本发明属于医药领域，具体涉及补骨脂宁用作hsp90ab1抑制剂的医药用途。
背景技术：
热休克蛋白90(heatshockprotein，hsp90)是atp依赖的高度保守的分子伴侣，其可利用atp水解产生的能量参与蛋白质的正确折叠，稳定蛋白质结构，参与细胞信号转导激素应答及转录调控等反应以及肿瘤凋亡、增殖相关通路的调节。hsp90对因环境改变等各种应激状态下蛋白质稳定性的保持至关重要。除了在正常细胞中发挥重要作用外，hsp90与底物蛋白相结合参与多种疾病的发生发展，如恶性肿瘤、自身免疫性疾病。他还是多种致癌蛋白的分子伴侣，包括表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)、人类表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，her2)、间质表皮转化因子(mesenchymal-epithelialtransition，met)、蛋白激酶b(proteinkinaseb，akt)等。目前认为，人类hsp90主要包括4种亚型：hsp90aa1和hsp90ab1均位于胞质内，grp94位于内质网中，而trap1亚型则定位于线粒体基质内。hsp90aa1和hsp90ab1有85％同源，但是两者作用不同，hsp90aa1是诱导性表达，参与应激状态下细胞保护和细胞周期的调节，而hsp90ab1是组成性表达，参与早期胚胎发育、信号转导及细胞长期适应性。
目前在世界范围内，肺癌发生率和死亡率均居恶性肿瘤首位，其中约85％为非小细胞肺癌。作为分子伴侣，hsp90有助于促肺癌蛋白质的折叠和成熟，例如egfr和alk。阻断这些伴侣蛋白发挥功能是癌症治疗中的一种全新策略。ramalingam等对hsp90新型抑制剂ganetespib的一项临床ii期研究发现，在治疗晚期肺腺癌患者过程中，ganetespib与多西他赛(docetaxel)联合用药治疗与多西他赛单药治疗相比，可延长晚期肺腺癌患者的总生存期(参考文献：arandomizedphaseiistudyofganetespib,aheatshockprotein90inhibitor,incombinationwithdocetaxelinsecond-linetherapyofadvancednon-smallcelllungcancer.annoncol,2015,26:1741-1748)。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供补骨脂宁用作hsp90ab1抑制剂的医药用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
补骨脂宁用作hsp90ab1抑制剂的医药用途。
一种抑制hsp90ab1的药物制剂，含有补骨脂宁或其药用盐或其前药，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
本发明发现，补骨脂宁可以与hsp90ab1相互结合(结合能力为阳性化合物17-aag的10倍)并抑制hsp90ab1下游蛋白的表达，这表明补骨脂宁为hsp90ab1的有效抑制剂。
附图说明
图1为阳性药17-agg与egfp-hsp90ab1的相互作用关系图；
图2为补骨脂宁与egfp-hsp90ab1的相互作用关系图；
图3为compounda与egfp-hsp90ab1的相互作用关系图；
图4为neobavaisoflavone与egfp-hsp90ab1的相互作用关系图；
图5为不同浓度补骨脂宁干预2h对hsp90ab1下游客户蛋白akt稳定性的影响；磷酸化akt被去磷酸化，p-akt显著减少，证明补骨脂宁降低了akt的稳定性；
图6为相同浓度(3μg/ml)补骨脂宁干预不同时间对hsp90ab1下游客户蛋白akt稳定性的影响；磷酸化akt被去磷酸化，p-akt显著减少，证明补骨脂宁降低了akt稳定性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。
一、实验材料
补骨脂宁纯度大于95％。补骨脂宁的衍生物compounda和neobavaisoflavone自制，纯度大于95％。补骨脂宁、compounda和neobavaisoflavone的化学结构式如下。
二、实验方法
1、光亲和纯化实验
1)用1mm预冷的hcl润洗nhs-activatedsepharose4flowagrosematrix，然后与过量的补骨脂宁在偶联缓冲液(0.2mnahco3，0.5mnacl，ph8.3)中4℃孵育过夜；
2)补骨脂宁固定于agarosebeads上。0.5m乙醇胺(ph8.3)封闭过量未反应的补骨脂宁。经缓冲液洗脱后beads储存于4℃冰箱备用；
3)分别将偶联前后的补骨脂宁溶液通过hplc分析其偶联效率；
4)1％np-40裂解液(50mmtris-hcl(ph7.5)，150mmnacl，1％np-40)洗脱补骨脂宁偶联beads；
5)洗脱后，与c57bl/6j小鼠肝脏组织裂解液混合，4℃孵育2h；
6)结束后，用1％np-40裂解液洗脱3次，再用5mm补骨脂宁进行洗脱；
