可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料及其制备方法和应用与流程
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料及其制备方法和应用。
背景技术：
水凝胶是目前广泛应用并极具前景的生物医用材料。水凝胶是一种具有亲水性的三维网络结构的聚合物，类似于人体细胞外基质(ecm)，具有良好的生物相容性；在水中它能够吸收大量的水而发生溶胀并保持其形态而不被溶解，因而它具有良好的粘弹性，以减少对周围组织细胞的损伤；同时，孔状结构使其具有很好的渗透性，有利于生物体内营养物质以及代谢废物的运输，可满足正常的生命活动的需要。
水凝胶的独特性能引起了人们的广泛关注，在生物医用领域，对水凝胶的研究向着实用便捷、功能化的方向发展，近年来，为了减轻手术创伤和人们的治疗痛苦，可注射型水凝胶成为水凝胶领域新一轮的研究热点。可注射性水凝胶是指流体形态的水凝胶原料通过注射器同时注入皮下或肌肉组织之后，在原位形成半固体的凝胶。“液态注射，原位成固”突破了传统水凝胶物态的限制，使其对伤口有更好的适应性和贴合性，同时简便的注射手段减少了外科手术的创伤，加速了伤口的愈合，提高疾病的治愈效率与质量，可用于伤口敷料、组织粘合、药物控释以及组织支架等多个方面。因而，可注射水凝胶成为当今生物医用材料研究的重点。
目前医用可注射型水凝胶仍存在许多问题亟待解决，如凝胶成胶时间不可控、凝胶的机械性能差、凝胶本体生物相容性差、粘胶与组织的粘合力差、凝胶材料本身易滋生细菌等，因而开发出医生使用便捷、成胶时间可控、机械性能良好、生物相容性优异、组织粘合能力强、抑制细菌生长的医用可注射水凝胶材料在临床医用领域具有重大的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种医生使用便捷、成胶时间可控、机械性能良好、生物相容性优异、组织粘合能力强、抑制细菌生长的医用可注射的水凝胶材料。
本发明第一方面提供了一种可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料，所述水凝胶包括：
(1)四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-蛋白质；
(2)任选的四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2；以及
(3)成胶缓冲液；
其中，
所述四臂化聚乙二醇1-(c＝o)来源于末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇；
所述n-四臂化聚乙二醇2来源于末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇；
且所述四臂化聚乙二醇1和四臂化聚乙二醇2可以相同，也可以不同。
在另一优选例中，所述n-蛋白质来源于表面暴露有氨基基团的蛋白质。
在另一优选例中，当含有四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2时，四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-蛋白质和四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2的比例≥3：2。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇具有以下一个或多个特征：
(a)重均分子量为5000～40000；
(b)纯度大于99％；
(c)单种聚乙二醇聚合物(peg)的分散系数(pdi)为1～1.1。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的重均分子量为10000～20000，更佳为10000。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的分散系数为1.05。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(sc)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(scm)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(ss)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(sg)等；较佳地，为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯。
在另一优选例中，所述末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇具有以下一个或多个特征：
(a)重均分子量为5000～40000；
(b)纯度大于99％；
(c)单种聚乙二醇聚合物(peg)的分散系数(pdi)为1～1.1。
在另一优选例中，所述末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的重均分子量为10000～20000，更佳为10000。
在另一优选例中，所述末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的分散系数为1.05。
在另一优选例中，所述蛋白质选自下组：溶菌酶蛋白、血清白蛋白、卵清白蛋白、血红蛋白或其组合。
在另一优选例中，所述溶菌酶来源于鸡蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白质中，每个蛋白分子表面暴露的氨基数量≥2。
在另一优选例中，所述蛋白质在37℃水中的溶解度需大于50mg/ml。
