为模型组（dm），二甲双胍治疗组（metformin，met，200mg·kg-1·d-1），菱角壳提取物低剂量组（ll，15mg·kg-1·d-1），菱角壳高剂量组（lh，30mg·kg-1·d-1）。空白组给予等体积的0.5%cmc-na。
检测方法:
空腹血糖（fbg）：小鼠眼内眦取血，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定，具体实验过程见葡萄糖测定试剂盒。
空腹血清胰岛素（fins）的测定：双抗一步夹心酶联免疫法测定。
胰岛素抵抗指数（homa-ir）=空腹血糖水平（fpg，mmol/l）×空腹胰岛素水平（fins，miu/l）/22.5。
口服葡萄糖耐量实验（oralglucosetolerancetest，ogtt）:
在给药的第三周末，对小鼠进行ogtt实验。实验前禁食不禁水12小时（前一天21:00―次日9:00），取血作为0min，灌胃葡萄糖溶液，剂量为2g/kg，糖负荷后于30、60、120、180min小鼠眼内眦取血，葡萄糖脱氢酶法测定0、30、60、120、180min的血糖值。绘制ogtt曲线，按下式计算曲线下面积（areaunderthecurve,auc）：auc=0.5*(fbg0+fbg30)/2+0.5*(fbg30+fbg60)/2+1*(fbg60+fbg120)/2+1*(fbg120+fbg180)/2。
实验结果：
表1菱角壳提取物对stz诱导2型糖尿病小鼠空腹血糖（fbg）的影响
如表1所示，与模型组相比，给予菱角壳提取物15mg/kg，30mg/kg后，可显著降低2型糖尿病小鼠模型小鼠空腹血糖的含量。
表2菱角壳提取物对stz诱导2型糖尿病小鼠糖耐量（ogtt）的影响
如表2所示，与模型组相比，给予菱角壳提取物15mg/kg，30mg/kg后，可显著改善2型糖尿病小鼠模型小鼠的糖耐量。
表3菱角壳提取物对stz诱导2型糖尿病小鼠fins和homa-ir的影响
如表3所示，与模型组相比，给予菱角壳提取物15mg/kg，30mg/kg后，可显著改善2型糖尿病小鼠模型小鼠的胰岛素抵抗。