一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法及应用与流程

本发明涉及组织工程领域，更具体涉及一种提高明胶材料水溶性的处理方法及其应用。

背景技术：

明胶在组织工程领域已经得到了广泛的应用，在所有的支架材料中，静电纺明胶膜由于良好的生物活性、类细胞外基质、可生物降解占据了重要的地位。然而，由于静电纺丝明胶膜的水溶性很差大大限制了其作为支架材料的实用性。因此，如何提高静电纺明胶膜的水溶性已经成为了广大工作者研究的热点问题。

现有的大部分提高明胶膜水溶性的方法降低了其生物活性，不利于作为支架材料使用。寻求一种简便、有效，既能提高明胶膜的水溶性同时保留其生物活性的处理方法具有重要应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法及应用，利用该方法处理的明胶膜能有效提高其水溶性且具备良好的生物活性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法，包括以下步骤：

1)将25-30％w/v的明胶溶液置于针筒内，通过静电纺丝法收集静电纺丝明胶膜；

2)将所述静电纺丝明胶膜与0.8-1.2g/L的二氧化氯溶液一同置于密封容器中10-14h，通过挥发性二氧化氯蒸汽处理明胶膜，处理后的明胶膜置于干燥箱中干燥8-12h,然后通风处理18-24h使明胶膜表面二氧化氯完全挥发，接着用去离子水清洗2-3遍，干燥。

所述明胶溶液的制备方法如下：将明胶溶于NaCl溶液中，于50-60℃下磁力搅拌18-24h，得到均相明胶溶液。

所述明胶为动物骨明胶或动物皮明胶。

所述明胶的分子量为20-180KD。

所述静电纺丝过程，静电纺丝电压为14-18KV，针头距接收器距离为13-17cm，推进泵的推进流率为0.28-0.32ml/h。

所收集的静电纺丝明胶膜厚度为0.45-0.55mm，纺丝直径为150-200纳米。

所述二氧化氯溶液的制备方法如下：将K2S2O2加入去离子水溶液中，搅拌至完全溶解后，再加入NaClO2并搅拌均匀得到二氧化氯溶液，然后置于4℃的环境中密封备用。进一步，所述K2S2O2和NaClO2的质量比为1:1。

本发明采用以上技术方案，首先将明胶溶于氯化钠溶液中，氯化钠能提高溶液导电性，利于后续制备直径均一的纳米明胶膜，然后通过静电纺丝法制备类细胞外基质的明胶膜，在高压作用下将明胶聚合物溶液拉伸成纳米结构的膜，然后通过二氧化氯处理静电纺丝明胶膜，二氧化氯溶液具有挥发性能，避免静电纺丝明胶膜直接接触二氧化氯水溶液而瞬间溶解，能够有效提高其水溶性并且无氯元素残留。

本发明的显著优点是：(1)静电纺丝明胶膜具有类细胞外基质的纳米结构，通过二氧化氯蒸汽处理静电纺丝明胶膜，方法简单，可操作性强，能有效提高其水溶性。(2)处理后的明胶膜无氯元素残留，具有很好的生物活性，在体内能有效降解并能提高细胞粘附、增殖，可作为皮肤、眼角膜等支架材料应用于组织修复。

附图说明

图1为SEM形貌分析：A、B未经处理的静电纺丝明胶膜，C、D二氧化氯蒸汽处理12h的静电纺丝明胶膜；

图2为FTIR红外分析：A未经处理的静电纺明胶膜，B二氧化氯蒸汽处理12h的静电纺明胶膜；

图3为机械性能分析：A二氧化氯蒸汽处理12h的静电纺丝明胶膜，B未经处理的静电纺丝明胶膜；

图4为溶胀性能分析：gels为未经处理的静电纺丝明胶膜，crosslinkinggels为二氧化氯处理后的静电纺丝明胶膜；

图5为MTT分析膜生物毒性：A未经处理的静电纺丝明胶膜，B二氧化氯蒸汽处理12h的静电纺明胶膜；

图6为二氧化氯处理后膜上细胞粘附增殖SEM图：A1(＝50μm),A2(＝10μm),A3(＝5μm)为一天；B1(＝50μm),B2(＝10μm),B3(＝5μm)为三天；C1(＝50μm),C2(＝10μm),C3(＝5μm)为5天；D1(＝50μm),D2(＝10μm),D3(＝5μm)为10天。