在另一优选例中，所述蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料为溶菌酶蛋白/聚乙二醇基水凝胶。
在另一优选例中，所述成胶缓冲液为磷酸盐缓冲液或者溶有不同药物的磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2m；更佳地为0.1m。
在另一优选例中，所述成胶缓冲液的ph为7.2。
在另一优选例中，所述的药物为水溶性药物，如抗菌药物、细胞生长因子、抗癌药物等。
在另一优选例中，利用傅里叶全反射红外分析光谱表征所述的水凝胶的分子结构，发现成胶后原端基修饰4armpeg-nhs上酯基上1735cm-1c＝o的特征吸收峰消失，谱图在1525cm-1出现酰胺键弯曲振动峰，表明水凝胶前体酯基已经基本完全参与酰胺化交联反应而制备得到该蛋白/聚乙二醇基水凝胶。
在另一优选例中，所述水凝胶具有良好的力学性能，其压缩模量为0.3～0.5mpa；其断裂强度为90～220kpa；在动态频率为0～10hz条件下，动态储能模量为g’为700～1500pa，动态损耗模量为100～300pa。
在另一优选例中，所述水凝胶具有良好的细胞黏附能力，以及优异的生物相容性。相对于孔板上的细胞数，其细胞活力约为100％。
在另一优选例中，所述水凝胶具有良好的组织黏附性能，其在猪的血管爆破压力为110mmhg～280mmhg。
在另一优选例中，所述水凝胶由本发明如下所述的制备方法制得。
本发明第二方面提供过了一种制备本发明第一方面所述的水凝胶材料的方法，包括步骤：
(a)配制成胶缓冲液；
(b)用成胶缓冲液溶解表面暴露有氨基基团的蛋白质，作为成胶a液；其中所述蛋白质中掺杂或未掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇；
(c)用成胶缓冲液溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇，作为成胶b液；和
(d)将成胶a液和成胶b液混合进行成胶，从而形成所述的水凝胶材料。
在另一优选例中，步骤(b)和(c)的顺序是可以互换的。
在另一优选例中，所述步骤(b)和(c)之后还包括步骤：将成胶a液和成胶b液用无菌过滤器过滤。
在另一优选例中，所使用的无菌过滤器的滤网孔径为0.22um。
在另一优选例中，成胶所需的温度为25℃±15℃；较佳地，为37℃。
在另一优选例中，成胶在37℃下进行。
在另一优选例中，成胶a液和成胶b液的质量浓度相同，且两者混合体积比为1：1。
在另一优选例中，步骤(d)中，将质量浓度相同的成胶a液和成胶b液按体积比为1：1装填到无菌双筒注射器中，进行注射、成胶，从而形成所述的水凝胶材料。
在另一优选例中，步骤(d)中，将质量浓度相同的成胶a液和成胶b液按体积比为1：1预先混合后，再装填到无菌注射器(单筒)中，进行注射、成胶，从而形成所述的水凝胶材料。
在另一优选例中，成胶所需的时间为26s～230s。
在另一优选例中，步骤(d)中，双筒注射器为两只同型号注射器装入注射支架，两只注射器针口接入混合器；如图1所示。
在另一优选例中，步骤(d)中，双筒注射器中所装填的溶液需一次注射完毕，不可反复注射。
在另一优选例中，步骤(d)中，成胶a液与成胶b液预混时间根据a、b液成份和含量不同有所区别，通常不超过20s。
在另一优选例中，所述成胶缓冲液为磷酸盐缓冲液或者溶有不同药物的磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述磷酸盐选自下组：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、或其组合。
在另一优选例中，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2m；优选为0.1m。
在另一优选例中，所述的磷酸盐缓冲液的ph值为7.2。
在另一优选例中，步骤(a)中，配置0.1m、ph为7.2的磷酸盐缓冲液，其配置方法：称取nah2po4.2h2o1.4825g和na2hpo4.12h2o14.50g于500ml蓝口瓶中，用量筒取500ml溶液使其溶解；测定ph值，密封后高温高压灭菌。
在另一优选例中，步骤(a)中，称取一种或多种药物放入磷酸盐缓冲液中。
在另一优选例中，所述的药物如抗菌药物、细胞生长因子、抗癌药物等。
在另一优选例中，步骤(a)中，称取292mg乙二胺四乙酸(edta)加入到磷酸盐缓冲液中，配置成含1mmedta的磷酸盐缓冲液，作为成胶缓冲液。
在另一优选例中，所述方法包含以下一个或者多个特征：
(1)所述的成胶a液中，溶质的质量浓度为50mg/ml～200mg/ml；
(2)所述的成胶a液中，所述表面暴露有氨基基团的蛋白质选自下组：溶菌酶蛋白、血清白蛋白、卵清白蛋白、血红蛋白或其组合；
(3)所述的成胶b液中，末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的浓度为50mg/ml～200mg/ml。
在另一优选例中，所述的成胶a液中，溶质的质量浓度为150mg/ml。
在另一优选例中，所述的成胶a液中，当所述蛋白质中掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇时，所述的溶质为所述蛋白质和末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的总和。
在另一优选例中，所述的成胶a液中，当所述蛋白质中未掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇时，所述的溶质为所述蛋白质。
在另一优选例中，所述的成胶b液中，末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的浓度为150mg/ml。
