本发明属基因工程领域，涉及腺相关病毒aav9及其在制药中的用途，具体涉及一种腺相关病毒aav9及其在制备治疗戈谢氏病的制剂中的用途，本发明中通过9型腺相关病毒aav9干预，表达野生型β-葡糖脑苷脂酶基因（gba），能补充患者有缺陷的gba，进一步用于治疗戈谢氏病。
背景技术：
：现有技术公开了戈谢氏病（gaucher'sdisease，gd）是一种常染色体隐性遗传性疾病，其病因为β-葡糖脑苷脂酶（β-glucocerebrosidase，gba）基因突变导致所编码的gba酶活性降低，致使葡糖脑苷脂不能被水解而聚积在网状内皮细胞的溶酶体中，形成典型的戈谢氏细胞。临床研究显示，患者表现出中枢神经系统（cns）损伤、生长发育迟滞、肝脾肿大、骨损害、血细胞减少等一系列临床症状。gba含497个氨基酸残基，其编码基因gba位于人染色体1q21-22，长7.2kb，由11个外显子和10个内含子构成。目前已发现gba有300多种变异，包括点突变、缺失、插入、剪切位点突变、编码框移动性突变和重组等位基因等。戈谢氏病分为3种类型：gdi型(慢性型)、gdii型(急性神经型)和gdiii型(亚急性神经型)。gdi型在儿童与成人均可发病，起病缓慢，病程长，无神经系统受累症状。gdii型多在1岁以内发病，发病越早病情进展越快，往往在2岁前死亡，以神经系统症状为主。gdiii型起病较ii型缓慢，有进行性痴呆、肌阵挛和核上性眼肌麻痹，伴有肝、脾肿大、骨损伤和再生障碍性贫血等。目前，对戈谢氏病最有效的治疗方法是酶替换疗法（enzymereplacementtherapy,ert）。临床实践显示，重组gba（rgba)治疗gdⅰ型效果明显，而对gdii型和ⅲ型的脑损伤无效，究其原因是rgba难以穿越血脑屏障，此疗法治疗费用昂贵，每年近200万元人民币，而且部分使用者产生igg抗体（约15％）或过敏反应（3-4％），所述这些弊端使得ert的应用受到了极大限制，虽然骨髓移植在一些无神经症状的戈谢氏病患者治疗中获得一些进展，但由于风险大，寻找合适供体困难，通常难以实施，且同样对于神经系统的症状无明显改善疗效。早在20世纪70年代,吴旻院士就对遗传性疾病等的防治提出了基因治疗的设想，直到1990年，第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床，自此以后基因治疗作为一种新兴的医疗手段日益引起人们重视，为人类疾病治疗开辟了一条新的途径，尤其是在一些目前传统医疗手段难以治疗的疾病方面显示出巨大的应用潜力，如糖尿病、心血管病、癌症和艾滋病等。基因治疗的载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用，其中腺相关病毒（aav）载体具有低致病性、对宿主免疫原性弱、长期稳定表达、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点，是目前发展最热，也是最有希望的载体之一，已被广泛应用于临床研究。根据血清型的不同，目前常用的腺相关病毒可分为6型：aav1,aav2,aav5,aav6,aav8,aav9；不同血清型对不同器官的亲和力不同，如表1所示，其中aav9对皮质神经元的感染效果最好，并且可以穿越血脑屏障。takashihirai等人曾利用aav9表达shrna用于治疗神经性疼痛。目前在全世界范围内尚未见有利用腺相关病毒aav9干预用于治疗戈谢氏病的先例与方法；基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供腺相关病毒aav9及其在制药中的用途，尤其是腺相关病毒aav9在制备治疗戈谢氏病的制剂中的用途。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供腺相关病毒aav9及其在制药中的用途，尤其是腺相关病毒aav9在制备治疗戈谢氏病的制剂中的用途。本发明中通过9型腺相关病毒aav9干预，表达野生型β-葡糖脑苷脂酶基因（gba），能补充患者有缺陷的gba，进一步用于治疗戈谢氏病。本发明为了解决以上问题，提供如下技术方案：一、构建paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体：本发明选用的腺相关病毒载体为aov-021（paav-cmv-mcs-3flag），构建的该载体，其包含了cmv启动子和3个flag标签，含有氨苄抗性基因，此载体通过限制性内切酶nhe1和bamh1双酶切，通过t4连接酶连接入带有nhei和bamhi两个限制性内切酶粘性末端的gba基因，测序结果显示成功构建出了paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体；本发明中，构建的paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体，包括cmv启动子，该启动子控制着整个病毒重组质粒的表达；小鼠的gba基因，该基因能够弥补疾病模型小鼠中缺失的gba；氨苄抗性基因，该抗性基因能够有利于阳性克隆质粒的筛选；3个flag标签能够显示出整个重组质粒的定位和表达；二、建立成年小鼠全身性诱导型戈谢氏病模型：本发明构建成年小鼠的全身诱导型戈谢氏病模型作为实验研究对象，采用gba-flox/wt小鼠（从瑞典lund大学干细胞研究中心stefankarlsson