本发明涉及小分子羧酸类化合物吡啶-2,6-二甲酸在制备新德里金属β-内酰胺酶（ndm-1）酶抑制剂中的用途，吡啶-2,6-二甲酸可有效抑制ndm-1的活性，从而保护β-内酰胺类抗生素不被水解，进一步可采用该抑制剂与抗生素联用的复合疗法杀菌，提高抗生素敏感性。
背景技术：
β-内酰胺类抗生素是临床上治疗细菌感染最常用的一类抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类等。然而，随着此类抗生素的乱用和滥用，细菌耐药现象日益严重。细菌耐药性的主要原因之一是β-内酰胺酶的产生，尤其以ndm-1在临床耐药细菌中最为常见。自2008年发现以来，携带ndm-1基因的“超级细菌”已传播到全球70多个国家。目前，ndm-1基因已被发现于肠杆菌科细菌、鲍氏不动杆菌、霍乱弧菌、寡养单胞菌和绿脓假单胞菌等，占据了60%的临床耐药菌株，对临床抗感染治疗带来严峻挑战。
为了抵抗细菌耐药性，临床上常采用抑制剂与抗生素联用的复合疗法，通过抑制剂抑制β-内酰胺酶活性以恢复细菌对抗生素的敏感性。例如抑制剂克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等，因其可以抑制丝氨酸-β-内酰胺酶活性，已广泛用于临床抗感染治疗。但是此类抑制剂对以锌离子为活性中心的ndm-1不具有抑制作用，故开发临床可用的ndm-1抑制剂具有重要的临床价值。目前研究表明，一些含有巯基和羧酸的化合物可以有效抑制体外ndm-1酶的活性，但对于细胞水平的ndm-1效果不明显，限制了其在临床上的应用和发展。
技术实现要素：
本发明目的是提供小分子羧酸类化合物吡啶-2,6-二甲酸在制备ndm-1酶抑制剂中的用途，吡啶-2,6-二甲酸可有效抑制ndm-1的活性，从而保护β-内酰胺类抗生素不被水解，进一步可采用该抑制剂与抗生素联用的复合疗法杀菌，提高抗生素敏感性。
本发明实现过程如下：
吡啶-2,6-二甲酸作为β-内酰胺酶抑制剂的应用。
吡啶-2,6-二甲酸在制备抑制耐药细菌活性的药物中的应用，所述耐药细菌是产新德里金属β-内酰胺酶（ndm-1）的革兰氏阴性及阳性细菌，所述革兰氏阴性及阳性细菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗氏柠檬酸菌、金黄色葡萄球菌，最好是金黄色葡萄球菌。
本发明以吡啶-2,6-二甲酸作为ndm-1酶抑制剂，保护β-内酰胺类抗生素不被ndm-1酶水解，所述β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类或单环β-内酰胺类抗生素，优选碳青霉烯类的亚胺培南。
本发明所述的吡啶-2,6-二甲酸可以作为开发临床可用ndm-1抑制剂的先导化合物。
本发明从一系列小分子羧酸类化合物中筛选出有效抑制ndm-1活性的吡啶-2,6-二甲酸，通过测试该化合物对纯化ndm-1酶的ic50值验证其可以有效抑制ndm-1酶的活性，最后检测其与亚胺培南联用对临床ndm-1耐药菌的抑制效果以验证两种化合物在提高临床耐药菌对亚胺培南敏感性方面的疗效。
本发明的积极效果：发明人发现吡啶-2,6-二甲酸可以有效地减小和消除ndm-1对抗生素的水解和破坏，从而保护抗生素的杀菌作用，为研制临床可用抑制剂提供了前导化合物，有助于耐药细菌感染的治疗。
附图说明
图1为抑制剂筛选体系的底物头孢硝噻吩的化学结构式；
图2为小分子羧酸类化合物对ndm-1酶活性的百分抑制率；
图3为酶活测定体系及体外抑菌体系的底物亚胺培南的化学结构式；
图4为吡啶-2,6-二甲酸作用下，ndm-1剩余活性分数对抑制剂浓度的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
小分子羧酸类化合物的结构如下：
1-11分别是富马酸、酒石酸、原儿茶酸、扁桃酸、没食子酸、丁香酸、异阿魏酸、反式阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和吡啶-2,6-二甲酸。
实施例1小分子羧酸类化合物对ndm-1酶的抑制活性
采用酶标仪高通量筛选法，以头孢硝噻吩为底物（结构见图1），在486nm波长下检测ndm-1型金属β-内酰胺酶水解底物时吸光度的变化，从而得到水解过程前后底物的变化量并表示反应酶催化反应的快慢。测定缓冲液为50mmtris-hcl，100mmnacl,ph7.0，温度25˚c。具体过程如下：
步骤1.底物头孢硝噻吩溶液的配制
将头孢硝噻吩溶于dmso中配制成20mm的母液，并用超纯水稀释成500μm储存于-20˚c备用。
步骤2.ndm-1溶液的配制
称取少量纯化的ndm-1溶于缓冲液（200mmtris-400mmnacl，ph=7.0）中，用紫外分光光度计测量280nm下的吸光度，依据朗伯-比尔定律a=εbc计算浓度，并稀释成60nm存于4˚c备用。
步骤3.小分子羧酸类化合物的配制
将小分子羧酸类化合物溶于超纯水配制成4mm母液并稀释成400μm备用。
步骤4.小分子羧酸类化合物对ndm-1酶的抑制活性
（1）取75μl60nmndm-1和75μl400μm抑制剂于试管中混匀，并放置于25˚c下孵育30min，使得酶与抑制剂充分混合；
