本发明涉及药物制剂技术领域，具体来说，涉及一种叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米制剂及其制备方法。
背景技术：
索拉菲尼(sorafenib,srf)是一种多靶点多激酶抑制剂，是临床上治疗晚期肝癌的一线药物，具有明显的抗肿瘤活性。其作用机制是一方面通过抑制受体酪氨酸激酶kit和flt-3以及raf/mek/erk途径中丝氨酸/苏氨酸激酶，抑制肿瘤细胞的增殖；另一方面通过抑制上游酪氨酸激酶vegfr和pdgfr和下游raf/mek/erk途径中丝氨酸/苏氨酸激酶，明显抑制肿瘤血管生成；从而达到双重抗肿瘤作用。但其低口服生物利用度和不良反应大大限制了它的临床应用。因此，急需开发一种新型有效的靶向给药系统，增加肝肿瘤部位的药物浓度，降低药物对正常组织细胞的作用，从而提高药物的抗肿瘤疗效。
纳米粒是现代药剂学研究的热点，药物被分散、包封、吸附于聚合物粒子上，通过囊壁沥滤、渗透和扩散释放出来，也可通过基质本身的溶蚀释药。具有靶向性、缓释性、改变药物的给药途径、增加药物的吸收和生物利用度、增加难溶性药物的溶解度、提高药物稳定性以及降低不良反应等优点。为了提高srf的口服生物利用度并减少副作用，目前国内外已有研究人员对索拉菲尼纳米粒进行过研究。wangetal.利用二氧化硅350及ph敏感的丙烯酸树脂s100制得负载srf的纳米微粒，并比较了用二氧化硅350制备的纳米粒、用丙烯酸树脂s100制备的纳米粒以及混悬剂的口服生物利用度。结果表明与混悬剂相比，用二氧化硅350制备的纳米粒和用丙烯酸树脂s100制备的纳米粒生物利用度分别提高了50倍和13-33倍。zhangetal.利用脂质包被的纳米钻系统递送srf,结果表明与混悬剂相比生物利用度提高了7.64倍。据guoetal.报道，与混悬剂相比，通过脂质和聚合物包被的纳米基质系统递送srf，其口服生物利用度提高了7.7倍。
自2005年美国fda批准白蛋白结合紫杉醇纳米粒注射混悬液上市以后，白蛋白纳米粒作为靶向药物载体引起了临床关注。白蛋白是一个很有吸引力的大分子载体，因其属于内源性物质，具有可生物降解、无毒、体内降解产物无害、无免疫原性、易于纯化且易溶于水可制成注射剂等优点，已被公认为是一种制备纳米粒的理想载体材料。药物可以通过物理吸附或通过化学共价结合到白蛋白纳米粒表面。此外，白蛋白纳米粒表面的活性基团是进行化学修饰的有效连接部位，各种靶向配体可以与之进行偶联从而使纳米粒多功能化。
叶酸(fa)可由受体介导的内吞途径进入细胞。现己证实在生理状态下,叶酸受体在肺、腺、肾、脉络丛、胎盘中呈低水平表达，而在肿瘤组织中高度表达,其表达水平常是正常组织的100～300倍。由于通过叶酸受体(fr)介导的内吞作用,能有效的将结合fr的叶酸、叶酸偶联物和叶酸拮抗剂摄入细胞，因此叶酸受体成了针对许多实体肿瘤的靶向给药系统的良好靶标。
在先前的报道中，虽然有一些关于如何提高srf口服生物利用度的方法，但由于所选载体都是外源性物质，生物相容性依然有所欠缺，难以应用于临床；此外，作为治疗肝部位肿瘤的药物，目前关于srf主动靶向制剂的研究非常少，大多数研究都属于srf被动靶向制剂研究范畴。尽管lietal.和zhangetal.等人开发出了两种能提高srf的体外抗肿瘤活性的主动靶向制剂，但都是仅仅在细胞水平进行了验证，其体内效果如何并没有进一步研究。
鉴于此，利用简单可行的方法制备叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒具有重大的潜在市场价值，而且对于索拉菲尼的临床应用来说意义巨大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米制剂，使其在治疗肝癌时具有良好的主动靶向性，降低毒副作用。
本发明的技术方案为：一种具有肝肿瘤靶向作用的索拉菲尼纳米制剂，该制剂重量组份：叶酸1～10、索拉菲尼1～10、白蛋白50～200。
一种具有肝肿瘤靶向作用的索拉菲尼纳米制剂，其制备方法步骤：(1)制备索拉菲尼白蛋白纳米粒(参考我们先前的研究：一种高口服生物利用度的索拉菲尼白蛋白纳米制剂及其制备方法、专利号：2017108789870)，包括如下质量百分数的组分：索拉菲尼0.03～0.07％，载体材料0.5～2％，有机溶剂0.025～0.05％，交联剂0.005～0.02％，余量为生理盐水；用0.2mol·l-1naoh调节索拉菲尼白蛋白纳米粒ph至8～12；(2)利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)做催化剂将叶酸(fa)活化制备叶酸活性酯,三者质量比为fa:nhs:edc＝10:5～10:5～10；(3)精密称取适量叶酸活性酯溶于1ml碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，缓慢滴加至索拉菲尼白蛋白纳米粒中，常温避光搅拌反应一段时间后，即得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液，将所得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液置于处理好的分子截留量为3500da的透析袋中，以磷酸盐缓冲液(pbs,ph＝7.4)为透析液透析60小时，每三小时更换一次透析液，以除去未偶联的过量叶酸活性酯。将纯化后的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液加入冻干保护剂冷冻干燥得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒冻干粉。