实验室引进），该小鼠与tamoxifen（他莫昔酚，一种雌激素受体调节剂）诱导型cre表达小鼠（ubc-creer2t）杂交，获得gba-flox/wt；ubc-creer2t小鼠，再将此种小鼠杂交建立gba-flox/flox；ubc-creer2t小鼠；此模型小鼠的gba的第8号内含子和第11号内含子均带有能被cre重组酶识别并重组的loxp位点和能被tamoxifen诱导激活的ubc-creer2t重组酶，待小鼠成长至成年后，通过腹腔注射tamoxifen诱导gba全身性的下调直至完全敲除；其特点为：在tamoxifen对此小鼠模型诱导之前小鼠不发病，因此可以通过给药时间有效控制小鼠发病的起始时间；诱导后小鼠全身细胞gba敲除，可更好的模拟临床患者的全身的基因型；当小鼠成年后，给此疾病模型小鼠腹腔注射tamoxifen可诱导ubc-creer2t重组酶的全身性激活，导致雄性小鼠在诱导第7天发病，第11天死亡；三、腺相关病毒aav9干预实验通过paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体成功包装出滴度为1.91×1013vp的aav9型病毒；其能特异地表达出具有完整功能的gba；基于aav病毒注射入体内10天以后才开始表达和本实验小鼠模型的治疗窗口期，其治疗探索在诱导前10天给gba-flox/flox；ubc-creer2t雄性小鼠尾静脉注射包装的aav9，注射剂量为3×1011vp，注射后第10天，给予此小鼠模型腹腔注射tamoxifen诱导gba的全身性敲除，观察实验组和对照组小鼠的发病时间、发病情况和存活周期，结果显示，腺相关病毒aav9介导的基因干预对戈谢氏病具有治疗效果。与现有的干预方法相比，本发明的有益效果是：本发明构建了paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体，其中整合入了gba基因（ncbi基因号：nm_001077411.2，）包装了腺相关病毒aav9，建立了成年小鼠全身性诱导型戈谢氏病模型，通过腺相关病毒aav9对戈谢氏实验模型进行干预，能表达野生型β-葡糖脑苷脂酶基因（gba），补充患者有缺陷的gba，本发明的干预治疗周期短，治疗效果明显，所需费用仅为酶替代疗法高昂的治疗费用的几百分之一，且本发明对i型、ii型和iii型戈谢氏病均适用。本发明相较于骨髓移植风险小、治疗所需腺相关病毒相较于骨髓供体更加易获得。本发明的重组质粒包装的腺相关病毒aav9适用于制备治疗戈谢氏病的制剂。附图说明图1为本发明用于包装病毒的paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒载体图谱：该质粒包含了cmv启动子和3个flag标签，含有氨苄抗性基因。图2为paav-cmv-mcs-3flag质粒载体通过限制性内切酶nhei和bamhi双酶切后凝胶电泳和提取小鼠组织dna后pcr出带有nhei和bamhi这两个限制性内切酶粘性末端的gba基因凝胶电泳。图3为免疫荧光检测paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒在sh-sy5y细胞中的转染效率：蓝色的dapi为染核染料，可以定位细胞核所在的位置；绿色的flag抗体可以显示paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒被转染进入的位置；merge证明了paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒被转染进入了sh-sy5y细胞核内。图4为本发明构建成年小鼠全身性诱导型戈谢氏病模型时的小鼠杂交策略，图中三角形符号代表插入的loxp位点。图5为gba-flox/flox，ubc-creer2t小鼠的鼠尾基因型pcr鉴定：gba-wt/wt野生型鼠只有一条大小为350bp的flox带，无ubc-creer2t带；gba-flox/wt杂合型鼠有大小为475bp和350bp的两条flox带，无ubc-creer2t带；gba-flox/flox；ubc-creer2t型鼠含有大小为475bp的flox带和大小为350bp的ubc-creer2t带各一条。图6为ubc-ert-cre对loxp位点敲除效率的检测:gba基因的8到11号外显子未被ubc-creer2t环化缺失时，应该pcr出1225bp大小的条带，如果被环化缺失掉，则应pcr出大小约400bp左右的条带。具体实施方式实施施1构建paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体对paav-cmv-mcs-3flag载体通过限制性内切酶nhei和bamhi双酶切，酶切后pcr电泳并通过胶回收试剂盒（axygen）回收目的片段，并通过提取小鼠组织dna后pcr（pcr反应体系和温度体系如上）出带有nhei和bamhi两个限制性内切酶粘性末端的gba基因（如图2所示），其引物为：mgba-nhei-cf：cggctagcatggctgccaggctcatcgg，mgba-nhei-cr：agagatctctggcgacgccacaggtaag，表1酶切反应体系：试剂体积bamhⅰ1ulnhei1ulbamhⅰbuffer5ulpaav-cmv-mcs-3flag(1ug)5ulddh2o38ul通过t4连接酶室温连接2小时后转化入大肠杆菌dh5α感受态中，然后均匀涂布到带有氨苄抗性的lb平板上，放置于37℃培养箱中过夜，第二天挑出阳性克隆菌于5ml带氨苄抗性的液体lb培养基中37℃250rmp摇晃过夜，再通过质粒提取试剂盒（axygen）提取质粒，并测序，测序结果正确，证明成功构建了paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒表达载体（如图1所示），再将paav-cmv-gba-mcs-3flag重组质粒通过lpei瞬转入293t细胞中，48h后取出并通过免疫荧光对flag染色检测此质粒的转染效率（如图3所示）。