（2）在96孔板的孔中先加84μl超纯水和16μl500μm头孢硝噻吩并混匀，当加入100μl酶与抑制剂混合液时开始计时，20min后加入50μl500mmedta停止反应。采用酶标仪检测反应前后在486nm的吸光度，计算底物的反应量以表示反应的快慢。以不加抑制剂的酶催化反应作为阳性对照，进而得到不同化合物对ndm-1的百分抑制率，判断化合物对ndm-1酶的抑制活性。
在上述体系中，ndm-1和头孢硝噻吩终浓度分别为15nm和40μm，20min内，该条件下酶催化反应为线性关系，故在此基础上检测抑制剂的效果。小分子抑制剂的终浓度为100μm，其对ndm-1活性的百分抑制率如图2.从图中可以看到，绝大多数的小分子羧酸类化合物仅能微弱的抑制ndm-1的活性，只有吡啶-2,6-二甲酸可以完全抑制ndm-1的活性。
实施例2吡啶-2,6-二甲酸对ndm-1酶抑制活性的检测
以亚胺培南为底物（结构见图3），在300nm波长下检测ndm-1型金属β-内酰胺酶水解底物时吸光度的变化，从而得到水解过程中底物的减少速率并以此表示反应过程的速率。测定缓冲液为50mmtris-hcl，100mmnacl,ph7.0，温度25˚c。具体过程如下：
步骤1.底物亚胺培南溶液的配制
将亚胺培南溶于缓冲液中，配制成10mm的溶液，并稀释成1mm备用，并放在4˚c保存。
步骤2.抑制剂溶液的配制
将化合物溶于缓冲溶液中，配制成1mm的溶液，再依据二倍稀释法准备9个浓度梯度的溶液，至最小浓度为1.95μm，并将上述系列溶液保存于4˚c。
步骤3.ndm-1溶液的配制
取少量纯化的ndm-1溶于缓冲液，于280nm测量吸光度，并根据朗伯-比尔定律a=εbc计算浓度为35μm，将其配制成1μm并放置在4˚c备用。
步骤4.抑制剂ic50值的测试
(1)首先将ndm-1分别与上述梯度抑制剂溶液混合（320μl抑制剂溶液+100μl1μmndm-1溶液+380μl缓冲液），并于25˚c下孵育30min，使得酶与抑制剂充分混合；
(2)取760μl缓冲液和40μl1mm亚胺培南加入比色皿混匀，作为空白对照；
(3)将200μl的(1)混合液加入比色皿的同时监测样品实时吸光度的变化，并计算前30s的吸光度变化速率得到反应速率。
在上述反应体系中，亚胺培南的终浓度是40μm，ndm-1的终浓度是25nm，抑制剂的终浓度在0.15-80μm范围内。采用graphpadprism5.0软件，以抑制剂浓度的对数为横坐标，ndm-1的剩余活性分数为纵坐标，非线性拟合得ic50值。实验时，已知的ndm-1抑制剂d-卡托普利作为阳性参照，测得的ic50=2.38±0.64μm，与文献报道值一致。从图4可知，吡啶-2,6-二甲酸对ndm-1的ic50为1.13±0.04μm，说明其可以有效抑制ndm-1酶水解亚胺培南药物。
实施例3.吡啶-2,6-二甲酸的体外抑菌活性实验
实验采取微量肉汤稀释法获得抗生素亚胺培南的mic值，药敏结果参考clsi标准（耐药：mic≥4μg/ml；中介：=2μg/ml；敏感：≤1μg/ml）。具体实施方式如下：
步骤1.灭菌操作
将本实验所用的枪头、离心管、锥形瓶、培养基（mh（b）肉汤培养基）等采用高温高压灭菌锅灭菌。
步骤2.抑制剂溶液的制备
将吡啶-2,6-二甲酸溶于灭菌的培养基中得到浓度为128mg/l的溶液，再采用二倍稀释法得64、32、16mg/l的溶液，将4种浓度的化合物溶液储存备用。
步骤3.抗生素溶液的制备
将亚胺培南溶于灭菌培养基中得128μg/ml溶液备用。
步骤4.待测菌的制备
本实验所用的临床耐药大肠杆菌已经过pcr验证，只含ndm-1基因，并储存于-80˚c。实验时，取冻存的菌种解冻，接种于灭菌的培养基中，并置于37˚c摇床上过夜培养；再将其按照1：100的比例接种于新鲜的培养基中继续培养（37˚c，震荡），该过程需监测菌液中细菌的生长情况，即通过读取od600的吸光度判断，直至吸光度为0.5时，停止培养，并将其按照1：100的比例稀释于上述4种浓度的抑制剂溶液中备用。
步骤5.抑菌实验
取无菌的96孔板，第1孔加入200μl128μg/ml亚胺培南溶液，第2至11孔分别加入100μl的培养基，从第1孔吸取100μl加入第二孔，混匀，再吸取100μl至第三孔，依次类推，第11孔吸取100μl弃去。此时各孔药物浓度依次为：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.625μg/ml，第十二孔加入200μl培养基(阴性对照)。上述亚胺培南梯度溶液需准备5组，第1组各孔加入100μl的稀释菌液，2-5组分别加入准备好的4中抑制剂和菌液的混合液100μl，并将加完样品的96孔板放置在37˚c培养20h。最后通过酶标仪检测od600的吸光值判断mic值。同时用标准菌株atcc25922作阴性质控。此外，将不同浓度抑制剂与菌液混合液进行培养判断抑制剂的抗菌活性。从表1可知，临床耐药菌对亚胺培南的mic为16μg/ml，而与吡啶-2,6-二甲酸联用后可以将mic减小为1μg/ml，证明吡啶-2,6-二甲酸可以有效协助亚胺培南治疗耐药菌感染。