本发明涉及中药有效成分应用技术领域，具体涉及五味子甲素在抑制多重耐药大肠杆菌生长中的应用。
背景技术：
当前，全球的公共卫生领域受到严峻的挑战。细菌对现有抗生素的耐药性日益严重和全新抗生素开发的乏力致使细菌感染性疾病的治疗越来越困难，人类可能将又一次面临无药可用的窘境。多重耐药菌的产生给临床治疗带来了巨大挑战，如无效的治疗不仅促使病情延迟，而且消耗社会资源、加重国家公共财政负担。同时，耐药的病原菌提高了感染性疾病的发生率和死亡率。
中药作为人类与疾病斗争的经验结晶，因其药用有效成分丰富和安全性，加上药理作用机制广泛，在细菌感染性疾病防治中发挥着重要的作用，一直被作为探寻抗生素替代药物的重要资源库。秦巴山区中药资源丰富，中草药的种植与开发近年来备受关注，具有广阔的应用与发展前景。
五味子是木兰科五味子属(Schisandra)植物，其中以五味子甲素为代表的木脂素类是五味子的重要活性成分。研究表明五味子活性成分具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保肝降酶、镇痛以及免疫调节等作用，还具有温补、益气、生津等保健作用。
文献报道了五味子果实提取物对大肠杆菌和灰霉菌有明显抑菌效果，可用于消化吸收系统杀菌消炎药物、食品防腐剂和作物灰霉病防治剂的开发。但是，五味子提取物对人源多重耐药大肠杆菌的抑菌情况尚未见到报道。
目前亟需发现具有抑制多重耐药大肠杆菌活性的成分，为开发新型抗生素替代物和解决耐药大肠杆菌的多重耐药困境提供实践基础。
技术实现要素：
本发明针对上述阐述的临床耐药难题，目的在于从现存的药用植物资源库入手，挖掘潜在的耐药菌株抑制剂，提供五味子甲素在抑制多重耐药大肠杆菌生长中的应用，为开发新型抗生素替代物和解决耐药大肠杆菌的多重耐药困境提供了实践基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
五味子甲素在抑制多重耐药大肠杆菌生长中的应用。
优选的，所述耐药大肠杆菌为人源耐氨苄西林、萘啶酸、头孢噻肟、环丙沙星和头孢西丁的大肠杆菌。大肠杆菌耐药性是通过纸片扩散法确定的，抗生素选自氨苄西林、亚胺培南、萘啶酸、环丙沙星、头孢噻污、阿奇霉素、庆大霉素、头孢他啶、阿米卡星、头孢西丁中的多种。
优选的，所述五味子甲素最低杀菌浓度为25.57μg/mL，最小抑菌浓度为3.13μg/mL。
本发明的有益效果体现在：
本发明基于五味子甲素对人源多重耐药大肠杆菌的作用的研究，利用五味子甲素抑制多重耐药大肠杆菌的生长，为抑制多重耐药大肠杆菌提出新的思路，具有重要的实践意义，在食品、药品等领域具有广泛的应用价值。
本发明明确了五味子甲素对耐抗生素氨苄西林、萘啶酸、头孢噻肟、环丙沙星和头孢西丁的人源大肠杆菌耐药性的抑制作用，有效缓解或解决多重耐药大肠杆菌的耐药感染问题，降低病死率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明的内容，而非对本发明的限定。
1、人源致病大肠杆菌的药敏实验
本发明以10株人源大肠杆菌为出发菌株，选用氨苄西林、亚胺培南、萘啶酸、环丙沙星、头孢噻肟、阿奇霉素、庆大霉素、头孢他啶、阿米卡星和头孢西丁10种常用抗生素的药敏试纸片进行药敏试验。
挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mL无菌生理盐水中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。无菌吸取50～200μL菌液，均匀涂布平板，室温下放置3～5min。用无菌镊子按要求将药敏纸片(直径为6mm)按要求紧贴于培养基表面，每种药敏纸片三个平行。将接种好的平板放置于36～37℃孵育16～24h。用0.02mm精度的游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径来判断药物的敏感性，抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2016)标准判定，判定标准见表1。实验结果见表2，结果显示，8#人源大肠杆菌可以耐受5种临床上常见的抗生素，因此将其作为下一步实验的研究对象。
表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定结果
表2.人源致病大肠杆菌的药敏实验中抑菌圈直径结果
注：表2中抑菌圈直径的单位为mm，数值均为三个平行的平均值。
2、五味子甲素对多重耐药菌株的抑制作用
为了充分考虑用药安全，本发明以五味子甲素单一活性成分为研究对象，以亚胺培南作为阳性对照，进行耐药性抑制作用的研究。挑取培养18～24h的纯菌落均匀溶解于2～5mL LB液体培养基中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊，并用酶标仪测定其OD600值。用70％～80％的乙醇配制浓度为100μg/mL的五味子甲素，利用试管二倍稀释法将药液、菌液及LB液体培养基加入96孔培养板中过夜培养，不同浓度的药液组别均为三个平行，确保实验数据的可信度。
利用酶标仪测定五味子甲素对多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。并将MIC浓度下的培养液置于无菌的LB液体培养基中继续培养，利用酶标仪测定五味子甲素对多重耐药大肠杆菌的最低杀菌浓度(MBC)，实验结果见表3。
表3.五味子甲素和亚胺培南对人源多重耐药大肠杆菌的抑制结果
由表3可知，五味子甲素对耐氨苄西林、萘啶酸、头孢噻肟、环丙沙星和头孢西丁抗生素的多重耐药大肠杆菌的抑制作用较好，其MIC为25.57μg/mL，MBC为3.13μg/mL。
结合中草药解决耐药病原菌的耐药性特点，考虑秦巴山区中药资源优势，可通过获得活性单品成分五味子甲素，直接与临床主要的多重耐药大肠杆菌的抑制相结合，可有效缓解或解决多重耐药大肠杆菌的耐药感染问题，降低病死率。
总之，根据以上实验结果，本发明为抑制人源多重耐药大肠杆菌提出新的思路，具有重要的实践意义。