本发明属于医药技术领域，具体涉及一种田旋花总树脂糖苷提取物及其制备方法和医药用途，更具体是田旋花总树脂糖苷提取物在制备抗肿瘤及抗菌药物中的应用。
背景技术：
田旋花(convolvulusarvensisil.)为旋花科旋花属植物田旋花的干燥全草。田旋花在我国主要分布在山东、江苏、河南、四川、西藏等地，资源丰富，为民间常用中草药。《中华本草》记载，田旋花以全草及花入药，性辛味温，具有祛风止痒的功效，常用于风湿痹痛、牙痛、神经性皮炎等症状。药理研究表明，田旋花具有抗肿瘤、降糖、降血压、泻下等多种生物活性。目前，田旋花的成分研究主要集中在黄酮、咖啡酸、生物碱等化学成分，但这些研究并未能有效地解释田旋花的生物活性。
树脂糖苷类化合物是旋花科植物中的特征活性成分。树脂糖苷类化合物组成主要包括一个长链羟基脂肪酸和一个寡糖链，羟基脂肪酸作为苷元并通常与寡糖链形成内酯，因此又被称作大环内酯类化合物，同时有多个小分子有机酸作为修饰性取代基酯化在糖链上。由于寡糖链种类，内酯键位置以及多种不同取代基酯化位置的变化，使树脂糖苷类化合物结构多样。此外，树脂糖苷类化合物被报道有多种显著的生物活性，包括细胞毒作用、抑菌作用、离子运载作用、抗结核作用、抑制植物生长及雌激素样作用，是旋花科药用植物重要的物质基础。不过，目前尚未有关于田旋花中树脂糖苷类成分及生物活性的报道。
本发明研究发现田旋花中含有一类大极性的树脂糖苷类成分，具有较好的抗肿瘤及抗菌活性。中国专利cn106361798a曾公开了一种树脂糖苷类化合物的提取方法，提取手段主要是将药材样品进行氯仿-水加热回流提取，接着经甲醇、氯仿依次离心去除沉淀，脱色，经硅胶柱层析、凝胶层析提纯，干燥即得。该发明工艺主要是针对旋花科植物中常见的极性较小、可用二氯甲烷溶解的树脂糖苷类成分，不过该方法并不适用于田旋花中树脂糖苷类成分的提取。
技术实现要素：
本发明针对现有技术不足，提供了一种田旋花中大极性的总树脂糖苷的制备方法，得到相应的田旋花总树脂糖苷提取物，提取效率较高。此外，提供了所述田旋花总树脂糖苷提取物在制备抗肿瘤及抗菌药物中的应用。
本发明所述田旋花总树脂糖苷提取物是从中药田旋花中提取的，所述田旋花是旋花科旋花属植物田旋花的全草。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种田旋花总树脂糖苷提取物的制备方法，包括以下步骤：
a、取田旋花全草，用极性溶剂提取、浓缩；
b、将步骤a的提取物用水分散后用二氯甲烷萃取，取水相，再使用正丁醇萃取，取正丁醇相，浓缩；
c、将步骤b所得提取物用大孔吸附树脂进行柱色谱分离，用极性溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩；
d、将步骤c中所得提取物用凝胶柱色谱分离，用极性溶剂洗脱，收集洗脱液，得到田旋花总树脂糖苷提取物。
上述步骤a所述极性溶剂可以为醇或醇的水溶液，所述醇优选乙醇或甲醇。
上述步骤c所述大孔吸附树脂选自ab-8、sp-70、d101、dm-130、s-8、d3520、d4020、hp-20中的一种或几种。洗脱使用的极性溶剂为乙醇、甲醇或乙醇、甲醇的水溶液。优选依次使用40％-60％乙醇或甲醇水溶液和90％-100％乙醇或甲醇水溶液洗脱，收集90％-100％乙醇或甲醇水溶液的洗脱液。更优选依次使用40％-60％乙醇水溶液和90％-100％乙醇水溶液洗脱，收集90％-100％乙醇水溶液的洗脱液。更优选依次用50％和95％的乙醇溶液进行洗脱，收集95％的乙醇洗脱液。(以上百分比为体积百分比)。
上述步骤d凝胶柱色谱选自步骤d凝胶柱色谱选自sephadexg、sephadexlh-20、bio-gelp、sepharosebio-gela中的一种或几种，优选sephadexlh-20。
上述步骤d优选使用甲醇洗脱。
本发明的另一目的在于提供一种田旋花总树脂糖苷提取物，采用本发明所述方法制备得到。本发明的另一目的在于提供本发明所述田旋花总树脂糖苷提取物在制备抗肿瘤药物和抗菌药物中的应用。
本发明所述田旋花总树脂糖苷提取物的制备方法的一个具体技术方案，包括如下步骤：