具体实施方式

以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但发明不仅限于此。

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法，包括以下步骤：

1)将明胶溶于NaCl溶液中，于50-60℃下磁力搅拌18-24h，得到25-30％w/v的均相明胶溶液；其中，所述明胶为动物骨明胶或动物皮明胶，所述明胶的分子量为20-180KD；

然后将25-30％w/v的明胶溶液置于针筒内，通过静电纺丝法收集静电纺丝明胶膜；静电纺丝过程，静电纺丝电压为14-18KV，针头距接收器距离为13-17cm，推进泵的推进流率为0.28-0.32ml/h；所收集的静电纺丝明胶膜厚度为0.45-0.55mm，纺丝直径为150-200纳米；

2)将K2S2O2加入去离子水溶液中，搅拌至完全溶解后，再加入等量的NaClO2，搅拌均匀得到0.8-1.2g/L二氧化氯溶液；

将上述静电纺丝明胶膜与的二氧化氯溶液一同置于密封容器中10-14h，通过挥发性二氧化氯蒸汽处理明胶膜，处理后的明胶膜置于干燥箱中干燥8-12h,然后通风处理18-24h使明胶膜表面二氧化氯完全挥发，接着用去离子水清洗2-3遍，干燥。

实施例1

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法

1)将动物骨明胶溶于NaCl溶液中，于50℃下磁力搅拌24h，得到25％w/v的均相明胶溶液；然后将明胶溶液置于针筒内，通过静电纺丝法收集静电纺丝明胶膜；静电纺丝过程，静电纺丝电压为14KV，针头距接收器距离为13cm，推进泵的推进流率为0.28ml/h；

2)将K2S2O2加入去离子水溶液中，搅拌至完全溶解后，再加入等量的NaClO2，搅拌均匀得到0.8g/L二氧化氯溶液；

将上述静电纺丝明胶膜与的二氧化氯溶液一同置于密封容器中10h，通过挥发性二氧化氯蒸汽处理明胶膜，处理后的明胶膜置于干燥箱中干燥8h,然后通风处理24h使明胶膜表面二氧化氯完全挥发，接着用去离子水清洗3遍，干燥。

实施例2

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法

1)将动物皮明胶溶于NaCl溶液中，于60℃下磁力搅拌18h，得到30％w/v的均相明胶溶液；然后将明胶溶液置于针筒内，通过静电纺丝法收集静电纺丝明胶膜；静电纺丝过程，静电纺丝电压为18KV，针头距接收器距离为17cm，推进泵的推进流率为0.32ml/h；

2)将K2S2O2加入去离子水溶液中，搅拌至完全溶解后，再加入等量的NaClO2，搅拌均匀得到1.2g/L二氧化氯溶液；

将上述静电纺丝明胶膜与的二氧化氯溶液一同置于密封容器中14h，通过挥发性二氧化氯蒸汽处理明胶膜，处理后的明胶膜置于干燥箱中干燥12h,然后通风处理18h使明胶膜表面二氧化氯完全挥发，接着用去离子水清洗3遍，干燥。

实施例3

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法

1)将动物皮明胶溶于NaCl溶液中，于55℃下磁力搅拌24h，得到28％w/v的均相明胶溶液；然后将明胶溶液置于针筒内，通过静电纺丝法收集静电纺丝明胶膜；静电纺丝过程，静电纺丝电压为16KV，针头距接收器距离为15cm，推进泵的推进流率为0.30ml/h；

2)将K2S2O2加入去离子水溶液中，搅拌至完全溶解后，再加入等量的NaClO2，搅拌均匀得到0.1/L二氧化氯溶液；

将上述静电纺丝明胶膜与的二氧化氯溶液一同置于密封容器中12h，通过挥发性二氧化氯蒸汽处理明胶膜，处理后的明胶膜置于干燥箱中干燥10h,然后通风处理24h使明胶膜表面二氧化氯完全挥发，接着用去离子水清洗3遍，干燥。

实施例4

一种提高静电纺丝明胶膜水溶性的处理方法

1)称取2.8克明胶溶于10ml的NaCl水溶液中，50℃下搅拌24h，得到28％的明胶溶液。将所得的明胶溶液置于10ml针筒内，针筒放于静电纺丝机上，设定纺丝参数，电压调节至16KV，推进泵推进速度设定为0.3ml/h，针头距接收器距离为15cm，在收集器收集约0.5mm厚度的明胶纺丝膜；

