本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法。
背景技术：
藜芦(veratrumnigruml.)系百合科多年生草本植物藜芦的干燥根及根状茎。《神农本草经》及《本草纲目》等均有记载。主要分布于亚洲、欧洲和北美洲，我国有二十余种，全国大部分省区均有分布。该属植物有涌吐风痰、杀虫疗疮的功效，用于治疗高血压、中风、骨折和疟疾等疾病。
现代研究表明，藜芦的主要化学成分是生物碱，且其生物碱种类较多，母核为异胆甾烷和胆甾烷生物碱，还有少量二肽类、黄酮类以及茋类化合物等成分。药理研究表明藜芦具有增强心肌收缩力、抗肿瘤、改善脑循环、抑制血小板凝结和降低血压等作用。藜芦是最早被证实具有降压活性的其中一种药物，藜芦属植物均具有降血压作用，但不同品种的藜芦属植物其降压的作用强度和持续时间都不一样。所含生物碱中乌苏里藜芦碱对血液粘度具有明显的降低作用，乌苏里藜芦碱具有极强的改变血液流变性的作用，环巴胺能够抑制hedgehog信号通路，同时发现环巴胺在诱导癌症细胞调亡的时候，不影响正常细胞的生长情况，在癌症治疗方面有巨大潜力，同时抑制信号通路为抗癌药物的设计提供了新思路。可见藜芦生物碱有开发应有潜力，但对优化其生物碱的提取方法未见报道。
目前，藜芦生物碱提取方法有溶剂浸渍提取法、回流提取法、超临界流体萃取法以及氯仿-甲醇超声提取法等。溶剂浸渍提取法溶剂消耗量大、耗时长，提取率低；回流提取法需要对药液多次、长时间加热，这对生物碱具有一定的破坏性，且加热需要消耗大量能源；超临界二氧化碳萃取过程中，由于藜芦生物碱本身的性质，给萃取造成很大的困难，同时需加入夹带剂如甲醇、氯仿等，使超临界co2萃取法失去了无毒，萃取效率高等优势，从设备费用上，超临界萃取设备一般比较昂贵，目前已有报道的超临界co2萃取藜芦生物碱的时间也较长。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法，该方法操作简单，对设备要求低，提取率高，适合工业化规模生产。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)按1g：(10～20)ml的料液比，取藜芦粉末和乙醇，在功率为300～400w、温度为50～60℃的条件下，超声提取40～55min，收集提取液，然后经离心、减压浓缩回收溶剂，制得藜芦提取物；
2)向藜芦提取物中加入10％酒石酸溶液，搅拌均匀后过滤、洗涤，再调节溶液ph值至10，然后经萃取、减压浓缩回收溶剂，蒸干后用甲醇溶解、过滤，制得藜芦总生物碱。
优选地，步骤1)中，按1g：15ml的料液比，取藜芦粉末和乙醇，在功率为350w、温度为60℃的条件下，超声提取50min。
优选地，步骤1)中，所用乙醇的浓度为60％～80％。
优选地，步骤1)中，所用藜芦粉末是经氨水碱化处理后的粉末。
优选地，所述氨水碱化处理是将藜芦药材按照1g：4ml的料液比用氨水浸泡3h后粉碎，制得藜芦粉末。
优选地，步骤2)中，洗涤采用乙醚进行洗涤，采用氢氧化钠调节溶液ph值至10。
优选地，步骤2)中，萃取采用氯仿，萃取3～5次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的提取藜芦总生物碱的方法，采用超声法提取，超声波通过高频机械波这种特殊的物理环境使细胞中的有效成分能够直接与溶剂接触并溶解在其中，提高了有效成分的提取率。本发明通过设计不同因素各水平响应面优化法考察超声提取藜芦生物碱的最佳提取条件，采用酸性染料比色法测定藜芦总生物碱含量。与传统提取方法(回流提取法)相比，超声提取法提取藜芦总生物碱得率明显高于回流提取法。本发明公开的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法，以乙醇作为提取溶剂，乙醇无毒且价格低廉，能够显著降低生产成本，使得本发明具有简单、省时、安全、简便、成本低等优势，能够缩短浸提时间，很好的保持生物碱的品质和特性，满足工业化大规模的生产需求。
附图说明
图1a为超声时间和提取温度交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图；