在另一优选例中，所述面暴露有氨基基团的蛋白质为单一组分或多种组分的混合。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(sc)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(scm)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(ss)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(sg)等；较佳地，为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯。
在另一优选例中，所述的成胶b液中，末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇为末端修饰有碳酸酯的四臂化聚乙二醇(4-armpeg-sc)，其浓度为150mg/ml，其重均分子量为10000，分散系数为1.05。
在另一优选例中，步骤(b)中，称取掺杂或未掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的表面暴露氨基基团的蛋白质粉末，含量为100mg、150mg或200mg，分别用1ml步骤(a)中的成胶缓冲液溶解，形成成胶a液。
在另一优选例中，步骤(b)中，称取150mg未掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的溶菌酶冻干粉末(n-乙酰胞壁质水解酶、lzm)，酶活力105u/mg，用1ml步骤(a)中的成胶缓冲液溶解，形成成胶a液。
在另一优选例中，步骤(c)中，称取末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇，含量为100mg、150mg或200mg，分别用1ml步骤(a)中的成胶缓冲液溶解，形成成胶b液。
在另一优选例中，步骤(c)中，称取4armpeg-sc150mg，其重均分子量为10000，分散系数1.05，用1ml步骤(a)中的成胶缓冲液溶解，形成成胶b液。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶材料的应用，用于制备医用材料。
在另一优选例中，所述医用材料用于组织修复、组织再生、组织屏蔽、组织封堵和/或组织粘合等。
在另一优选例中，所述医用材料为如下的一个或多个：
(1)作为皮肤敷料(可应用于创伤的皮肤，可在同时抑制细菌感染的同时促进创口的修复愈合)；
(2)作为组织粘合剂(可替代外科手术的缝合及活组织的接合)；
(3)作为止血材料(可应用于人体脉管系统，作为开放性伤口的急性封堵及促进组合的局部修复)；
(4)作为组织封堵(可应用于人体内脏器官(肠/胃/心脏/肺等)的局部开放性创伤，用于开放性伤口的封堵及促进局部组合的修复)；
(5)作为组织工程支架(可促进软骨修复)。
本发明还提供了一种成胶缓冲液，其为添加或未添加药物的磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述药物可以是单一成份，也可以是不同药物的混合组成。
本发明还提供了一种成胶a液，其为用上述成胶缓冲液溶解表面暴露有氨基基团的蛋白质的溶液，其中，所述蛋白质掺杂或未掺杂末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇的蛋白溶液。
本发明还提供了一种成胶b液，其为用上述成胶缓冲液溶解末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的溶液。
在另一优选例中，成胶a液中末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇与lzm的质量比由0:5不断提升到4：1，再与相同浓度的成胶b液混合进行成胶时，其成胶时间逐渐缩短。
在另一优选例中，成胶a液中末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇与lzm的质量比由0:5不断提升到4：1，再与相同浓度的成胶b液混合进行成胶时，其成胶后水凝胶中孔径不断变大。
在另一优选例中，成胶a液中末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇与lzm的质量比由0:5不断提升到4：1，再与相同浓度的成胶b液混合进行成胶时，细胞对水凝胶的黏附性能不断下降。
在另一优选例中，成胶a液中末端修饰氨基基团的四臂化聚乙二醇与lzm的质量比由0:5不断提升到4：1，再与相同浓度的成胶b液混合进行成胶时，水凝胶的压缩断裂强度、动态力学性能等逐步提升。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了双筒注射实物图。
图2显示了不同蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶良好的可注射成形性，以及优异的力学性能。
图3显示了不同浓度下蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶成胶时间。
图4显示了蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶与其前体peg-nhs的红外(ftir)谱图。
图5显示了蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶断面形貌sem图像。
图6显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶的力学性能。
图7显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶的溶胀率。
图8显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶的抗菌性能。