2)分别称取0.5克K2S2O2和NaClO2倒入盛有1L去离子水溶液的烧杯中，玻璃棒搅拌至完全溶解，得到二氧化氯水溶液；将二氧化氯水溶液和明胶纺丝膜同时置于密闭容器中12h,得到二氧化氯蒸汽处理后的静电纺丝明胶膜。

图1展示了实施例4中二氧化氯蒸汽处理前、后的静电纺丝明胶膜的扫描电镜图，从图中可以清晰看到成功制备100纳米的静电纺丝明胶膜，且二氧化氯蒸汽处理后膜变得紧密。

图2展示了本发明中二氧化氯蒸汽处理后的静电纺丝明胶膜的红外图谱(FTIR)，从图中可以清晰看到明胶特征红外峰(图1A)，而二氧化氯处理后明胶膜在1102cm^‐1(C‐O‐C)处特征峰消失。

实施例5

静电纺丝明胶膜的机械性能的测定：将实施例4制备的明胶膜，分别剪成5*10mm²大小，测试机械性能。

结果显示经二氧化氯处理后的明胶膜机械强度由原膜的9.30MPa增加到22.42MPa(图3)，这就说明经二氧化氯处理后的明胶膜展现出很好的机械性能。

实施例6

静电纺丝明胶膜水溶性的测定：分别剪取质量为0.05g的原膜和0.05g的二氧化氯处理后的明胶膜，置于PH＝7.4的PBS溶液中，在37℃的培养箱中震荡10min、20min、30min、40min、50min、60min。然后称量每个时间间隔膜的质量。由溶胀率进行溶胀率计算，通过溶胀率评估膜的水溶性。

其中：Ws为湿膜重量，Wd为干膜重量。

结果表明，经过二氧化氯处理后的明胶膜溶胀率最终达到180％(图4)，而原膜为850％，这说明处理后的明胶膜水溶性有了很大的提高。表明二氧化氯处理后的膜已经拥有了很好的水溶性，对于明胶膜的实际应用具有很大的价值。

实施例7

二氧化氯处理的静电纺丝明胶膜的细胞毒性评估：间充质干细胞用来评估二氧化氯处理后的明胶膜的细胞毒性。约10⁵个间充质干细胞分别接种在放有2*2*1mm³二氧化氯处理后的明胶膜的24培养板中和空白24孔板中，加入含有牛血清白蛋白和双抗的高糖培养基，分别孵育1、3、5、7天。在每个时间间隔后加入MTT孵育四个小时，而后加入DMSO震荡15min，570nm处分别测OD值。

结果如图5所示，经过二氧化氯处理的明胶膜实验组所测的OD值，在1、3天略低于对照组，这可能是处理后的明胶膜表面残留的二氧化氯导致的。而在第5、7天其OD值随着二氧化氯的挥发高于空白组，这表明二氧化氯处理后的明胶膜几乎没有细胞毒性，保留了原膜的生物活性，通过这种方法处理的明胶膜具有很好的生物活性。

实施例8

二氧化氯处理的静电纺丝明胶膜的体外生物生物活性评估：约10⁵个间充质干细胞分别接种在放有2*2*1mm³二氧化氯处理后的明胶膜的24培养板中，加入含有牛血清白蛋白和双抗的高糖培养基，分别孵育1、3、5、10天。而后取出共培养的明胶膜，依次用用70％、80％、90％、100％的乙醇脱水2分钟，脱水后的明胶膜用5％甲醛溶液固定4h。扫描电镜(SEM)观察细胞在明胶膜上的粘附生长情况。

图6展示了细胞在二氧化氯明胶膜上的粘附生长状况。第一天有少量的细胞粘附在明胶膜表面，第三天开始增多，随着时间的变化在第五天时细胞大量粘附在明胶膜表面，达到第十天时细胞已经大量迁移到明胶膜内部，形成一层细胞层，并且整个时间段内细胞在明胶膜上都生长圆润状态很好。这表明二氧化氯处理的明胶膜有很好的生物相容性，是一种很好的支架材料，具有广阔的应用前景。