图1b为超声时间和料液比交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图；
图1c为超声时间和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图；
图1d为提取温度和料液比交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图；
图1e为提取温度和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图；
图1f为料液比和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
一种超声法提取藜芦总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)将药材经氨水碱化，每1.00g藜芦粉末4.00ml氨水的比例浸泡3h。
2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)，置于圆底烧瓶中，以1:15的料液比加入60％乙醇，以50℃，300w超声提取40min，所得提取液经离心后，减压浓缩回收溶剂。
3)所得提取物，加10％的酒石酸溶液溶解、过滤，乙醚洗涤，酸水液经氢氧化钠溶液调节ph为10，用氯仿萃取3次，15ml/次。
4)合并三次萃取液，减压浓缩回收氯仿，蒸干，用甲醇溶解，过滤并定容至10ml容量瓶待测。
实施例2
一种超声法提取藜芦总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)将药材经氨水碱化，每1.00g藜芦粉末4.00ml氨水的比例浸泡3h。
2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)，置于圆底烧瓶中，以1:15的料液比加入80％乙醇，以60℃，350w超声提取50min，所得提取液经离心后，减压浓缩回收溶剂。
3)所得提取物，加10％的酒石酸溶液溶解、过滤，乙醚洗涤，酸水液经氢氧化钠溶液调节ph为10，用氯仿萃取3次，15ml/次。
4)合并三次萃取液，减压浓缩回收氯仿，蒸干，用甲醇溶解，过滤并定容至10ml容量瓶待测。
实施例3
一种超声法提取藜芦总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)将药材经氨水碱化，每1.00g藜芦粉末4.00ml氨水的比例浸泡3h。
2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)，置于圆底烧瓶中，以1:20的料液比加入70％乙醇，以55℃，400w超声提取55min，所得提取液经离心后，减压浓缩回收溶剂。
3)所得提取物，加10％的酒石酸溶液溶解、过滤，乙醚洗涤，酸水液经氢氧化钠溶液调节ph为10，用氯仿萃取3次，15ml/次。
4)合并三次萃取液，减压浓缩回收氯仿，蒸干，用甲醇溶解，过滤并定容至10ml容量瓶待测。
1、总生物碱含量测定
1)对照品溶液的配制
称取4.00mg藜芦定对照品，用甲醇溶解定容于10ml容量瓶，配制成浓度为0.40mg/ml的藜芦定对照品溶液。
2)测定条件的选择
取对照品溶液、供试品溶液各1.00ml，置于50ml磨口锥形瓶中，挥干溶剂，精密加入邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液5.00ml，再精密加入ph4.5溴甲酚绿显色剂溶液4.00ml、氯仿10.00ml，密塞，振摇，转移至分液漏斗中，静置1h后分出氯仿层，用干燥无水硫酸钠0.20g脱水30min。用紫外分光光度计在200～800nm范围做全波长扫描，发现其最大吸收波长均在412nm左右，故选择412nm为测定波长。
3)样品含量的测定
取1.00ml样品溶液，置于50ml磨口锥形瓶中，按2.2.2项下⑵的方法，于412nm处测定藜芦样品的吸光度，平行测定3次，计算总生物碱含量。藜芦总生物碱得率的计算公式如下：
总生物碱得率(％)＝(提取物中总生物碱的质量/原料的质量)×100％
测定结果参见表2。
2、传统回流法、超声提取法使用的提取对比例：
对比例1