a、取干燥的田旋花全草，用醇或者醇水溶液作为提取溶剂，经冷浸、渗入、超声、或热回流提取，合并提取液，减压浓缩；
b、将步骤(a)的浓缩液用水分散后，依次用二氯甲烷及正丁醇萃取，正丁醇萃取液减压回收得到浸膏；
c、将步骤(b)中所得浸膏用大孔吸附树脂进行柱色谱分离，依次用40％-60％乙醇、90％-100％乙醇洗脱，收集90％-100％乙醇洗脱液，浓缩至浸膏状；
d、将步骤(c)中所得浸膏用凝胶吸附树脂柱分离，用甲醇进行洗脱，收集第一到第三个柱体积的洗脱液，得到田旋花总树脂糖苷提取物。
本发明还提供一种含有本发明所述田旋花总树脂糖苷提取物的药物。
作为优选，还包括医学上可接受的辅料。
本发明首次发现了田旋花中含有活性树脂糖苷类成分，并建立了总树脂糖苷类成分的提取富集方法，该方法操作简单、条件温和、成本较低。研究发现，田旋花总树脂糖苷部位具有显著的抗肿瘤及抗菌活性，可用于制备抗肿瘤及抗菌药物。
附图说明
图1为本发明实施例1方案1所述田旋花总树脂糖苷提取物的1h核磁共振图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1田旋花总树脂糖苷提取物的制备
方案1
1.取田旋花100g，粉碎后，用95％乙醇200ml回流提取2小时，滤取提取液，药渣再经95％乙醇200ml回流提取2小时，滤取提取液，合并提取液，真空浓缩至无醇味；
2.总提取液用200ml水分散，用200ml二氯甲烷萃取3次后，用200ml正丁醇萃取3次，回收萃取剂得正丁醇萃部位浸膏；
3.所得正丁醇部位浸膏用大孔吸附树脂d101进行吸附，依次用50％,95％的乙醇水溶液进行洗脱，收集95％的乙醇洗脱液，减压浓缩成浸膏备用；
4.将步骤(3)中得到的浸膏用甲醇溶解，上sephadexlh-20凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，收集第一到第三个柱体积的洗脱液，减压浓缩干燥，即得田旋花总树脂糖苷提取物,提取率为7.26‰。
方案2
1.取田旋花100g，粉碎后，用95％乙醇300ml回流提取2小时，滤取提取液，药渣再经95％乙醇300ml回流提取2小时，滤取提取液，合并提取液，真空浓缩至无醇味；
2.总提取液用200ml水分散，用200ml二氯甲烷萃取3次后，用200ml正丁醇萃取3次，回收萃取剂得正丁醇萃部位浸膏；
3.所得正丁醇部位浸膏用大孔吸附树脂d101进行吸附，依次用60％,100％的乙醇水溶液进行洗脱，收集100％的乙醇洗脱液，减压浓缩成浸膏备用；
4.将步骤(3)中得到的浸膏用甲醇溶解，上sephadexlh-20凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，收集第一到第三个柱体积的洗脱液，对得到的洗脱馏分进行合并，减压浓缩干燥，即得田旋花总树脂糖苷提取物，提取率为5.83‰。
方案3
1.取田旋花100g，粉碎后，用甲醇300ml回流提取2小时，滤取提取液，药渣再经甲醇300ml回流提取2小时，滤取提取液，合并提取液，真空浓缩至无醇味；
2.总提取液用300ml水分散，用300ml二氯甲烷萃取3次后，用300ml正丁醇萃取3次，回收萃取剂得正丁醇萃部位浸膏；
3.所得正丁醇部位浸膏用大孔吸附树脂d101进行吸附，依次用40％,90％的甲醇溶液进行洗脱，收集90％的甲醇洗脱液，减压浓缩成浸膏备用；
4.将步骤(3)中得到的浸膏用甲醇溶解，上sephadexlh-20凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，收集第一到第三个柱体积的洗脱液，减压浓缩干燥，即得田旋花总树脂糖苷提取物，提取率为6.46‰。
实施例2、树脂糖苷类总提取物的定性试验一
1.试验对象：实施例1中方案1-3提取得到的产物。
2.试验方法：对实施例1-3提取得到的产物进行黄酮类化合物、生物碱及蒽醌类化合物和糖、多糖和苷类的检测试验。
2.1.黄酮检识反应：在实施例1-3提取所得的产物的甲醇溶液中加入少量镁粉，并滴加几滴浓盐酸。
2.2.生物碱检识反应：在实施例1-3提取所得的产物中加入碘化铋钾试剂。