步骤(1)中索拉菲尼白蛋白纳米粒用0.2mol·l-1naoh调节其ph＝10。
步骤(2)中所述叶酸活性酯的制备是将叶酸溶于二甲亚砜(dmso)中，加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐做催化剂(质量比为叶酸:n-羟基琥珀酰亚胺:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐＝10:9:5)，常温下避光搅拌反应一段时间后,过0.45μm有机滤膜除去不溶性杂质，滤液加入两倍体积的丙酮乙醚混合物(v:v＝30:70)充分搅拌以沉淀fa-nhs，过滤，得黄色沉淀物，沉淀用无水乙醚洗涤三次，真空干燥得浅黄色叶酸活性酯。
步骤(3)中所述叶酸活性酯的质量为1-10mg。
步骤(3)中所述避光搅拌反应时间为2～24h。
步骤(3)中所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒平均粒径为158.00nm、包封率为77.25％、载药量为7.72％。
步骤(3)中所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的叶酸偶联量为62.46±1.98μg叶酸/mg牛血清白蛋白。
本发明的优点在于：本发明所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒大大提高了索拉菲尼的生物利用度。本发明所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒具有明显的主动肝肿瘤靶向性，能将药物递送至靶部位从而降低药物的毒副作用，提高药物疗效。制备工艺非常简单，无特殊的仪器要求，药物负载量高。将叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒冻干后稳定性好，更利于保存，便于工业化生产。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的粒径分布图；
图2是叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的透射电镜图；
图3是叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒(fa-srf-bsanps)及同浓度索拉菲尼混悬剂(suspensions)在大鼠体内的药时曲线；
图4是腹腔给予索拉菲尼溶液剂(srfsolution)、索拉菲尼白蛋白纳米粒(srf-bsanps)以及叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒(fa-srf-bsanps)后裸鼠肝药浓度与血药浓度的比值(a)或瘤药浓度与血药浓度的比值(b)。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明做出详细说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的制备
精密称取50mg牛血清白蛋白溶于10ml生理盐水中配成载体溶液；用0.2mol/l的naoh溶液调节载体溶液的ph至9；精密称取适量索拉菲尼溶于无水乙醇制成质量浓度为12mg/ml索拉菲尼溶液作为油相；常温下将417.0μl油相在500rpm/min的搅拌条件下缓慢加入载体溶液中搅拌1小时，然后滴入200.0μl0.5％戊二醛固化3小时，得到索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液，继续调节索拉菲尼白蛋白纳米粒的ph至10备用；精密称取5mg叶酸活性酯溶于1ml碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，缓慢滴加至ph＝10的索拉菲尼白蛋白纳米粒中，常温避光搅拌反应8小时后，即得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液。
实施例2叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的制备