7)在竞争性洗脱实验中，蛋白裂解液与1mm补骨脂宁混合，4℃孵育2h后，再与besds混合孵育；
8)结合至beads上的蛋白利用质谱进行鉴定。
2、补骨脂宁与hsp90ab1的分子相互作用
2.1重组egfp-hsp90ab1蛋白的纯化制备
1)pet28a-hsp90ab1-egfp扩增并纯化以上质粒备用；
2)单克隆：转化各自质粒于bl-21感受态细胞中，涂板过夜，次日挑取各自转化平板上单克隆接种于含50μg/mlkana的4mllb培养基中，220rpm，37℃振摇过夜；
3)扩增：次日按1:100接种于50μg/mlkan的500mllb培养基中，220rpm，37℃振摇培养约2-4h，待菌体od600值达到0.6左右为止；
4)鉴定：取出1ml培养物，室温12000g离心2min，弃上清，100μl上样缓冲液重悬菌体沉淀；
5)诱导表达：加入乳糖至终浓度0.8g/l，220rpm，22℃振摇培养过夜，诱导蛋白表达；
6)鉴定：取出1ml培养物，室温12000g离心2min，弃上清，100μl上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4℃，4000g离心12min，弃上清，沉淀置-20℃冻存；
7)裂解细胞：用400μlni-idabinding-buffer(20mmtris-hcl，10mm咪唑，0.5mnacl，ph8.0)将菌体重悬，冰浴中超声破碎，条件为功率100w，工作5s，间歇7s，共25min，破碎液4℃，12000g离心20min，取10μl上清液加入等量的2x上样缓冲液，沉淀用400μl1x上样缓冲液重悬后取5μl，恒压150v进行12％sds-page，考马斯亮蓝r250染色显带；
8)蛋白纯化：利用biologiclp层析系统，破碎上清液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharose-cl-6b亲和层析柱。用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值达到基线。分别用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑及50mm咪唑，0.5mnacl，ph8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值达到基线。以ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.5mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，最后进行sds-page分析。
2.2微量热泳动(mst)实验
1)标记蛋白分子准备：上述重组egfp-hsp90ab1蛋白即可作为mst标记蛋白大分子用于实验，将标记大分子蛋白溶液稀释到适合与互作仪检测的浓度范围；
2)无标记小分子准备：选用阳性hsp90抑制剂17-aag作为阳性化合物，补骨脂宁及其衍生物(compounda和neobavaisoflavone)用dmso稀释到10mm作为储备液。利用软件预测kd值，以mst缓冲液作为溶剂，配置工作液最高浓度(此浓度不超过kd值20倍)，往后以此两倍梯度稀释，配置成16个梯度浓度的工作液(10μl)；
3)大分子与小分子结合：向以上工作液中加入10μl标记的大分子溶液，用移液枪在dof管中轻轻混匀，避光孵育5min；
4)上样：达到反应时间后，将monolithnt毛细管直接插入到反应管dof管中，吸取样品。此时，不要接触到玻璃管的中间部位，按照顺序依次将毛细管放入样品托盘槽中；
5)检测：设置好nt控制软件中参数，开始进行检测，检测完毕后通过仪器自带软件进行分析，拟合并计算解离常数。
3、化合物对hsp90ab1下游蛋白表达的抑制作用
3.1细胞总蛋白提取
1)细胞点板过夜，待细胞密度达到70-80％时，胰岛素(insulin)预处理2h,之后给予不同浓度补骨脂宁作用2h或者给予3μg/ml的补骨脂宁作用不同时间后，弃掉细胞培养基，pbs缓冲液清洗细胞3次；
2)用0.5ml胰酶消化2min后，完全培养基1ml终止消化，收集细胞于dof管中，1000g，4℃，离心5min；
3)弃去培养基，得到细胞沉淀，每一dof管中加入200μl的ripa裂解液(已加入磷酸化酶抑制剂和总蛋白酶抑制剂)充分混悬后，冰上裂解10-30min，以12000g，4℃条件离心5min；
4)收集上清，即得蛋白溶液，bca法测定蛋白样品浓度，剩余样品-80℃冻存备用，或直接加入5×sds-page上样缓冲液，并吹打均匀，95℃金属浴中10min，使蛋白充分变性，westernblot备用。
3.2bca法检测蛋白浓度
1)反应液准备：以每孔0.5ml溶液a和0.0lml溶液b用量，准备足量反应混合液；
2)点样：取2μl蛋白溶液于96孔板中，用三蒸水稀释至20μl，每个样品设置三个复孔，设置不同浓度的蛋白标准品；
3)化学反应：每孔加入200μl的反应混合液，60℃孵箱中孵育30min；