表2连接反应体系：试剂体积t4buffer1ulpaav-cmv-gba-mcs-3flag3ulgba9ult4ligase2ulpeg2ulddh2o3ul实施施2构建稳定性良好的全身性诱导型戈谢氏病成年小鼠模型1）获得gba-flox/flox；ubc-creer2t小鼠本发明采用gba-flox/wt小鼠和ubc-creer2t小鼠进行合笼杂交(如图4所示)，对其后代小鼠剪尾提取鼠尾dna，鉴定后代基因型，获得gba-flox/wt；ubc-creer2t小鼠，将此种小鼠进行合笼杂交，对其后代小鼠剪尾提取鼠尾dna，鉴定后代基因型，获得gba-flox/flox；ubc-creer2t小鼠（如图5所示），其鉴定引物为：ubc-creer2t-cf:tgcctgcattaccggtcgatgc,ubc-creer2t-cr:ccatgagtgaacgaacctggtcg；flox-cf：acagcatcattacggtgagc，flox-cr：tccctagaaaagacagtcaagga。表3鼠尾鉴定pcr反应体系：试剂体积10×taqasebuffer2uldntp2uldna2ul5＇端引物（cf）1ul3＇端引物（cr）1ultaqase0.3ulddh2o11.7ul表4鼠尾鉴定pcr温度体系:2）tamoxifen腹腔注射gba-flox/flox；ubc-creer2t小鼠，诱导gba基因全身性敲除，建立戈谢氏病小鼠模型取两窝8周龄小鼠，基因型分别为gba-flox/flox；ubc-creer2t和gba-wt/wt；ubc-creer2t腹腔注射tamoxifen（溶解于玉米油，浓度为20mg/ml，注射剂量为0.5um/g），小鼠注射强度为：连续5天，诱导gba基因全身性的敲除，结果显示，雌鼠没有表型，而雄鼠在腹腔注射tamoxifen7天后出现皮肤溃烂，颈部张力亢进，进食困难，小鼠体重逐渐减轻，且在11天后死亡，小鼠的表现符合戈谢氏疾病的表型，在实验组小鼠死亡后，即取两组小鼠各脏器组织提取dna，针对gba的基因序列设计引物cre-effect-cf：tcgagggatgcagtacagtc，cre-effect-ct：ctgctcaggtgtcagttcca做pcr检测ubc-ert-cre对gba基因中loxp位点的敲除效率（如图6所示），pcr反应体系和温度体系如上表所述。实施施3腺相关病毒aav9干预实验本发明进行了腺相关病毒aav9干预实验，探讨腺相关病毒aav9介导的基因干预对戈谢氏病的效果，基于aav病毒注射干预10天以后开始表达和本实验小鼠模型的治疗窗口期，本实施例中诱导前第10天对小鼠进行尾静脉注人腺相关病毒aav9，注射剂量：3×1011vp。其分组情况为（每组8只）：a.空白组：等体积注射1×pbs；b.对照组：注射等体积对照病毒；c.静脉注射组。tamoxifen诱导后，病毒对照组小鼠第5天开始发病，空白组小鼠第7天开始发病，实验组（静脉注射组）小鼠状态良好；实验结果表明：腺相关病毒aav9对tamoxifen诱导后的全身诱导型戈谢氏病成年小鼠模型具有较好干预效果。sequencelisting<110>复旦大学<120>腺相关病毒aav9及其在制备治疗戈谢氏病的制剂中的用途<130>20170306<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>28<212>dna<213>mgba-nhei-cf<400>1cggctagcatggctgccaggctcatcgg28<210>2<211>28<212>dna<213>mgba-nhei-cr<400>2agagatctctggcgacgccacaggtaag28<210>3<211>22<212>dna<213>ubc-creer2t-cf<400>3tgcctgcattaccggtcgatgc22<210>4<211>23<212>dna<213>ubc-creer2t-cr<400>4ccatgagtgaacgaacctggtcg23<210>5<211>20<212>dna<213>flox-cf<400>5acagcatcattacggtgagc20<210>6<211>23<212>dna<213>flox-cr<400>6tccctagaaaagacagtcaagga23<210>7<211>20<212>dna<213>cre-effect-cf<400>7tcgagggatgcagtacagtc20<210>8<211>20<212>dna<213>cre-effect-ct<400>8ctgctcaggtgtcagttcca20当前第1页12