本发明属于食源性益生菌的研究领域，涉及食源性益生菌的特异性荧光标记方法及其体内应用。
背景技术：
益生菌，是肠道微生物菌群的重要部分，当它摄入足够的数量时，会给消费者(宿主)健康带来极大的益处。益生菌可极大的促进人体肠道健康，调节人体的免疫应答。尽管对人体健康具有极大的益处和特殊的功能，但体内与益生菌相关的代谢，分布和免疫调节还尚不十分明确，对大多数新物种的功能和活性作用仍然不够明了，需要获取更多的信息进行评估。
目前现代分子生物学技术如聚合酶链反应与变性梯度凝胶电泳(pcr-dgge)，实时定量pcr，dna微阵列，焦磷酸测序和高通量测序等各种方法确定生物样品的dna序列，揭示益生菌的类型，分布和代谢。然而，上述技术通常需要收集大量样本(粪便或体内组织)，设计探针/引物、对大量的数据进行统计分析，耗时耗力。此外，这些方法不能够进行原位检测，几乎无法通过非破坏性和实时原位监测对生物体内益生菌分布状况进行真实再现。因此，亟需建立一种能够快速、直观且具有非破坏性的实时原位监测技术，为益生菌在体内的分布及功能位点探究提供技术支撑。
针对以上研究方法需求和领域空白，我们引入了荧光成像技术。荧光成像作为探索肿瘤早期诊断治疗的关键技术，是现今生物医学领域和现代分析科学中的前沿方法，尤其是采用无创成像和微创体内生物成像在活体水平上非侵入式监测肿瘤的发生发展，对于癌症的预防和早期诊疗具有重要的生命医学研究意义和临床应用价值。将这种无创成像技术应用到食源性微生物体内研究中，可以充分发挥荧光成像实时无损监测的优势，进而可以系统性的研究益生菌进入生物体后的分布状况和代谢行为。
荧光成像的影像效果依赖于造影剂(即荧光探针)的发光性能和靶向功能化。现代生物成像中的光学检测要求(1)荧光探针的工作区域为生物透过窗口(700-1000nm和1100-1350nm)的近红外光区工作以便增加检测光的深组织透过率；(2)荧光探针的激发光不宜采用紫外光和可见光，以避免组织的自体荧光；(3)荧光探针的激发光强度不宜太强，以便降低背景信号，增大成像的信噪比；(4)能够提供实时、整体、分布式的观测结果。荧光纳米探针不同于小分子成像造影剂或药物，它不仅可以克服常规临床肿瘤诊断技术存在的空间分辨率低、组织对比度低、准确性差、容易漏误诊等问题，还可以解决癌症治疗方法中化学疗法存在的血液循环时间短、治疗效率低、缺乏专一性、损害人体正常细胞等问题。近几年来基于不同的光物理化学性能，研究者逐渐提出了几种不同的荧光探针，包括：荧光编码蛋白、有机染料、半导体量子点、贵金属纳米粒子、碳纳米材料以及上转换发光材料。然而这些材料都在不同程度上有着各自的缺陷，例如信噪比差、缺乏光学稳定性、光漂白、相干光激发、发光强度不稳定等。
长余辉纳米发光材料(persistentluminescentnanophosphors，plnps)是一种被高能激发(可见光、紫外光、x射线、γ射线、电子束等)后可产生可见或者近红外区域长时间发光的特殊纳米材料。相比于传统的纳米发光材料，plnps作为生物成像造影剂具备以下优点：(1)长余辉发光纳米材料毒性较低，表面修饰之后更适用于活体生物的体内研究；(2)长余辉纳米材料的光化学稳定性较好，可以避免光漂白现象的发生；(3)长余辉纳米材料可以体外激发进行光学成像，这样可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响；(4)长余辉纳米材料的发光可以通过改变合成条件和元素组成调控至近红外区域，能够增加检测光的生物组织穿透，提高光学成像的灵敏度。纵观所有潜在的荧光探针，只有近红外长余辉发光材料能够很好的满足现代光学生物成像的需要。因此，借助长余辉纳米探针对益生菌进行荧光标记，即可通过生物成像实现对益生菌在生物体内的代谢分布状况进行实时监控，为食品营养与健康研究开拓新的研究理念。
技术实现要素：
通过光学生物成像技术将具有近红外(nir)发光的cr3+掺杂的镓锗酸锌长余辉纳米粒子(zggoplnps)作为光学探针引入食源性益生菌在生物体内分布的研究中。采用的cr3+掺杂的镓锗酸锌长余辉纳米粒子具有优异的余辉性能、低毒、良好的分散性、光学稳定性和生物相容性，能够作为一种示踪剂通过抗体(革兰氏阳性菌lta抗体)对目标益生菌进行标记，标记后菌体的活力仍能够保持在80％以上，达到对益生菌的长期可视化监测。通过口服进入小鼠体内后，借助长余辉体外激发的光学生物成像技术，实时的研究标记后菌体在机体胃肠道内的吸收和分布状况。lta抗体功能化的zggo:cr3+纳米探针能够有效且成功的标记益生菌，并用于实时的、非损伤的监测摄入有机体的益生菌的生物分布状况。