图9显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶生物相容性。
图10显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶对生物组织的粘合性。
图11显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶用作止血材料评价。
图12显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶用作气管漏气封堵组织粘合剂材料评价。
图13显示了溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射水凝胶用作左心室医致创伤封堵材料评价。
图14显示了细胞对参杂了4armpeg-nh2的蛋白/聚乙二醇基可注射型水凝胶的黏附情况。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次研发出以新型天然无毒功能蛋白与生物安全性高的4armpeg-nhs为主要原料，配合特殊的成胶缓冲液，通过酰胺化反应，制备了具有多功能性的可注射型水凝胶。本发明的可注射水凝胶中，利用4armpeg-nhs能与带氨基的物质反应特性，使其拥有良好的组织粘合性能，利用原料中的功能蛋白成分加入，使得细胞在水凝胶上拥有了黏附位点，促进细胞在水凝胶表面/内部的生长，同时利于不同功能蛋白加入、成胶溶液中不同成份药物的加入，可实现该水凝胶功能上的多样性。在此基础上，完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
聚乙二醇(peg)
peg由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合得到的一类水溶性聚醚,是一种ph呈中性、无毒性的聚合物，呈现线性或者支化的链状结构，其链上的醚键-o-可与水形成较强的氢键使其具有良好的亲水性，分子链上的乙烯基使其有一定的疏水性，也可溶于多种有机溶剂；peg具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织液之中，不会激发人体免疫系统发生排斥作用且可以被基体迅速排出体外而不产生任何的毒副作用。
四臂化聚乙二醇
经过进一步化学改性的peg，可修饰上各种活性基团进而引发各种交联，组装等性能，从而进行组装水凝胶等多种应用。四臂化聚乙二醇为从一个枝化点呈放射形连接出四条等分子量的线型链聚乙二醇链的高分子聚合物。
本发明的四臂化聚乙二醇可用如下结构表示：
末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nhs)
本发明的四臂化聚乙二醇还可以在四条链的末端修饰有琥珀酰亚胺活性酯，例如，修饰有羧酸琥珀酰亚胺基(如下所示：-(ch)m-coo琥珀酰亚胺，其中，m为0-10的整数)、二羧酸单琥珀酰亚胺基(如下所示：(-(c＝o)-(ch)m-coo琥珀酰亚胺，其中，m为0-10的整数)等，形成末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nhs)。
使得其具有与其它带氨基基团物质反应的活性。
所述4armpeg-nhs具有以下一个或多个特征：
(a)重均分子量为5000～40000，较佳地，为10000～20000，更佳为10000；
(b)纯度大于99％；
(c)单种聚乙二醇聚合物(peg)的分散系数(pdi)为1～1.1；较佳地为1.05。
例如，根据琥珀酰亚胺活性酯的类型不同可分为：
四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(4armpeg-sc)，其化学结构式为:
四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(4armpeg-scm)，其化学结构式为：
四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(4armpeg-ss)，其化学结构式为:
四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥戊二酸酯(4armpeg-sg)，其化学结构式为:
末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nh2)
本发明的四臂化聚乙二醇还可以在四条链的末端修饰有氨基(例如，-(ch2)m-nh2，其中，m为0-10的整数)，形成末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nh2)。
所述4armpeg-nh2具有以下一个或多个特征：
(a)重均分子量为5000～40000，较佳地，为10000～20000，更佳为10000；
(b)纯度大于99％；
(c)单种聚乙二醇聚合物(peg)的分散系数(pdi)为1～1.1；较佳地，为1.05。
例如，其化学结构式具体可以为：
末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇可在制备水凝胶的时候用于代替部分蛋白质，可调节水凝胶的力学性能，如弹性模量；聚合物三维网状结构的孔径大小等。
功能蛋白
功能蛋白是指携带能够完成人体的生理功能的蛋白质，它们主要是完成人体的各种代谢活动。功能蛋白有催化蛋白，运输蛋白，免疫蛋白，调节蛋白等。
本发明的功能蛋白是表面暴露有氨基基团的蛋白质，可选自下组：溶菌酶蛋白(可以是各种来源(例如鸟类、家禽)的溶菌酶蛋白，如鸡溶菌酶蛋白)、血清白蛋白、卵清白蛋白、血红蛋白或其组合。
所述蛋白质中，每个蛋白分子表面暴露的氨基数量≥2。
所述蛋白质在37℃水中的溶解度需大于50mg/ml。
四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-蛋白质