传统回流提取藜芦总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)将药材经氨水碱化，每1.00g藜芦粉末4.00ml氨水的比例浸泡3h。
2)取经1)碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)，置于圆底烧瓶中，用80％的乙醇15.00ml，60℃回流提取2次，每次50min。
3)收集2)中两次提取液，离心，减压浓缩回收溶剂。
4)得提取物，加10％的酒石酸溶液溶解、过滤，乙醚洗涤，酸水液经氢氧化钠溶液调节ph为10，用氯仿萃取3次，15ml/次。
5)合并三次萃取液，减压浓缩回收氯仿，蒸干，用甲醇溶解，过滤并定容至10ml容量瓶待测。
3、本发明的提取方法各因素优化实验
超声法提取藜芦总生物碱的方法，包括以下步骤：
1)将药材经氨水碱化，每1.00g藜芦粉末4.00ml氨水的比例浸泡3h。
2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)，置于圆底烧瓶中，加入一定料液比的某浓度乙醇，以一定条件超声提取，所得提取液经离心后，减压浓缩回收溶剂。
3)在步骤2)中加入乙醇浓度为20，40，60，80，100％，超声时间设为20，30，40，50，60min，超声温度分别为30，40，50，60，70℃，料液比分别为1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，超声功率分别为200，250，300，350，400，450w。
4)经3)中个单因素水平得提取物，加10％的酒石酸溶液溶解、过滤，乙醚洗涤，酸水液经氢氧化钠溶液调节ph为10，用氯仿萃取3次，15ml/次。
5)合并三次萃取液，减压浓缩回收氯仿，蒸干，用甲醇溶解，过滤并定容至10ml容量瓶待测。
6)根据以上得不同条件水平下藜芦生物碱的得率，选出影响较大的单因素条件，在此基础上，采用4因素3水平的响应面实验做进一步的优化，见表1。运用design-expert软件对实验数据进行回归分析，预测提取藜芦生物碱的最佳工艺参数。具体的因素水平及结果见表2，3。
响应面等高线图能清晰的反映各因素之间的交互作用，等高线图呈椭圆形表示两因素交互作用显著，呈圆形表示两因素交互作用不显著。在其他因素固定的情况下，考察各个交互项对藜芦得率的影响，利用design-expert8.0.6软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图及等高线图，见图1a～图1f。从各因素之间两两相互作用的响应面图形观察曲线走势越平滑，其影响越小，图形曲线走势较陡，说明其影响最为显著。结合表3和图1a～图1f可知，a、c、ab、ac、bd、cd、c2均呈显著影响，b、d、ad、bc、a2、b2、d2之间的交互作用均不显著。从单因素水平观察，其影响顺序为：c(料液比)>a(超声时间)>b(提取温度)＝d(超声功率)。在有交互作用存在下，对藜芦生物碱得率的影响顺序为：cd>ab>ac>bd>ad>bc。
7)以藜芦生物碱得率(r)为响应值，模拟得到二次多元回归方程如下：r＝0.95－0.15a－0.032b－0.16c－0.032d－0.18ab+0.17ac+0.050ad+0.033bc－0.16bd+0.30cd－0.029a2－0.031b2+0.11c2－o.035d2
8)回归模型验证：由design-expert8.0.6软件分析，模拟得到藜芦中总生物碱提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度80％，超声时间50min，提取温度60℃，料液比1:15，超声功率350w，此时总生物碱得率估计值为1.59％。为验证模型准确性，按软件预测的最佳工艺条件进行3组平行验证试验，得其平均值为1.54±0.04％，与其理论值偏差为3.14％，证明响应面法优化超声提取藜芦中生物碱提取工艺是可行的。
9)不同提取方法提取总生物碱得率的对比参见表4，结果表明，本发明采用的超声提取法与回流提取法相比，超声提取法提取藜芦总生物碱得率明显高于回流提取法。
表1响应面设计因素与水平
表2中心组合实验设计及结果
表3模型回归方差分析
表4不同提取方法提取总生物碱得率的对比