本发明提供的具体技术方案是：
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法，包括如下步骤：
(a)通过溶剂热-高温煅烧法，制备具备近红外荧光和超长余辉性质的cr3+掺杂的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针；
(b)通过抗体表面功能化，实现对于目标益生菌的特异性荧光标记。
进一步，所述步骤(a)制备cr3+掺杂的镓锗酸锌长余辉纳米探针的过程如下：
(1)将金属离子溶液按照一定比例混合并调节ph使其发生共沉淀反应从而得到反应液；
(2)将步骤(1)所制备的反应液在聚四氟乙烯反应釜中进行溶剂热反应；
(3)将步骤(2)中产物离心洗涤并使用玛瑙研钵粗研后在马弗炉中煅烧；
(4)将步骤(3)所制得的固体粉末研磨并离心筛选得到粒径均一的长余辉纳米探针。
进一步，所述步骤(1)各金属元素比例按照纳米材料的化学结构式配制zn1.25ga1.5ge0.25o4:0.5％cr3+，溶剂为2ml油酸和15ml甲苯，ph调节使用叔丁胺，最终ph为7.5。zn1.25ga1.5ge0.25o4:0.5％cr3+这个比例得到的材料，其发光性质更适合用于生物体内研究。有机溶剂为首次使用，可以改善纳米材料的分散性；使用叔丁胺调节ph，也是独特，更加温和，不影响其他成分的性质。
进一步，所述步骤(2)在聚四氟乙烯反应釜中溶剂热反应温度为120℃，反应时间为24小时。
进一步，所述步骤(3)在马弗炉中煅烧温度为750℃，反应时间为5小时。
进一步，所述步骤(b)通过抗体表面功能化标记益生菌的过程如下：
(1)将步骤(a)得到的cr3+掺杂的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针分散到2mln,n-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌30分钟；
(2)将3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)加入到步骤(1)的溶液里，磁力搅拌8小时；
(3)将步骤(2)得到溶液离心去除未反应的3-氨丙基三乙氧基硅烷，然后加入抗体和催化剂，室温避光振摇30分钟，离心洗涤；
(4)将步骤(3)得到溶液与目标益生菌液混合，孵育。
进一步，所述步骤(2)中3-氨丙基三乙氧基硅烷使用量为20μl。
进一步，所述步骤(3)中所使用的抗体为革兰氏阳性菌lta抗体，将1mg抗体溶解于10mlpbs(0.1m，ph7.4))进行修饰，修饰方法为edc-nhs催化羧氨反应，edc-nhs作为催化剂。
进一步，所述步骤(4)中孵育条件为37℃下轻摇孵育1小时。
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法的体内应用，通过口服进入生物体内，借助长余辉纳米探针体外激发的光学生物成像技术，实时监控益生菌在体内的代谢分布过程。
本发明的应用为通过口服进入生物体内，借助长余辉体外激发的光学生物成像技术，实时监控益生菌在体内的代谢分布过程。
常规的荧光标记材料，比如有机染料、荧光蛋白、半导体量子点等，分别存在荧光稳定性差、荧光生物成像信噪比低、毒性高等缺陷，其应用性受限。本发明所制备的近红外长余辉纳米材料，具有发光效率高、荧光寿命长、毒性较低、光化学稳定性好、合成可控等优势，并且可体外激发进行光学成像，可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响，提高光学成像的灵敏度，因此非常适合用于益生菌的荧光标记，从而进一步实现益生菌在生物体内行为的实时监控和探究。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所制备的镓锗酸锌长余辉纳米探针具有超强近红外发光和超长余辉寿命、优异的生物相容性和结构稳定性、良好的粒径均一度和低毒性，适合通过表面抗体修饰特异性标记目标益生菌。
(2)本发明所开发的近红外荧光标记益生菌体内生物成像技术，可实现无损可视化地示踪益生菌体进入生物体后的分布状况，对于开辟创新型的食源性益生菌的功能位点及营养学研究理念具有重要意义。
附图说明：
图1：镓锗酸锌长余辉纳米探针的透射电镜图
图2：镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的生物相容性