本发明的“四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-蛋白质”是由末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nhs)和表面暴露有氨基基团的蛋白质通过氨酯交换反应得到的产物。
四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2
本发明的“四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2”是由末端修饰琥珀酰亚胺活性酯的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nhs)和末端修饰氨基的四臂化聚乙二醇(4armpeg-nh2)通过氨酯交换反应得到的产物。
水凝胶
水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有三维交联网络的聚合物，在聚合物网络结构中含有亲水基团和亲水的链段，它们在水环境中能够与水结合，从而形成水凝胶结构，这种凝胶结构使得亲水性的小分子能够在其中进行自由扩散。
原位可注射水凝胶
原位可注射水凝胶是指流体形态的水凝胶原料通过注射器同时注入皮下或肌肉组织之后，在原位形成半固体的凝胶，因此很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位。“液态注射，原位成固”突破了传统水凝胶物态的限制，使其对伤口有更好的适应性和贴合性，同时简便的注射手段大大的减少了外科手术的创伤，加速了伤口的愈合，提高疾病的治愈效率与质量，可用于伤口敷料、组织粘合、药物控释以及组织支架等多个方面。
本发明的可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶是包含四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-蛋白质和任选的四臂化聚乙二醇1-(c＝o)-n-四臂化聚乙二醇2。其中，所述的四臂化聚乙二醇1和四臂化聚乙二醇2都选自本发明的四臂化聚乙二醇；两者可以相同或不同。
本发明的可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶还含有成胶缓冲液。
当然，本发明的可注射蛋白/聚乙二醇基水凝胶还含有氨酯交换反应产生的小分子化合物琥珀酰亚胺。
组织粘合/封堵
组织胶(或称为组织粘合剂)具有一定的粘合性能且能与人体组织接触，组织胶在人体组织表面成胶过程中也可能与人体组织反应而增加粘合，由此实现止血、代替缝线粘合伤口、封闭组织、封堵损伤创口、防止术后组织粘连等。
组织工程
从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞(又称种子细胞)从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(水凝胶)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明利用以天然无毒功能蛋白质与生物安全性高的4armpeg-nhs两种为主要原料，配合特殊的成胶溶液，通过酰胺化反应，制备了具有多功能性的可注射型水凝胶。
(2)本发明可利用在成胶a液中加入不同种类的蛋白，以及功能蛋白自身的生物功能多样性，不仅可实现蛋白作为水凝胶骨架材料的一部分增加水凝胶力学性能，同时可使得该可注射水凝胶应用不同的生物医用方面，赋予水凝胶实现不同生物特性功能。
(3)本发明可利用加入成胶a液中加入不同配比的4armpeg-nh2，可实现水凝胶力学性能、材料孔径、孔隙率、细胞黏附特性等性能的调节与转变。
(4)本发明利用成胶溶液的加入药物成份不同，可实现药物在水凝胶注射部位的原位释放，同时可与水凝胶中功能蛋白发挥协同作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：蛋白/聚乙二醇基可注射型水凝胶的制备
(1)称取4armpeg-sc粉末150mg,牛血清白蛋白(bsa)、溶菌酶(lzm)、血红蛋白(hgb)各150mg，分别用1ml0.1mpb缓冲溶液溶解，peg与溶菌酶的质量比为1:1。双筒注射器的两筒内分别吸入peg与蛋白溶液，使其同时注射到模具中，静置一段时间即得到水凝胶，初步按压观察其力学性能。
(2)称取4armpeg-sc粉末与lzm各100mg、150mg、200mg，分别用1mlpb缓冲溶液溶解，peg与溶菌酶的质量比为1:1。双筒注射器的两筒内分别吸入peg与lzm溶液，使其同时注射到模具中，静置一段时间即得到可注射型溶菌酶/聚乙二醇(lzm-peg)水凝胶，初步按压观察其力学性能。
如图2-a所示：选择不同的蛋白溶液作为成胶a液，与4armpeg-sc溶液即成胶b液，利用注射的方式让两者相互混合。可看出：(1)水凝胶固化后呈现与模具相同的形状，注射成胶具有良好的可注射成型性，可形成不同复杂结构。(2)按压会使水凝胶发生弯曲变形，撤销压力后又可恢复到原状而不被破坏，据此反应机理制备的水凝胶具有一定的力学性能，弹性较好。
如图2-b所示：由上述实验现象可以初步看出不同浓度的lzm蛋白溶液与4armpeg-sc溶液相互混合注射，可看出不同浓度下的成胶液，都能较好的形成水凝胶，并能持有一定的力学性能。说明该水凝胶中的成胶液的浓度可以在适当范围类调节，从而达到调控水凝胶本体性能的目的。
实施例2：溶菌酶蛋白/聚乙二醇基可注射型水凝胶成胶时间测定
将0.1mph＝7.2pb缓冲溶液放于37℃恒温水浴锅内加热并保持37℃，以此溶解不同质量的4armpeg-sc与lzm蛋白，4armpeg-sc或lzm蛋白的浓度分别为：50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml。4armpeg-sc与lzm蛋白的质量比为1:1，将不同浓度的4armpeg-sc与溶菌酶溶液分别装入双筒注射器的两筒中，进行注射成胶实验。注射结束后，将其放于37℃水浴中，观测成胶液体完全不再流动时所需要的时间，即水凝胶成胶时间。