2.3.生物碱检识反应：实施例1-3提取所得的产物中加入碘化汞钾试剂。
2.4.蒽醌检识反应：在实施例1-3提取所得的产物中加入醋酸镁甲醇溶液。
2.5.糖、多糖和苷类检识反应：在实施例1-3提取所得的产物中加入molish试剂。
3.试验结果：
3.1.黄酮检识反应：盐酸－镁粉反应，芦丁阳性对照液盐酸－镁粉反应呈现红色，阴性对照液无红色，实施例1-3中得到的产物进行黄酮检识反应也无红色产生，证明产物不含有黄酮类化合物。
3.2.生物碱检识反应：碘化铋钾反应，盐酸小檗碱阳性对照液碘化铋钾反应出现棕黄色沉淀，阴性对照液无沉淀，实施例1-3中得到的产物进行碘化铋钾反应也无沉淀产生，证明产物不含有生物碱类化合物。
3.3.生物碱检识反应：碘化汞钾反应，盐酸小檗碱阳性对照液碘化汞钾反应出现类白色沉淀，阴性对照液无沉淀，实施例1-3中得到的产物进行碘化汞钾反应也无沉淀产生，证明产物不含有生物碱类化合物。
3.4.蒽醌检识反应：醋酸镁反应，大黄素阳性对照液醋酸镁反应呈现橙红色，阴性对照液无橙红色，实施例1-3产物进行醋酸镁反应也无橙红色产生。证明产物不含有蒽醌类化合物。
3.5.糖、多糖和苷类检识反应：molish反应，葡萄糖阳性对照液molish反应出现紫红色环，阴性对照液无紫红色环，实施例1-3产物进行molish反应出现紫红色环。证明产物中含有糖、多糖和苷类化合物。
根据对实施例1中方案1-3产物的定性分析，本发明提供的工艺方法提纯的产物中含有树脂糖苷类化合物，并且不含有其他性质相似的有机物黄酮类化合物、生物碱及蒽醌类化合物，说明本发明提纯的产物为树脂糖苷类化合物，而且纯度较高。
实施例3、树脂糖苷类总提取物的定性试验二
1.试验对象：实施例1中方案1提取得到的产物。
2.试验方法：通过核磁共振检测实施例1中方案1提取得到的产物，对其1hnmr信号进行鉴定。
3.实验结果：1hnmr谱图中，信号主要集中3.5-6.5之间的糖残基信号段、0.9-2.0的脂肪链残基信号段以及2.5-3.0之间的内酯环的亚甲基信号段，符合树脂糖苷类成分的信号分布，说明该提取物中主要成分为树脂糖苷类成分。
实施例4采用中国专利cn106361798a公开的“一种树脂糖苷类化合物的提取方法”对田旋花药材进行处理
方案1
1.取田旋花100g，粉碎后，粉碎至20目，得粗粉，用氯仿-水混合液加热回流提取，所述氯仿-水混合液的用量与粗粉的料液比为5ml:1g，所述加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将提取液减压浓缩，冷冻干燥得到粗品a；
2：将粗品a加入甲醇完全溶解后，甲醇与粗品a液固比为3ml：1g，在800转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液减压浓缩，冷却干燥，得细粉，将细粉加入氯仿完全溶解，所述氯仿与粗品a液固比为2ml：1g，在800转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液b；
3：将上清液b进行活性炭脱色处理20分钟，所述活性炭粒度为50目，过滤，将滤液减压浓缩，冷冻干燥得到粉末c；
4：将粉末c进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析中拌样硅胶与粉末c重量比为2:1，装柱硅胶与粉末c重量比为70:1，所述硅胶粒度为200目，采用氯仿-甲醇混合液混合液洗脱，收集洗脱液，所述氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为15：1，将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥后再进行凝胶层析，采用甲醇洗脱，收集第一和第二柱体积的洗脱液，合并两柱洗脱液，减压浓缩冷冻干燥，得到浸膏备用。
方案2
1.取田旋花100g，粉碎后，粉碎至20目，得粗粉，用氯仿-水混合液加热回流提取，所述氯仿-水混合液的用量与粗粉的料液比为3ml:1g，所述加热回流提取3次，每次1小时，过滤，将提取液减压浓缩，冷冻干燥得到粗品a；