图3：镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的低毒性：(a)细胞毒性；
图4：镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的低毒性：(b)活体毒性
图5：荧光标记益生菌的透射电镜图
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法
(1)通过溶剂热-高温煅烧法，制备具备近红外荧光和超长余辉性质的cr3+
掺杂的镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针。
准确称取0.013mmolcr(no3)3·9h2o和3.01mmolzn(no3)2·6h2o均匀溶解在10ml配置好的0.6moll-1ga(no3)3溶液中磁力搅拌，使其混合均匀，用叔丁胺调ph至7.5进行共沉淀，继续磁力搅拌2h，超声处理30min使其混合均匀，将形成的白色乳浊液置于聚四氟乙烯反应釜中120℃水热反应24h。取出待自然冷却至室温后，加入2倍体积乙醇中，混合均匀，产生沉淀，7000rpm10min离心收取沉淀物并用无水乙醇洗涤2-3次。离心好的沉淀置于80℃真空干燥箱中干燥3h后，使用玛瑙研钵粗研后，放于马弗炉中750℃煅烧5h。制备好的长余辉纳米探针材料，用乙醇湿研2～3遍，重新悬浮于5mmoll-1的naoh溶液中，并磁力搅拌过夜。4500rmp离心7min取上层浑浊液后再用3500rmp离心15min取上层液体，将获得的上层液体冷冻干燥最终获得粒径为30～80nm的长余辉纳米探针材料。
(2)通过抗体表面功能化，实现对于目标益生菌的特异性荧光标记。
准确称取5mg步骤(1)所得到的长余辉纳米探针，将其超声重悬于2mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后逐滴加入20μl3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，将反应液在80℃下剧烈搅拌24h以形成表面氨基化的plnps(nh2-zggo)。将1mg抗体溶解于10mlpbs(0.1m，ph7.4)中，然后加入nhs(15mg)和edc(15mg)。将上述混合物在室温下温育30min以完全活化抗体上的羧基。通过向10mlpbs(0.1m，ph7.4)缓冲液中加入10mg经超声分散的nh2-zggoplnps悬浮液中。将上述两种溶液混合，于室温条件下避光轻摇孵育4h后，将所得混合产物(抗体-zggo)在4℃下7000rpm离心5min，后用pbs缓冲液洗涤两次，得到抗体修饰的zggo荧光探针。向其中加入干酪乳杆菌，在37℃下轻摇孵育1h，完成荧光标记。
实施例2
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为乳双歧杆菌v9，相应得到荧光标记的乳双歧杆菌v9。
实施例3
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为罗伊氏乳杆菌，相应得到荧光标记的罗伊氏乳杆菌。
实施例4
一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法，步骤和方法与实施例1基本相同，不同之处在于益生菌为嗜酸乳杆菌，相应得到荧光标记的嗜酸乳杆菌。
图1为镓锗酸锌长余辉纳米粒子的透射电镜图，表明制备的荧光纳米探针具有良好的粒径均一度，尺寸在50nm左右，适合用于生物标记。
图2为镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的生物相容性考察，常见的生物大分子对其荧光性质均没有显著的影响，表明制备的荧光纳米探针具有良好的生物相容性，适合用于活体成像研究。
图3为镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针的毒性考察，纳米探针对三种细胞株均没有明显的毒性，通过小鼠对照组和实验组体重监控，证明探针也不具有显著的生物毒性，最终表明纳米探针毒性较低。
图4为荧光标记益生菌的透射电镜图，表明经过抗体修饰和抗体表面结合，纳米探针成功标记到菌体表面。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。