通过观察“倒置离心管，成胶前驱液流动”的方法，测定了水凝胶的成胶时间，如图3所示：4armpeg-sc和lzm的浓度越高，成胶时间越短，浓度高于100mg/ml，成胶时间差距缩短。这可能因为4armpeg-sc和lzm溶液的浓度越高，单位体积内4armpeg-sc与lzm的分子数越多，其相互碰撞而发生酰胺化反应的几率越高，因此交联形成水凝胶所需时间越短；而浓度高于100mg/ml后，由分子浓度决定的分子碰撞反应几率不再是成胶时间的主要因素。
实施例3：溶菌酶蛋白/聚乙二醇可注射型水凝胶红外光谱(ftir)测定
制备peg和lzm浓度均为150mg/ml的lzm-peg水凝胶并冷冻干燥，冻干后研磨成粉末状。然后利用傅里叶全反射红外测试仪在4000～400cm-1范围内分别扫描将4armpeg-sc药品粉末与蛋白/聚乙二醇凝胶粉末两种样品并记录。
可以得到如图4所示的红外谱图：4armpeg-sc红外谱图中的1735cm-1峰是聚乙二醇末端活性酯中酯基上c＝o的特征吸收峰。通过酰胺化反应交联形成凝胶之后，在peg-lzm水凝胶的红外谱图中，在1525cm-1处出现酰胺键弯曲振动峰，而1735cm-1处的nhs酯基上c＝o的特征吸收峰已经基本消失，由此表明，水凝胶前体4armpeg-sc中末端活性酯中的酯基已经基本完全参与酰胺化交联反应而制备得到lzm-peg水凝胶。
实施例4：溶菌酶蛋白/聚乙二醇可注射型水凝胶形貌表征
(1)制备peg和lzm浓度均为50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml的lzm-peg水凝胶，冷冻干燥。
(2)冻干后的水凝胶用液氮脆断后，在场发射扫描电镜(s-4800)下进行观察并拍摄扫描电镜图像。
如图5所示。从sem图像中可以看到，整体表面较为光滑。孔径分析显示，随着peg、lzm成胶前驱溶液浓度越大，水凝胶的交联度越大，其孔数目增多，孔径越来越小，内部结构更加致密。因而我们可以通过改变成胶前驱溶液的浓度来调节凝胶内部微观结构以及孔的大小及分布，使其满足不同的使用需求。
实施例5：溶菌酶蛋白/聚乙二醇可注射型水凝胶力学性能测试
制备peg与溶菌酶浓度为100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml的圆柱状lzm-peg水凝胶，其尺寸为：底部直径15mm，高7.5mm。
从图6-a、6-b、6-c中可以看出，lzm-peg水凝胶成胶前lzm-peg溶液浓度越高，凝胶的压缩模量越高。这是由于lzm-peg溶液浓度越高，形成凝胶的交联密度越大，进而形成了更致密的凝胶网络结构。从断裂强度结果来看，随着成胶前体溶液的浓度的增加，断裂强度呈现先增后降的趋势，原因是在水凝胶受到压缩应力时，由于交联点过多限制了内部分子链的运动及迁移，从而增大水凝胶材料的脆性，同时当成胶浓度太高时，在溶解或成胶过程中会造成些许气泡而影响力学强度。因此，在lzm-peg成胶前体溶液浓度为150mg/ml时展现了最高的断裂强度，即展现了较好的韧性。
实施例6:溶菌酶蛋白/聚乙二醇可注射型水凝胶溶胀行为评价
制备4armpeg-sc与lzm浓度为100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml的peg-lzm水凝胶，分别称量其初始重量m前，将三个不同浓度的水凝胶分别放入孔板的三个孔中，每个孔添加2mlpbs缓冲液，将孔板放于37℃的恒温震荡器中，48h后取出水凝胶，吸干其表面水分，分别称量其溶胀后重量m后，利用
实验结果如图7所示：peg-lzm水凝胶的溶胀率随peg/lzm溶液的浓度的提高而提高，其原因可能是成胶前驱溶液的浓度越高，相同体积的peg-lzm水凝胶中交联点之间分子链的折叠、盘旋、弯曲的程度更高，因而可以吸收更多的水分于交联网络。
实施例7：溶菌酶蛋白/聚乙二醇可注射型水凝胶抗菌性能研究
1、涂板法测定成胶液中加入edta的lzm-peg水凝胶抗菌性能
(1)用含有1mmedta药物的0.1mpb缓冲液配制150mg/ml的peg、lzm、bsa溶液3ml、1.5ml、1.5ml，在24孔板内，通过注射成胶的方法制备lzm-peg(edta)和bsa-peg(edta)水凝胶(0.5ml)各6块并分成两组e、s。
(2)
e组：添加2*105cfu/ml大肠杆菌(e.coil)菌液，
s组：添加2*105cfu/ml金黄色葡萄球菌(s.aureus)菌液，
每组设置：
对照组：
孔板+250ul菌液+250ul生理盐水
bsa-peg(edta)水凝胶+250ul菌液+250ul生理盐水
实验组：
lzm-peg(edta)水凝胶+250ul菌液+250ul生理盐水
将孔板放入37℃恒温细菌培养箱中培育。
(3)孔板培育6h后，梯度稀释102，然后各取100μl进行涂板，24h之后观察菌落数目。
2、活死菌形貌观测成胶液中加入edta的lzm-peg水凝胶抗菌性能
(1)将上述1-(2)中实验组和对照组培养24h后的各孔内菌液取出，2.5％戊二醛溶液固定2h，乙醇梯度脱水(每次离心管底部保留100ml溶液)，最后用乙酸异戊酯进行置换。
(2)取20μl乙酸异戊脂置换过的菌液滴在硅片上，然后在冻干机中冻干。
(3)利用场发射扫描电镜(s-4800)进行观察和拍摄细菌细胞膜形态。
lzm蛋白对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不理想，加入细胞膜干扰剂，如edta、乳铁蛋白、乳酸等，可以与革兰氏阴性菌细胞壁表面的脂多糖之间盐桥二价阳离子螯合，从而使得细菌的细胞膜失去稳定性，从而降低革兰氏阴性菌对溶菌酶的耐受性。