精密称取50mg牛血清白蛋白溶于10ml生理盐水中配成载体溶液；用0.2mol/l的naoh溶液调节载体溶液的ph至9；精密称取适量索拉菲尼溶于无水乙醇制成质量浓度为12mg/ml索拉菲尼溶液作为油相；常温下将417.0μl油相在500rpm/min的搅拌条件下缓慢加入载体溶液中搅拌1小时，然后滴入200.0μl0.5％戊二醛固化3小时，得到索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液；精密称取3mg叶酸活性酯溶于1ml碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，缓慢滴加至索拉菲尼白蛋白纳米粒中，常温避光搅拌反应4小时后，即得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液。
实施例3叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的制备
精密称取50mg牛血清白蛋白溶于10ml生理盐水中配成载体溶液；用0.2mol/l的naoh溶液调节载体溶液的ph至9；精密称取适量索拉菲尼溶于无水乙醇制成质量浓度为12mg/ml索拉菲尼溶液作为油相；常温下将417.0μl油相在500rpm/min的搅拌条件下缓慢加入载体溶液中搅拌1小时，然后滴入200.0μl0.5％戊二醛固化3小时，得到索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液，继续调节索拉菲尼白蛋白纳米粒的ph至10备用；精密称取7mg叶酸活性酯溶于1ml碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，缓慢滴加至ph＝10的索拉菲尼白蛋白纳米粒中，常温避光搅拌反应12小时后，即得叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液。
实施例4叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的包封率及载药量测定
取实施例1的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒1ml置于离心管中，在15000rpm下离心30min。取上清液，采用hplc-uv测定游离药物的含量。按照下列公式计算纳米粒的包封率和载药量，其测定结果表明所制得的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒平均包封率为77.25％，载药量为7.72％。
包封率＝(w总一w游离)/w总×100％；
载药量＝(w总一w游离)/w载体×100％；
其中，w总是药物的总重量，w游离是未包进纳米粒中的药物的重量，w载体是纳米粒中载体的重量。
实施例5叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒粒径和电位的测定及表面形态的观察
所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的粒径及电位均由南昌大学分析测试中心测定。实施例1所制备的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒粒径分布图如图1所示。通过透射电镜观察到叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒表面近似球形(图2)。
实施例6叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒稳定性的考察
6.1评价指标
1)外观：肉眼观察不同取样点的纳米粒样品，按以下标准进行评价：
a.黄色半透明，无沉淀
b.黄色半透明，有少许絮凝，稍振摇可复原
c.浑浊，有不可逆沉淀
2)包封率：包封率是评价纳米粒质量好坏的重要指标，同时纳米粒贮存过程中易发生渗漏，因此包封率的监测十分必要。
3)粒径：纳米粒子的表面自由能大，贮存过程中，粒子有自发的聚集倾向，使粒径增大。
6.2稳定性加速试验
将新制的叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液置于安瓿瓶中，于25℃避光条件下保存，分别于0，0.5，1，1.5，2月定时取样，按上述稳定性考察项目进行测定。结果表明，叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒混悬液随着放置时间的延长，包封率有所下降，粒径也稍微有些增长。30天内纳米粒基本处于稳定状态，45天后，开始出现少许沉淀，两个月后纳米粒沉淀明显。
实施例7叶酸偶联量的测定
本实验采用核磁共振氢谱定量测定法对叶酸的偶联量进行测定。叶酸标准曲线绘制：精密称取叶酸适量，溶于氘代dmso,分别配成浓度为1、2、4、6、8mg/ml的fa溶液,于13000rpm离心5min后,取不少于0.5ml的上清液装入5mm核磁管中，进行1hnmr检测。所得图谱基线及相位调整好后，对tms内标峰以及叶酸特征峰(2.0～2.1ppm之间的一个多重峰)进行积分，记录叶酸特征峰面积与内标峰面积之比a,以叶酸浓度c为横坐标，峰面积之比a为纵坐标作图。所得标准曲线方程为a＝0.5317c+0.149,r2＝0.9989.