4)检测：达到作用时间后，使用酶标仪，于570nm波长处检测吸光度值；
5)计算蛋白浓度：根据标准品的浓度和相应的吸光度值绘制出标准曲线，再计算待测样品的蛋白浓度。
3.3westernblot实验
1)凝胶制备：清洗玻璃板晾干后备用。按表1和表2，根据目的蛋白分子量不同，制备适合分离目的蛋白的分离胶。在分离胶中加入temed后立即摇匀立即灌胶，液封分离胶，室温静止30min。此时，可按照表3配置浓缩胶，达到时间后，弃去上层水，加入配置好的浓缩液，快速插入梳子，室温静止15min，拔出梳子后即可用于后续实验；
2)电泳：取高温变性后的蛋白样品，每孔加入蛋白总量约为40μg进行上样，随后加入电泳液后电泳分离蛋白，电泳条件为80v，30min；120v，60min；
3)转膜：电泳结束后，轻轻撬开玻璃板，去除浓缩胶，留下分离胶后，以三明治的形式按照“滤纸-nc膜-分离胶-滤纸”顺序夹紧，再插入湿转架上，灌入足够量湿转液，即可开始湿转。注意分离胶与nc膜之间不能有气泡产生，电源接入注意正负极区分，转膜条件一般为恒流320ma，1-2h，可根据目的蛋白分子量不同调整转膜时间。
4)封闭：转膜结束后，打开夹子，弃去分离胶，取出nc膜，将其放入5％新配置的脱脂奶粉溶液中，置于平行摇床上室温封闭1h；
5)一抗孵育：封闭结束后，按照目的蛋白不同分子量剪切目的条带，注意一般一张膜尽量只剪切一个目的蛋白。tbst缓冲液摇床上洗3次，每次10min。按照抗体说明书稀释比例稀释抗体，将目的条带放于对应抗体稀释液的抗体孵育盒中，4℃孵育过夜；
6)二抗孵育：次日，取出目的蛋白条带，用tbst蛋白缓冲液摇床清洗3次，每次10min。按照一抗种属来源选择二抗。将目的条带放入对应的二抗稀释液中，摇床上缓慢摇动孵育1h；
7)显影：二抗孵育结束后，用tbst溶液洗涤目的蛋白条带3次，每次10min。同时，配置ecl化学发光液，将洗涤完毕的目的蛋白条带放入凝胶成像仪中，在避光条件下，加入发光液于条带表明，使所有发光液能均匀分散，孵育1min后，调整好显影仪进行曝光成像。
表1不同浓度分离胶的最佳分离范围
表2分离胶配制方法
表35％浓缩胶配置方法
三、实验结果
1、光亲和标记技术法pulldown靶蛋白
为了鉴别前期发现的补骨脂活性成分补骨脂宁的作用靶标，阐明补骨脂宁是如何抑制srebps的转录活性，并为后期结构优化等工作提供依据。本课题组通过光亲和标记技术，将补骨脂宁连接到磁珠上(补骨脂宁-beads)，与肝脏匀浆孵育，用离心的方法将与compounda-beads结合的蛋白分离出来，洗脱后经蛋白质谱鉴定。另外，通过加入compounda作为竞争剂，与compounda-beads竞争结合靶蛋白，这样，compounda-beads结合的蛋白大多为非特异结合的背景，通过对比，我们成功鉴定出补骨脂中活性成分补骨脂宁的作用靶点为hsp90ab1。
2、化合物补骨脂宁与hsp90ab1的分子相互作用
利用微量热涌动(mst)技术检测大分子蛋白质与小分子化合物之间的相互作用。我们使用hsp90的经典抑制剂17-aag作为本实验的阳性化合物，通过分子克隆实验重组并纯化得到egfp-hsp90ab1蛋白。egfp-hsp90ab1可与17-agg发生相互作用，并且通过模拟计算出其结合解离常数kd为266.09±65.76nm(图1)，这一数据与以往文献报道的数值接近。因此，我们认为此评价系统可靠。然后，我们利用此系统考察重组蛋白egfp-hsp90ab1与补骨脂宁之间相互作用，结果与17-aag类似，补骨脂宁同样可以与egfp-hsp90ab1蛋白发生相互作用，且其结合解离常数为24.65±10.16nm(图2)，这一数值比17-aag的解离常数低了10倍以上。说明补骨脂宁可与hsp90ab1相互结合且结合能力比阳性化合物17-aag强10倍。
在明确补骨脂宁与hsp90ab1结合的结合位点后，我们进一步分析补骨脂宁构效关系。首先，基于补骨脂宁的化学结构，对其酚羟基进行修饰转变成为甲氧基，并将此化合物命名为compounda。通过mst实验发现compounda几乎不能与hsp90ab1结合(图3)，表明补骨脂宁酚羟基的重要性。而修饰后的另一个化合物neobavaisoflavone仍可与hsp90ab1结合，其解离常数为37.24±47.84nm(图4)。
3、化合物补骨脂宁对hsp90ab1下游蛋白表达的抑制作用
上述试验证明补骨脂宁可以与hsp90ab1有效结合。为了确定补骨脂宁与hsp90ab1结合后对hsp90ab1是否是抑制作用，课题组测定了补骨脂宁干预对hsp90ab1下游客户蛋白akt的影响。如果补骨脂宁与hsp90ab1结合后对hsp90ab1是抑制作用，则必然会导致其下游客户蛋白akt不稳定，其磷酸化akt会被去磷酸化，进而p-akt减少。westernblot结果如图5、6所示，补骨脂宁干预后细胞中p-akt显著降低，且呈时间-剂量依赖性。
综上可见，补骨脂宁为hsp90ab1的有效抑制剂，可以用于制备抑制hsp90ab1的药物制剂。该药物制剂含有补骨脂宁或其药用盐或其前药，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。