如图8-a所示：(1)添加edta的bsa-peg水凝胶培养菌液的菌落数少于孔板对照组的菌落数，因而edta本身对于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌都具备较微弱的抗菌能力。(2)从加入edta的lzm-peg水凝胶与edta单独抗菌效果的对比可以看出，edta的存在确实提高了lzm-peg水凝胶的抗菌能力，且与溶菌酶呈现协同抗菌的效果。
如图8-b所示：s.aureus的原始形态为规则的球状，e.coil的原始形态为杆状。edta单独作用时，edta促使细菌细胞膜处于不稳定状态，两者原始形态发生微量变形，但细胞壁尚未被破坏；edta与溶菌酶协同作用时，溶菌酶能催化细胞壁肽聚糖的糖苷键的水解，进而破坏细胞壁，因此细胞壁(膜)发生严重破损，形态发生变化。
实施例8：溶菌酶/聚乙二醇可注射型水凝胶生物相容性评价
1、体外生物相容性
选用小鼠成纤维细胞(c2c12)和永生化人表皮角质细胞(hacat)作为细胞模型评价lzm-peg(edta)水凝胶的生物相容性。
(1)在两块lzm-peg(edta)水凝胶上分别种入60000个c2c12细胞、hacat细胞，并在孔板空白两孔中也分别种入60000个c2c12、hacat细胞作为对照组，然后将孔板放于37℃恒温细胞培养箱中培育1天。
(2)1天后，将孔板从37℃恒温细胞培养箱取出，然后利于倒置显微镜观察并拍摄孔板四孔中细胞分布、铺展存活情况。
(3)将四组细胞培养小皿从37℃恒温细胞培养箱中取出，首先用2.5％的戊二醛溶液固定细胞形态，再利用鬼笔环肽(fitc)溶液对细胞骨架染色，再利用dapi溶液对细胞核染色。激光共聚焦显微镜观察。
从图9-a可以看出，对比在对照组孔板底部的细胞，细胞在水凝胶表面有较好的铺展细胞形态正常，与对照组并无明显差异，说明该水凝胶具有较好的生物相容性且为细胞的铺展、增殖、迁移提供了良好的生长环境。
从图9-b中可以看出：相对于养在细胞培养皿底部的细胞空白对照组，水凝胶表面细胞铺展完整，出现了丝状伪足且与水凝胶黏附，甚至细胞间通过伪足相互连接进行细胞间交流，并形成了细胞群落。因此我们可以推测，peg-lzm水凝胶具有良好的细胞相容性，可以为细胞提供良好的粘附与增殖条件。
2、体内生物相容性
(1)用1ml添加1mmedta的0.1mpb缓冲液各配制150mg/ml的4armpeg-sc和lzm溶液各2ml，然后分别用0.22mm的滤膜无菌过滤。
(2)利用双筒注射器将4armpeg-sc溶液与lzm溶液混合注射于两处sd大鼠背部皮下组织，每处注射混合溶液0.4ml。
(3)培养sd大鼠两周而后将其处死，将背部表皮切开以观察内部成胶情况以及周围组织的炎症反应等。
从图9-c可以看出，该水凝胶在sd大鼠皮下具有较好的成型性，并且其表面出现明显的纤维包膜；水凝胶材料周围组织已经出现了血管，水凝胶的形成对内外部组织以及表皮结构未出现明显的红肿、破溃等其他炎症反应。
从图9-d，h&e切片可以看出，水凝胶与组织贴合紧密，与该水凝胶接触的局部组织，未出现明显的炎症反应，并伴有新生血管的生成，且tunel切片显示细胞并未发生凋亡或坏死的情况。
由此可以推断peg-lzm水凝胶具有良好的生物相容性。
实施例9：溶菌酶/聚乙二醇可注射型水凝胶粘合性能研究
1、lzm-peg水凝胶对猪表皮粘合性测试
(1)将成胶溶液(pb缓冲液)加入适当的亚甲基蓝，使得成胶溶液呈蓝色。
(2)用加入亚甲基蓝的0.1mph＝7.2pb缓冲液配制4-arm-peg-sc(150mg/ml)和lzm(150mg/ml)溶液，并分别装入双筒注射器的两筒中，然后同时注射到清洗干净的猪皮表面，成胶后进行折、拧、拗等实验操作以观察其力学性能以及与组织的粘合程度。
图10-a显示了注射到新鲜猪皮后形成的lzm-peg水凝胶可以紧密地粘合到猪皮表面并可随猪皮发生各种形变而不断裂，因而lzm-peg水凝胶具有良好的粘合性、机械强度、弹性与韧性。在去除猪皮表面的水凝胶后，如10-a-e所示，猪皮表面仍残留水凝胶的蓝色印迹，由此可以猜测，成胶前体溶液在注射到猪皮之后，peg上修饰的n-羟基琥珀酰亚胺可以与猪皮的组织蛋白发生酰胺化反应，从而使得水凝胶与猪皮组织粘合，并具有较好的粘结强度。
2、lzm-peg水凝胶对猪动脉血管粘合性测试
(1)用0.1mph＝7.2pb缓冲液配制不同浓度(100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml)的4-arm-peg-sc和lzm溶液，相同浓度的成胶a、b液按照体积比1：1并分别装入双筒注射器的两筒中，然后同时注射到人工创口直径为2mm的猪动脉血管处，静置5min，等胶反应完全。
(2)将血管的一端封堵住，另一端利用注射泵通入生理盐水，并不断加大水流压力，直至血管创口处爆破，记录最大水流爆破压力。
图10-b为测水凝胶血管爆破压力模拟装置实物图。显示该水凝胶可适用于不同形状的创口，初始流动性使其具有较高的吻合度度。在测试过程中，未爆破前并未发现有流体从封堵材料处流出，说明该材料同时具有良好的致密性，可封堵人体中常见的流质。
图10-c显示了lzm-peg水凝胶最大可抵抗血管内流体压力随着胶的浓度不断提升，这是因为随着胶的浓度增加，水凝胶内有更多的基团可参与与血管表面分子基团反应，形成较强的化学、物理键等相互作用，使其粘合强度不断提高。同时不同浓度下lzm-peg水凝胶最大可抵抗血管内流体压力多接近或者高于人体内正常的动脉血管压力，且高于所测得市面出售的纤维蛋白类粘合胶(fibringlue)(广州倍绣生物科技有限公司)的最大爆破压力。
以上实验说明该蛋白/聚乙二醇基水凝胶具有较好的组织粘合能力、封堵能力。
实施例10：溶菌酶/聚乙二醇可注射型水凝胶体内动脉血管开放性伤口的急性封堵研究
选用新西兰大白兔的颈部动脉和股动脉作为止血动物模型。
(1)用1ml的0.1mpb缓冲液各配制150mg/ml的4armpeg-sc和lzm溶液各2ml，然后分别用0.22mm的滤膜无菌过滤备用。
(2)分别在兔子的右部颈动脉和右部股动脉，用无菌注射针头进行医源性开放性创伤建立。