样品测定：取实施例1同批次制备的三份叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的冻干粉样品(已除杂)，加入1ml氘代dmso使之溶解，于13000rpm离心5min,取上清液装入5mm核磁管中，进行1hnmr检测。按上述方法积分，记录叶酸特征峰面积与内标峰面积之比a，根据fa标准曲线方程，计算得叶酸偶联量为62.46±1.98μg叶酸/mg牛血清白蛋白。
实施例8叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒在大鼠体内的药代动力学研究
8.1动物实验
选取健康雌性sd大鼠10只，平均分为两组，分别以7.5mg/kg剂量单次口服给与叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒和索拉菲尼混悬液。灌胃后于时间点0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、24、34、48、58、72h分别眼底取血0.5ml置于离心管中，静置半小时后，13000rpm离心5min，取出上清血浆于-20℃备用。
8.2血样处理
取出冻存备用的血浆样品，自然温度下解冻后，取200μl血于离心管内，加入100μl内标，1.0ml80％甲醇，超声提取，13000rpm离心5min，取出上清1ml蒸干后，用150μl80％甲醇超声复溶，13000rpm再次离心5min，取上清进样。采用agilent1260hplc测定各时间点索拉菲尼含量。
8.3对比
口服叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的血药浓度均高于口服混悬液的浓度。二者药时曲线如图3所示。采用das2.0计算各药代动力学参数。索拉菲尼混悬液的生物利用度为21.54mg/l*h，索拉菲尼白蛋白纳米粒的生物利用度为124.85mg/l*h。结果说明，相对索拉菲尼混悬液，叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒能大大提高索拉菲尼在体内的血药浓度和生物利用度。
实施例9叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的大鼠肝靶向研究
选取健康雌性sd大鼠30只，平均分为两组，分别以7.5mg/kg剂量单次口服给与叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒和索拉菲尼混悬液。灌胃后于时间点2、6、8、10、24、58h每组分别处死3只大鼠，取血清、肝脏于-20℃备用。采用agilent1260hplc测定各时间点血浆、肝组织中的索拉菲尼含量。
用选择性指数(dsi)和药物靶向指数(dti)评价制剂的靶向性。计算公式如下：
dsi＝t时刻靶器官的药物量/t时刻血液非靶器官的药物量
dti＝给于靶向制剂后t时刻靶器官的药物量/给于非靶向制剂后t时刻靶器官的药物量
将高效液相测得的给予索拉菲尼白蛋白纳米粒和索拉菲尼混悬液后各时间点的肝组织中和血中索拉菲尼药物含量代入以上公式，计算得在单次口服叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒2、6、10、24、58h后，sd大鼠体内的选择性指数(dsi)分别为6.66、6.91、8.56、6.03、6.47，而单次口服同剂量索拉菲尼混悬剂2、6、10、24、58h后，sd大鼠体内的选择性指数(dsi)分别为2.4、3.97、1.39、1.5、1.73，在同一时间点纳米粒组的dsi均大于混悬剂组，这就表明，该纳米粒对大鼠肝脏有着良好的选择性。在口服给与叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒和索拉菲尼混悬液2、6、10、24、58h后，dsi值分别为31.93、51.11、8.80、9.34、19.89，这表明叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒对于肝组织的靶向性良好，且叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的肝靶向性远大于混悬剂。总之，靶向制剂体内分布特征的各指标均表明该叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒能大大提高药物生物利用度，同时还有着良好的肝靶向性。
实施例10叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒的裸鼠肿瘤靶向性研究
从南昌大学动科部获得四周龄雄性无胸腺裸鼠并适应环境一周。每只裸鼠右后肢皮下注射0.1ml(1×107)对数生长期的肝癌细胞smmc-7721，正常饲养并观察肿瘤大小。当肿瘤长至1cm3左右后，将裸鼠随机分成三组，每组五只，分别单剂量腹腔注射给予索拉菲尼溶液剂、索拉菲尼白蛋白纳米粒、叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒，一小时后处死裸鼠，收集血液、肝脏及肿瘤组织。样品处理后用hplc法测定药物浓度。为了更直观的表征索拉菲尼制剂的靶向性，本实验对给予不同索拉菲尼制剂后裸鼠肝脏或肿瘤样品中药物浓度与血液样品中药物浓度的比值(c肝药/c血药或c瘤药/c血药)进行分析，单次腹腔给予叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒后的c肝药/c血药(2.120±0.082)明显大于给予索拉菲尼溶液剂(1.900±0.104)或索拉菲尼白蛋白纳米粒后的c肝药/c血药(1.916±0.142)，且叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒组与索拉菲尼溶液剂组之间有显著的统计学差异。这表明叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒对老鼠肝脏具有靶向性。单次腹腔给予索拉菲尼溶液剂、索拉菲尼白蛋白纳米粒以及叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒后，叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒组(0.666±0.053)的c瘤药/c血药大于索拉菲尼溶液剂组(0.410±0.038)和索拉菲尼白蛋白纳米粒组(0.560±0.083)的c瘤药/c血药，且索拉菲尼溶液剂组和叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒组之间有显著性差异。这表明索拉菲尼白蛋白纳米粒对肿瘤组织具有一定的靶向性，而叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒对肿瘤组织具有明显的靶向作用。
总之，以上结果显示叶酸修饰负载索拉菲尼白蛋白纳米粒不仅对老鼠肝脏具有靶向性，而且对肿瘤组织也具有明显的靶向性，能够显著增加肿瘤组织当中的药物浓度。