2：将粗品a加入甲醇完全溶解后，甲醇与粗品a液固比为3ml：1g，在800转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液减压浓缩，冷却干燥，得细粉，将细粉加入氯仿完全溶解，所述氯仿与粗品a液固比为4ml：1g，在800转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液b；
3：将上清液b进行活性炭脱色处理20分钟，所述活性炭粒度为50目，过滤，将滤液减压浓缩，冷冻干燥得到粉末c；
4：将粉末c进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析中拌样硅胶与粉末c重量比为2:1，装柱硅胶与粉末c重量比为60:1，所述硅胶粒度为200目，采用氯仿-甲醇混合液混合液洗脱，收集洗脱液，所述氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为20：1，将洗脱液减压浓缩，冷冻干燥后再进行凝胶层析，采用甲醇洗脱，收集第一和第二柱体积的洗脱液，合并两柱洗脱液，减压浓缩冷冻干燥，得到浸膏备用。
实施例5、实施例4中提取成分的定性试验
1.试验对象：实施例4中方案1-2提取得到的产物。
2.试验方法：在实施例4中方案1-2提取所得的产物中加入molish试剂，进行糖、多糖和苷类的检测试验。
3.实验结果：葡萄糖阳性对照液molish反应出现紫红色环，阴性对照液无紫红色环，实施例4中1-2产物进行molish反应未出现紫红色环。证明产物中不含有糖、多糖和苷类化合物，即不含有树脂糖苷类成分。
实施例6、抗肿瘤活性测试
利用mtt法测定田旋花树脂糖苷总提取物对人肿瘤细胞的细胞毒活性。取实施例1中方案1～3所得田旋花总树脂糖苷提取物适量，dmso溶解后，利用mtt法分别测定对人乳腺癌mcf-7细胞，人肝癌bel-7402细胞，人宫颈癌hela细胞和人非小细胞肺癌a549细胞生长的抑制率。
实验方法：将状态良好的细胞接种于96孔板(5×103个细胞/孔)，每孔190μl培养基，37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养24h后，加入不同浓度的样品或阳性药，每孔10μl，阴性对照组加入等量的培养液，每个浓度设3个平行孔。继续培养48h，每孔加入20μl的mtt(5mg/ml)，4h后弃掉培养基，每孔加入150μldmso，将结晶充分震荡摇匀后，置酶标仪中以570nm为检测波长，630nm为参比波长，测定各孔的吸光度，计算不同浓度的抑制率及ic50值，实验重复三次取平均值。结果见表1。
表1不同实施方案得到的树脂糖苷提取物的抗肿瘤活性筛选(ic50μg/ml)
通过表1可看出，田旋花总树脂糖苷提取物对多种肿瘤细胞均具有较好的抑制作用。
实施例7、抑菌活性测定
利用微量稀释法测定田旋花树脂糖苷总提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。取实施例1方案1～3所得田旋花总树脂糖苷提取物适量，dmso溶解后，利用微量稀释法测定其对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。
实验方法：取金黄色葡萄球菌保存液10μl加入1mllb液体培养基，置于35℃摇床过夜培养16h左右至对数期。无菌96孔板第1-11列加入灭菌lb液体培养基180μl后，加入药物20μl，逐次倍比稀释至第11列。无菌96孔板第12列上4孔加200μl/孔灭菌lb液体培养基做阴性对照，下4孔加200μl菌液做阳性对照。药液和菌液上样完毕后，盖好板盖，37℃温箱培养20h。用酶标仪测定od值，观察结果。结果见表2。
表2不同实施方案得到的树脂糖苷提取物的抗菌活性筛选(micμg/ml)
通过表2可以看出：田旋花总树脂糖苷提取物对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。