(3)利用止血钳将出血处两端夹紧，
利用双筒注射器将4armpeg-sc溶液与lzm溶液混合注射于血管创口(实验组)；
对照组(control)为兔子左侧未进行任何处理的左部颈动脉和左部股动脉
(4)静置大约3min，让水凝胶反应完全，并且与血管结合牢固。
(5)松开止血钳，观察止血效果，并缝合外部伤口，注射抗生素防止伤口细菌感染。
(6)1天后利用多普勒超声呈像，观测血管创口处的血流情况。
(7)1周后将创口处血管取出，h&e切片分析。
从图11-a可以看出，实验兔动脉创口处在lzm-peg水凝胶封堵后，松开止血钳，血管创口处未有血液流出，并且血管内部充盈，说明该水凝胶具有快速止血效果，并可恢复血管中血液的正常流动。
从图11-b可以看出，该水凝胶与血管创口接触1天后，利用多普勒成像发现右部动脉血管伤口处血液流速、流量等参数与自身左部接近，血流正常，说明该水凝胶在1天内未使血管伤口处形成急性血栓。
从图11-c从可以看出，该水凝胶与血管创口接触1周后，利用对伤口处h&e切片分析，发现血管伤口处已经愈合并有大量新生细胞长入，这是由于血管内部营养较为丰富，组织恢复速度较快，在创口新生组织外仍有残留水凝胶材料，材料与组织界面未发现明显炎症反应，说明在这段时期内水凝胶一直封堵住伤口，同时起到了良好的伤口促进愈合的效果，在血管内部未有血栓产生。
实施例11：溶菌酶/聚乙二醇可注射型水凝胶体内气管开放性伤口的急性封堵研究
选用新西兰大白兔的颈部气管做为动物组织封堵模型。
(1)用1ml的0.1mpb缓冲液各配制150mg/ml的4armpeg-sc和lzm溶液各2ml，然后分别用0.22mm的滤膜无菌过滤备用。
(2)分别在兔子的气管，用无菌注射针头进行开放性创伤建立。
(3)利用双筒注射器将4armpeg-sc溶液与lzm溶液混合注射于气管创口(实验组)。
(4)静置大约3min，让水凝胶反应完全，观察封堵伤口漏气处效果，并缝合外部伤口，注射抗生素防止伤口细菌感染。
(5)对照组(control)在暴露气管相同方法建立伤口后，不做处理，缝合外部伤口。
(6)1天后颈部进行计算机体层摄影(ct)扫描，观测实验兔颈部积气情况。
从图12-a可以看出，实验兔气管创口处在lzm-peg水凝胶封堵后，材料与气管创口结合紧密，并未发现有气泡鼓出，同时兔子呼吸逐步恢复正常，无哮喘等现象发生。
从图12-b可以看出，计算机体层摄影(ct)扫描显示进行lzm-peg水凝胶封堵后，颈部无明显积气，而对照组由于气管开放性伤口未做任何处理，固有明显积气。
由此证明该水凝胶在体内具有良好的气管开放性创伤封堵效果。
实施例12：溶菌酶/聚乙二醇可注射型水凝胶体内左心室开放性伤口的急性封堵研究
选用新西兰大白兔的心脏做为动物器官封堵模型。
(1)用1ml的0.1mpb缓冲液各配制150mg/ml的4armpeg-sc和lzm溶液各2ml，然后分别用0.22mm的滤膜无菌过滤备用。
(2)打开实验兔左部胸腔，在兔子的左心室，用荷包缝法在左心室壁上进行缝线。
(3)用无菌注射针头在缝线圈中间部位进行创伤建立。
(4)拉紧荷包锋线，防止血液喷出，利用双筒注射器将4armpeg-sc溶液与lzm溶液混合注射于创口处。
(5)静置大约3min，让水凝胶反应完全，撤去心脏上的缝线，观察伤口封堵情况，并减压关闭胸腔，缝合外部伤口，注射抗生素防止伤口细菌感染。
(6)2周后进行心脏彩超扫描，观测实验兔的心脏功能恢复情况。
从图13-a可以看出实验兔左心室开放性创口处用lzm-peg水凝胶封堵后，材料在跳动的心脏表面粘合紧密，未发生材料脱落、破裂等情况，也无再次出血情况发生。
从图13-b心脏彩超可以看出，2周后实验兔心脏左心室收缩功能正常，射血分数等参数与对照组(正常实验兔)接近。
所有的实验兔(n＝4)在手术后未发现感染、心功能衰竭等不良情况发生。由此证明该水凝胶在体内具有良好的动态环境(心脏)下创口粘合及血液封堵效果，同时具有优异的力学性能满足心脏中复杂的动态环境使用要求，同时具有优良生物相容性。
实施例13掺杂4armpeg-nh2的蛋白/聚乙二醇基可注射型水凝胶的制备
(1)称取4armpeg-sc粉末150mg，4armpeg-nh2粉末150mg，lzm粉末150mg，分别用1ml0.1mpb缓冲溶液溶解，使用0.22um无菌过滤器无菌过滤备用。
(2)制作掺杂不同浓度4armpeg-nh2的水凝胶材料，其中，保证水凝胶中4armpeg-sc的质量与溶菌酶和4armpeg-nh2的总质量比为1:1，分为6组，分别取：
1号：150ul4armpeg-sc溶液+150ullzm溶液；
2号：150ul4armpeg-sc溶液+120ullzm溶液+30ul4armpeg-nh2溶液；
3号：150ul4armpeg-sc溶液+90ullzm溶液+60ul4armpeg-nh2溶液；
4号：150ul4armpeg-sc溶液+60ullzm溶液+90ul4armpeg-nh2溶液；
5号：150ul4armpeg-sc溶液+30ullzm溶液+120ul4armpeg-nh2溶液；
6号：150ul4armpeg-sc溶液+150ul4armpeg-nh2溶液；
加入到24孔板中，使其充分混合后静置，使其覆盖孔板底面并形成凝胶。
把从sd大鼠提取的原代软骨细胞，按照每孔6w细胞，种植到不同的材料上，以及孔板空白孔中(control)。
1天后使用倒置显微镜观察1～6号不同材料以及孔板底部上细胞的黏附状态。结果如图14所示。
由图14可见，从材料1号到6号，细胞粘附量减少，其中5号和6号几乎没有细胞能够粘附。右侧con组为培养板培养组。可见细胞在1号和2号材料上的粘附效果优于培养板。
结果说明：未掺杂或掺杂有少量4armpeg-nh2的水凝胶材料对细胞的粘附效果更好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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