本发明涉及一种基于灵芝多糖-组氨酸结合物的ph敏感型载药纳米粒子及其制备方法，属于生物医药和高分子材料技术领域。
背景技术：
目前国内外研究在灵芝多糖的提取分离、纯化、结构鉴定等方面进行了大量的实验与工作，对灵芝多糖的抗肿瘤机制进行深入研究，发现了灵芝多糖在提高人体免疫力、治疗肿瘤方面有着光明的前景，但实验结果大都集中于免疫药理、免疫调节研究。将灵芝多糖用作药物载体材料的研究几乎未见报道。
纳米药物载体以其独特的尺寸、结构及所发挥的优良性能，可改善传统药物的缺点，在药物的靶向递送方面拥有广阔的前景。除了可以增加疏水性药物的溶解性之外，纳米药物载体还可以通过自身尺寸上的优势延长其在体循环中的时间，以及利用实体瘤的高通透性和滞留效应(epr)效应实现被动靶向性。目前，常使用的药物载体多由合成型高分子材料制备，往往缺乏生物活性，部分材料也不具有生物可降解性，长期使用会因在体内富集而造成远期的肝、肾毒性。因此，近年来的研究多利用天然高分子构建药物载体。
多糖作为一类生物相容性好的高分子材料在药物载体研究方面受到广泛关注。因此，本发明采用灵芝多糖为材料制备纳米药物载体。此外，近年来，根据正常细胞和肿瘤细胞的表面和内部环境的性质差异，以设计智能型(ph敏感、光敏感、磁场响应或电响应等)控制释放的研究成为本领域的研究热点，其中ph敏感响应型纳米药物载体是最受欢迎的研究之一。其原理是：正常细胞和组织的ph为7.4左右，而肿瘤细胞内部的ph为6.5左右甚至更低，如果纳米药物载体在ph7.0以上不降解，而在酸性条件下降解或溶解，就可以实现抗癌药物的靶向释放，从而显著降低抗癌药物的毒副作用，增强其生物利用度。
因此，本发明采用组氨酸对灵芝多糖进行化学修饰，制备两亲性的ph敏感响应纳米药物载体，可实现抗癌药物的靶向递送、显著提高其生物利用度；此外，灵芝多糖本身具有抗肿瘤、提高免疫力的效果，与抗癌药物有协同作用，增强抗癌药物的作用效果。迄今，还未见以灵芝多糖为材料的ph值敏感型纳米药物载体研究的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于灵芝多糖-组氨酸结合物的ph敏感型载药纳米粒子及其制备方法，本发明方法提供的基于灵芝多糖-组氨酸结合物的ph敏感型载药纳米粒子具有良好的生物相容性和ph敏感性。在本发明中本发明中所述的灵芝多糖-组氨酸结合物分子结构新颖，其在中性和碱性水溶液中自组装制备的ph响应的载药纳米粒子具有创新性，且操作过程简单，配方中未使用任何其他表面活性剂，具有安全性、靶向性的特点，且能避免药物的不完全释放对患者带来的毒副作用。
本发明提供的一种基于灵芝多糖-组氨酸结合物的ph敏感型载药纳米粒子及其制备方法，其特征在于，所述灵芝多糖-组氨酸结合物以灵芝多糖为亲水段、组氨酸为疏水段，通过化学键连接，然后所述的灵芝多糖-组氨酸结合物在水中自组装形成具有ph敏感的载药纳米粒子；
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物包括式ⅰ所示的结构：
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝多糖溶于去离子水中，然后加入适量的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和碳二亚胺(edc)，搅拌反应12h，再加入适量组氨酸(与灵芝多糖摩尔比分别为5：1，10：1，20：1)，搅拌反应24h后，将反应液装入透析袋透析48h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
(2)称取5mg抗癌药物溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到抗癌药物溶液a；
(3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液b；
(4)将步骤(2)所述抗癌药物溶液a缓慢滴入到步骤(3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液b中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液c；
(5)将步骤(4)所得载药纳米粒子溶液c，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子制备方法，其特征在于，按质量比，组氨酸：灵芝多糖＝0.1：1～3：1，优选0.25：1；
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子制备方法，其特征在于，按质量比，nhs：灵芝多糖＝0.1：1～1：1，优选0.2：1；
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子制备方法，其特征在于，按质量比，edc：灵芝多糖＝0.1：1～1：1，优选0.2：1；
本发明所述的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子制备方法，其特征在于，步骤2所述的抗癌药物为羟基喜树碱、紫杉醇、双氢青蒿素、白桦脂酸、阿霉素中的任意一种。
本发明制备一种灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子，基于具有提高免疫力的、生物相容性好的天然高分子灵芝多糖作为药物载体，在提高药物稳定性、降低药物低毒性的同时实现缓释效果。此外，因其具有ph响应性可实现靶向作用于肿瘤部位，达到诱导肿瘤凋亡的目的。
附图说明
图1是一种灵芝多糖-组氨酸结合物的载药纳米粒子的核磁图
图2是一种灵芝多糖-组氨酸结合物的载药纳米粒子的扫描电镜图
具体实施方式
实施例1：
1)称取100mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入10mgnhs和10mgedc，在300rpm下搅拌反应12h，然后加入10mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg羟基喜树碱溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到羟基喜树碱溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述羟基喜树碱溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有羟基喜树碱的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
实施例2：
1)称取120mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入100mgnhs和100mgedc，在350rpm下搅拌反应12h，然后加入300mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg紫杉醇溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到紫杉醇溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述紫杉醇溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有紫杉醇的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
实施例3：
1)称取120mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入20mgnhs和20mgedc，在350rpm下搅拌反应12h，然后加入50mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg双氢青蒿素溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到双氢青蒿素溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述双氢青蒿素溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有双氢青蒿素的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
实施例4：
1)称取100mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入30mgnhs和25mgedc，在350rpm下搅拌反应12h，然后加入80mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg双氢青蒿素溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到双氢青蒿素溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述双氢青蒿素溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有双氢青蒿素的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
实施例5：
1)称取110mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入60mgnhs和55mgedc，在350rpm下搅拌反应12h，然后加入60mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg双氢青蒿素溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到双氢青蒿素溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述双氢青蒿素溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有双氢青蒿素的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。
实施例6：
1)称取110mg灵芝多糖溶解于15ml去离子水中，加入30mgnhs和45mgedc，在350rpm下搅拌反应12h，然后加入40mg组氨酸，搅拌反应24h，然后将透析后的产品冷冻干燥，得到灵芝多糖-组氨酸结合物；
2)称取5mg羟基喜树碱溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，得到羟基喜树碱溶液；
3)称取5mg灵芝多糖-组氨酸结合物溶于5mlph7.2～7.4的磷酸缓冲液中，得到灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液；
4)将步骤2)所述羟基喜树碱溶液缓慢滴入到步骤3)所述灵芝多糖-组氨酸结合物水溶液中，搅拌2h，获得载药纳米粒子溶液；
5)将步骤4)所得载药纳米粒子溶液，装入截留分子量为3500da的透析袋用去离子水透析24h，得到载药纳米粒子，冷冻干燥得到载有羟基喜树碱的灵芝多糖-组氨酸结合物载药纳米粒子。